الساخنة البيولوجية الحفز: متساوي الكالوري المعايرة لوصف التفاعلات الإنزيمية

تصف التجربة التالية طريقة موثوقة وسريعة وخالية من الملصقات تستخدم كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة لتحديد الديناميكا الحرارية وحركية التفاعلات الأنزيمية في المحلول كميا باستخدام الحرارة المنبعثة والممتصة بمرور الوقت كمسبار داخلي. يتم تحقيق ذلك من خلال السماح بحدوث التفاعل الأنزيمي في خلية عينة الجهاز عند درجة حرارة ثابتة ومراقبة انحراف تتبع الحرارة عن خط الأساس الأولي. في تجربة أولى تسمى الطريقة الأولى أو M1 ، يتم حقن الركيزة في محلول الإنزيم ويتم قياس الحرارة لتحويل الركيزة بالكامل مما يسمح بتحديد المحتوى الحراري المولي الكلي للتفاعل.

في تجربة ثانية تسمى الطريقة الثانية أو M الثانية ، يتم إجراء حقن متعددة للركيزة ، مما يسمح بقياس معدل إنتاج الحرارة بمرور الوقت بتركيزات ركيزة مختلفة. مكنت النتائج المستمدة من تجربتي قياس السعرات الحرارية من تحديد المعلمات الحركية ، kcat و km ، بافتراض التحفيز الأنزيمي meis menton. الميزة الرئيسية لاستخدام كالوريمتر الاستنزاف متساوي الحرارة على الطرق الأخرى مثل المقايسات الضوئية البتروية التي تراقب تكوين المنتج بمرور الوقت هي أن مركز التجارة الدولية لا يتطلب أي تعديل ووضع علامات على النظام قيد التحليل ويحتاج إلى كمية قليلة جدا من المواد لأنه يستخدم الحرارة الجوهرية للتفاعل كمسبار داخلي يوضح أن الإجراء سيكون لوساي.

يقوم طالب دكتوراه من مختبرنا أولا بتخفيف محلول مركز من الإنزيم بملليلترين من المخزن المؤقت لإعطاء تركيز إنزيم نهائي في نطاق المولار النانوي لتجربة M1. ثم أضف 0.5 مل من المخزن المؤقت إلى محلول مركز للركيزة لإعطاء تركيز ركيزة لا يقل عن ثلاثة أوامر من حيث الحجم أعلى من تركيز الإنزيم وفوق الكيلومتر. بالنسبة لتجربة M two ، قم بإعداد محلول إنزيم ملليلتر بتركيز نهائي في نطاق picaMolar إلى nanomolar.

خفف الركيزة ب 0.5 مل من المخزن المؤقت لإعطاء تركيز ركيزة في نطاق المليمولار. بعد التحقق من تنظيف خلية العينة وحقنة الحقن وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، املأ حقنة التحميل بالماء المقطر. ثم أدخل الإبرة برفق في خلية العينة ، واملأ الخلية وأزل السائل بالطريقة الموضحة سابقا ، واغسل خلية العينة مرتين بالماء المقطر ومرتين بالعازلة.

بحقن محلول الإنزيم ببطء في الخلية حتى ينسكب الجزء العلوي من جذع الخلية. لإزالة فقاعات الهواء المحبوسة في خلية العينة ، أنتج طفرة تبلغ حوالي 0.25 مل من المحلول في الخلية. بعد إنتاج الطفرة مرتين أخريين.

ضع إبرة حقنة التحميل على الحافة بين جذع الخلية ومنفذ الخلية ، وقم بإزالة أي محلول زائد. ابدأ برنامج عارض VP وقم بموازنة أداة ITC إلى درجة حرارة أقل بثلاث درجات مئوية من درجة الحرارة التجريبية المطلوبة. بعد ملء الخلية المرجعية بالماء المقطر بنفس الطريقة السابقة ، قم بربط حقنة بلاستيكية بمنفذ تعبئة حقنة الحقن باستخدام أنبوب سيليكون رفيع ، ضع طرف حقنة الحقن في الماء واملأ المحقنة حتى يخرج الماء من منفذ التعبئة العلوي مما يشير إلى أن حقنة الحقن ممتلئة.

ثم قم بإزالة طرف المحقنة من الماء واسحب الهواء لتفريغ حقنة الحقن. باستخدام نفس الإجراء ، اغسل حقنة الحقن بمحلول عازل واسحب الهواء عبر النظام. بعد ذلك ، قم بربط محلول الركيزة في أنبوب نظيف وضيق.

ضعه تحت المحقنة وأدخل إبرة حقنة الحقن فيه تماما. املأ حقنة الحقن ، واترك كمية صغيرة من المحلول في الجزء السفلي من الأنبوب من واجهة الكمبيوتر. اضغط على إغلاق منفذ التعبئة.

بمجرد إزالة أنبوب تحميل السيليكون ، اضغط على التطهير وإعادة التعبئة لإخراج أي فقاعات هواء من حقنة الحقن وطردها مرة أخرى إلى المحلول السائب. بعد ذلك ، امسح جوانب حقنة الحقن بمنشفة ورقية لإزالة أي محلول متبقي ووضعه في خلية العينة. في تجربة M1 ، قم بتعيين إضافتين على الأقل من خمسة إلى 30 ميكرولتر من الركيزة للتحقق من قابلية التكاثر.

ثم اضبط وقت التباعد بين كل حقنة كبيرة بما يكفي لضمان عودة إشارة الحرارة إلى خط الأساس قبل الإضافة التالية. في تجربة M two ، قم بتعيين حقن متعددة من خمسة إلى 10 ميكرولترات. اضبط الفاصل الزمني بين الحقن ، مما يسمح للنظام بتثبيت الطاقة الحرارية إلى خط الأساس الجديد بعد كل حقن.

في هذه المرحلة ، اضبط القوة المرجعية على 20. ثم حدد تركيزات الإنزيم والركيزة التجريبية واختر اسما للتجربة. اضبط درجة الحرارة على 25 درجة مئوية وابدأ التجربة.

بمجرد الانتهاء من التجربة ، قم بتنظيف خلية العينة والحقنة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد فتح برنامج origin 7.0 ، انقر فوق الزر "فتح" وحدد الملف المقابل للحقن الأول في تتبع الحرارة لتجربة M1. لتحديد دلتا H للتفاعل ، قم بدمج الذروة الأولى الناتجة عن انحراف خط الأساس في مخطط الحرارة للحقنة الفردية.

تجربة M1. ثم اقسم قيمة المساحة التي تم الحصول عليها المقابلة لإجمالي حرارة التفاعل المعبر عنها بالسعرات الحرارية الدقيقة على الركيزة النهائية ، والتركيز في خلية العينة معبرا عنه بالميكرومولار وحجم خلية العينة معبرا عنه باللتر. كرر نفس الإجراء للذروة الثانية من تجربة M1 ومتوسط القيم التي تم الحصول عليها لقياسي دلتا H بعد ذلك تحديد DQ على DT من تجربة M two عن طريق قياس الفرق بين خط الأساس الأصلي وخط الأساس الجديد بعد كل حقنة.

يمكن القيام بذلك عن طريق تحويل البيانات التجريبية إلى معدلات تفاعل وفقا للمعادلة التالية. باستخدام قيمة المحتوى الحراري التي تم الحصول عليها في تجربة M1. ثم قم بملاءمة البيانات مع معادلة michalis menon على وجه الخصوص من برنامج التحليل.

انقر فوق زر قراءة البيانات وانتقل إلى المجلد حيث توجد تجربة M two. ثم انقر فوق سهم التمرير لأسفل للملفات من النوع واختر مقايسة الإنزيم. بعد ذلك ، انقر فوق الملف وافتحه.

قم بعمل ITC لتجربة M two. بعد فتح مربع حوار مقايسة الإنزيم ، حدد الطريقة الثانية الركيزة فقط من النافذة الموجودة في نافذة دلتا H تشير إلى قيمة دلتا H التي تم الحصول عليها في تجربة M1. بعد ذلك ، انقر فوق الزر صفر y المحور وانقر نقرا مزدوجا قبل نقطة الحقن الأولى مباشرة.

انقر فوق الزر "حساب المعدل لرسم المعدل مقابل تركيز الركيزة". أخيرا ، استخدم وظيفة الملاءمة للنموذج لتناسب المنحنى وللحصول على الثبات الحركي. تم اختيار النشاط اللايتي للكانافال و CMIS أو JAK URIs كتفاعل تمثيلي لإثبات قابلية تطبيق ITC في التحديد الكمي للتحفيز الأنزيمي.

تم قياس قيمة دلتا H البالغة سالب 10.5 كيلو سعرة حرارية لكل مول في تجربة M1 من خلال دمج الطاقة الحرارية الناشئة عن حقن ركيزة اليوريا في محلول اليورياز والسماح للتفاعل بالمضي قدما حتى الانتهاء. تم تحويل الطاقة الحرارية المسجلة في تجربة M two إلى معدل التفاعل باستخدام المعادلة التالية. قدمت ملاءمة البيانات التي تم الحصول عليها مع معادلة McKayla Cementin المعلمات الحركية ليورياز حبوب JAK في أكوام 20 ملليمول.

الأس الهيدروجيني سبعة مثل kcat يساوي 30 ، 200 في الثانية ، و KM يساوي 3.45 مللي مولار بالاتفاق مع البيانات المبلغ عنها سابقا. يمثل إجمالي التغير الحراري المقاس في تجربة M1 مجموع جميع الأحداث التي تحدث أثناء التفاعل قيد التحليل ، ويعتمد على المحتوى الحراري المولي لجميع العمليات المعنية ، وليس فقط على الركيزة إلى تحويل المنتج. في عملية عامة يكتسب فيها النظام المتفاعل البروتونات في محلول مخزن ، يطلق المخزن المؤقت البروتونات التي تنتج حرارة إضافية داخل خلية التفاعل.

لذلك ، فإن دلتا H المقاسة واضحة وتتضمن دلتا H الجوهرية للتفاعل ، بالإضافة إلى المحتوى الحراري للتأين للمخزن المؤقت وعدد البروتونات المتبادلة وفقا للمعادلة المميزة. باستخدام هذه المعادلة في تجارب M1 ، يمكن تحديد عدد البروتونات المتبادلة والدلتا H الجوهرية عن طريق إجراء نفس التجربة في المخازن المؤقتة ذات المحتوى الحراري للتأين المختلف. ينتج عن تفاعل التحلل المائي لليوريا الكلي اكتساب بروتون من المخزن المؤقت.

وفقا لذلك ، كما هو موضح أعلاه ، تتضمن حرارة التفاعل مساهمة البروتون العازلة د. من أجل حساب عمر دلتا الجوهري لتفاعل التحلل المائي ، تم إجراء ثلاث تجارب M1 في مخازن مختلفة ، تتميز بثلاث محتوى حراري مختلف معروف للتأين. يمكن حساب المحتوى الحراري الجوهري وعدد البروتونات المنبعثة من المخزن المؤقت من التقاطع وميل الملاءمة الخطية للبيانات التجريبية.

كانت سالبة 14.7 كيلو سعرة حرارية لكل مول و 0.98 على التوالي في اتفاق تام مع البيانات التي تم الإبلاغ عنها سابقا. تمتد تطبيقات هذا الإجراء من البحث الأساسي إلى البحث التطبيقي وفحص الأدوية ، بمجرد تحديد حركية التفاعل الأنزيمي. يمكن تكرار التجربة في وجود أنواع وتركيزات مختلفة من مثبطات الإنزيم من أجل مراقبة التثبيط والثوابت.