Transection الحبل الشوكي في اليرقات الزرد

الهدف العام من هذا الإجراء هو ضمان القطع الكامل للنخاع الشوكي في يرقات سمك الزيبرا من خلال طريقة ذات إنتاجية عالية نسبيًا وقابلة للتكرار مع تحقيق أقصى قدر من البقاء على قيد الحياة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تزويج البالغين من النمط الجيني المناسب والفحص عند الضرورة. وتتمثل الخطوة الثانية في تربية الأجنة حتى خمسة أيام بعد الإخصاب.

بعد ذلك، يتم إجراء القطع العرضي باستخدام ماصة حقن مجهرية مشطوفة. وأخيراً، تُترك الأسماك المصابة للتعافي في أوساط معالجة بالمضادات الحيوية حتى نهاية التجربة. وفي النهاية، يُستخدم المجهر الفلوري المناعي لإظهار استجابة الخلايا السليفة العصبية للإصابة.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تلك التي ابتكرتها مختبرات Becker وfetcher، في إمكانية دراسة عدد أكبر من الحيوانات، وتقليل وقت التعافي، واستخدام أدوات جينية غير متوفرة بخلاف ذلك في أسماك الزيبرا البالغة. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة محورية في مجال التجديد، مثل استجابة السلائف العصبية للإصابة. ابدأ التحضيرات بتجهيز ألواح الجراحة باستخدام أطباق بتري بقطر 60 millimeter ومجموعة cell guard 180 4 من الإيلاستومر السيليكوني.

اتبع تعليمات الشركة المصنعة. املأ الأطباق بحيث لا يتجاوز مستوى الملء النصف، واتركها حتى تتبلمر. ثم قم بتخزين الأطباق مغطاة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، يتم تصنيع الماصات الدقيقة عن طريق تسخين وسحب أنابيب شعرية من بوروسيليكات رقيقة الجدران في جهاز سحب الماصات الدقيقة، باستخدام نفس الإعدادات المستخدمة لصنع إبر الحقن المجهري تحت مجهر تشريحي. استخدم ملقطاً لكسر طرف الماصة الدقيقة حتى يصل قطرها إلى 200 microns تقريباً. ثم قم ببرد الحافة المكسورة باستخدام مطحنة دقيقة بزاوية 35 درجة في البداية، تليها عملية برد ثانية بزاوية 25 درجة عند توقف صوت الطحن.

افحص الطرف تحت مجهر تشريحي للتأكد من أنه حاد وأملس. إذ يؤدي استخدام طرف عريض جداً عادةً إلى زيادة معدلات الوفيات نظراً لارتفاع احتمالية جرح الأبهر الظهري. وفي حين أن الطرف الضيق جداً يميل إلى الانزلاق عن الجلد بدلاً من قطع الأنسجة، قم بتخزين الماصات الدقيقة ذات الشطبة الصحيحة في طبق بتري فوق كمية صغيرة من الصلصال قبل سبعة أيام من الجراحة.

قم بإعداد أحواض تزاوج لأسماك spr. الذكور والإناث. اجمع الأجنة المخصبة في صباح اليوم التالي، بعد ثلاث ساعات من إضاءة الأنوار، لضمان الحصول على أقصى إنتاجية.

في حال استخدام سلالة مراسلة معدلة وراثياً ذات أنماط جينية مختلطة، يتم وضع 100 جنين في كل طبق، ثم تُحضن الأطباق عند درجة حرارة 28.5 °C. وفي حال استخدام سلالة مراسلة، يتم فحص الأجنة للتأكد من التعبير الفلوري بعد 48 ساعة من الإخصاب.

اترك الأجنة الفلورية لتنضج عند 28.5 درجة مئوية حتى تصل اليرقات إلى اليوم الخامس بعد الإخصاب. قم بتجهيز لوحة الجراحة عن طريق تغطية واقي الخلايا بـ E2 و 10 mg/L من كبريتات الجنتاميسين و tricaine. بالإضافة إلى ذلك، جهز طبق الاستعادة عن طريق إضافة 25 mL من E2 وكبريتات الجنتاميسين إلى طبق بتري مقاس 100 mm.

تتمثل الخطوة التالية في تحضير مقبض للمشرط عن طريق ربط ثلاث مسحات معاً باستخدام شريط لاصق، مما يشكل أداة مثلثية ذات ثلاثة أخاديد. بعد ذلك، يتم تثبيت الماصة الدقيقة (micro pipette) المحضرة على المسحات عن طريق لصقها في أحد الأخاديد لإكمال المشرط، ثم توضع الماصة الدقيقة جانباً حتى وقت الحاجة إليها.

ابدأ الجراحة بتخدير طبق واحد يحتوي على 25 يرقة في المرة الواحدة. وباستخدام trica، يتم تخدير الأسماك بشكل كافٍ عندما تتوقف عن إظهار استجابة للمس. انقل اليرقات إلى طبق جراحة وضع الطبق تحت مجهر تشريحي.

تحت أقصى قوة تكبير، قم بتدوير إحدى اليرقات بحيث تستلقي على جانبها ويكون ظهرها هو الجزء الأقرب إلى اليد التي تمسك بالمشرط. ضع الملقط بحيث يستند إلى واقي الخلية. قم بإمالة المشرط الزجاجي فوق عرض اليرقة، مع إسناده إلى أحد ذراعي الملقط.

قم بإجراء شق في الوجه الجانبي الظهري لليرقات عند مستوى المسام الشرجية، مع الحرص على عدم القطع بما يتجاوز الحافة البطنية للحبل العصبي، ثم قم بتدوير المشرط لقطع الحبل الشوكي.

عادةً ما تكون اللفة المطلوبة أقل بكثير من 90 درجة. كرر عملية قطع النخاع الشوكي مع اليرقات المتبقية. وبمجرد اكتمال الجراحة لمجموعة اليرقات، استخدم ماصة خلفية ومضخة ماصة لنقل الحيوانات المصابة إلى لوحة التعافي.

للتخلص من تأثير التخدير، تأكد من الإمساك برأس اليرقة أو ذيلها أولاً أثناء عملية النقل. تجنب الضغط على موقع الإصابة عن طريق ثني اليرقات بعد زوال مفعول التخدير. انقُل اليرقات المصابة من طبق التعافي إلى أطباق قطرها 100 millimeter مملوءة بـ 25 milliliters من E two وكبريتات الجنتاميسين بكثافة 25 يرقة لكل طبق.

بعد ذلك، ضعها في حاضنة عند درجة حرارة 28.5 درجة Celsius حتى يلتئم الجرح. افحص الأطباق يومياً، مع إزالة أي حيوانات مريضة أو ميتة.

لا تقم بتغيير الوسط الغذائي حتى تصبح أكواخ الأوليات في المياه العذبة مرئية في الوسط. عند تغيير الوسط الغذائي، لا تنقل الأسماك إلى طبق جديد، بل قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسط واملأ الطبق نفسه بوسط غذائي جديد.

كرر عملية تغيير الوسط حسب الضرورة لتقليل تعداد الـ coops. قم بتغذية اليرقات يومياً بكمية صغيرة من غذاء صغار الأسماك المسحوق. تظهر هنا سمكة zebra fish بعد مرور يوم واحد من القطع الكامل للنخاع الشوكي.

بعد الإصابة، يتم التعبير عن GFP في جميع العصبونات، ويحدد السهم الأصفر موقع الإصابة. تظهر هنا سمكة زيبرا ذات حبل شوكي مقطوع تمامًا بعد ثلاثة أيام من الإصابة. تظهر سمكة الزيبرا المثبتة والموسومة بـ UCD هنا حبلاً شوكيًا مقطوعًا تمامًا.

يشير السهم الأصفر مرة أخرى إلى موقع الإصابة. وفي المقابل، فإن المنطقة المتصلة من وسم العصبونات على طول الحافة البطنية للنخاع الشوكي في سمكة الزيبرا المثبتة بعد ثلاثة أيام من الإصابة تشير إلى قطع غير مكتمل.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن معالجة 300 يرقة في الساعة.