الدهون طبقة ثنائية الحويصلة انشاء طريق ميكروفلويديك النفث
فبراير 21, 2014
النفث ميكروفلويديك ضد واجهة قطرات الدهون طبقة ثنائية يوفر وسيلة موثوقة لتوليد الحويصلات مع السيطرة على التماثل الغشاء، إدراج البروتينات عبر الغشاء، والتغليف من المواد. هذه التقنية يمكن تطبيقها على دراسة مجموعة متنوعة من النظم البيولوجية حيث يتم المطلوب الجزيئات الحيوية مجزأة.
الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد حويصلات ثنائية الطبقة الفوسفوليبيد مع زيادة التحكم في الغشاء ، والانلا ، والمولية ، والتشتت الأحادي ، والمحتويات الداخلية. باستخدام cad ، يتم تصنيع الغرفة من صفائح الأكريليك والمطاط الطبيعي. يتم إنتاج طبقة ثنائية دهنية معلقة عن طريق تحميل الغرفة بالدهون والمحلول.
بعد ذلك ، يتم إعداد نفث الحبر الذي يحتوي على المحلول المراد تغليفه مع جهاز النفث. بمجرد تحديد الإعدادات المناسبة ، ستنتج نبضات السوائل النفاثة حويصلات ثنائية الطبقة دهنية. في النهاية ، ينتج عن النفث الموائع الدقيقة حويصلات ثنائية الطبقة أحادية مشتتة قابلة للتكرار.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التكوين الكهربائي أو المستحلب أو توليد القطرات ، هي زيادة مستوى التحكم في الغشاء ، والمولية أحادية الجانب ، والتشتت الأحادي ، والمحتويات الداخلية. وسيتم توضيح الإجراء جوانا هارو, طالبة دراسات عليا من مختبر ومساعدة كارا باتيل, طالب جامعي باستخدام برنامج CAD, رسم شكل للغرفة التي يمكن تصنيعها من الأكريليك باستخدام الحفر الأول قاطع الليزر, واحد 16 بوصة من خلال الثقوب على جانبي غرفة الأكريليك المجمعة. سوف يستنزف ذلك إلى شكل ما لا نهاية بشكل جيد.
ثانيا ، قم بقص مستطيل صغير بمقص من لوح أكريليك 0.2 ملم ليكون بمثابة الجزء السفلي من شكل اللانهاية. قم بتثبيته جيدا في مكانه باستخدام مادة لاصقة سريعة الجفاف ، مع التأكد من عدم الحصول على غراء في مناطق المشاهدة. يجب مسح لوح الأكريليك على جدار الغرفة وتثبيته في قاع الغرفة.
ثالثا ، استخدم مادة لاصقة سريعة الجفاف للصق قطعة رقيقة من لوح المطاط الطبيعي فوق الثقوب المحفورة. اضغط عليها في مكانها بالملاقط. اختبر جميع اللحامات الملصقة بحثا عن التسريبات.
لا ينبغي أن يكون هناك أي شيء. أخيرا ، باستخدام إبرة قياس 23 ، قم بعمل ثقوب في المطاط من خلال الثقوب المحفورة ، سيتم إدخال طرف نفث الحبر الكهروإجهادي من خلال هذه الثقوب. يجب إذابة الدهون الفوسفورية في الكلوروفورم وتخزينها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر.
D-P-H-P-C أو DOPC. تستخدم الدهون في هذا العرض التوضيحي. يتم نقل الدهون المذابة في الكلوروفورم إلى قارورة زجاجية أثناء إمساك القارورة بزاوية ، وتجفيف الدهون برفق تحت غاز الأرجون أو النيتروجين.
ثم ضع القارورة مع غطاءها فضفاضا قليلا تحت الفراغ لمدة ساعة إلى ساعتين لإزالة المذيب المتبقي. يمكن أيضا استخدام المجفف لهذه الخطوة. الآن قم بإذابة الدهون في نهاية التزيين للحصول على تركيز دهني نهائي يبلغ 25 ملليغرام لكل ملليلتر.
دوامة الحل. أغلق الغطاء لفترة وجيزة باستخدام البارام ثم صوتي لمدة 15 دقيقة. قم بتخزين هذا المحلول عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر.
بعد ذلك ، قم بإعداد محلول السكروز مع الأسمولية الفسيولوجية مثل الأسمولية. هذا هو حل النفث. ضع في اعتبارك إضافة قطرة من صبغة الطعام الداكنة أو حبات الفلورسنت إلى المحلول لمزيد من التباين أو الفلورة.
قم بتحميل محلول السكروز في حقنة سعة مليلتر واحد لإزالة الهواء المحبوس. قم بنقر المحقنة حتى ترتفع أي فقاعات إلى فتحة الإغراء ويمكن طردها. بعد ذلك ، قم بتوصيل مرشح 33 ملم 0.22 ميكرون بالمحقنة وادفع قطرة واحدة للخارج عبر الفلتر.
الآن قم بفك محول الإغراء الأنثوي لنفث الحبر واضغط عليه في نهاية الفلتر. ادفع بعض السوائل للخارج لإزالة أي هواء محاصر. أخيرا ، قم بتوصيل المحقنة بالجزء العلوي من سائل نفث الحبر.
يجب أن تنتقل إلى طرف نفث الحبر إذا تم توصيل المحقنة بشكل صحيح. أولا ، قم بتركيب مجموعة المحقنة على مرحلة المجهر وقم بتوصيل وحدة التحكم النافثة للحبر لهذه التجربة. تحتاج المسرح والحقنة إلى تحكم مستقل مع تحرك كل من المسرح والحقنة في ثلاثة أبعاد للتصور.
قم بإعداد كاميرا عالية السرعة قادرة على 1000 إطار في الثانية على الأقل. قم بتعيينه لاستخدام التشغيل التلقائي المستند إلى الصور لبدء التسجيلات. الآن ، قم بتأمين الغرفة على المسرح بشريط لاصق وقم بمحاذاة طرف نفث الحبر بعناية مع الفتحة المصنوعة في الصفيحة المطاطية على جانب الغرفة.
أولا ، اضبطها بالعين ثم قم بإجراء تعديلات دقيقة باستخدام المجهر. بمجرد محاذاة المحقنة ، قم بإعادة المحقنة على طول بعد واحد لتحميل شكل اللانهاية. حسنا ، ثم قم بالضغط برفق على المكبس ، بحيث تتشكل قطرة على الفوهة.
هذا يوفر بعض الضغط الخلفي الأولي. يجب ضبط معلمات النفث. يتم تقديم القيم المحددة التالية للموجة ثنائية القطب شبه المنحرفة على الجهد المطبق على الشاشة وعدد النبضات النفاثة لكل حجم حويصلة التحكم في الزناد.
الآن قم بتحميل الغرفة ب 25 إلى 30 ميكرولترا من محلول الدهون في نهاية العقد ، مما يغطي السطح الكامل على شكل ما لا نهاية. حسنا ، أضف 25 ميكرولترا من محلول الجلوكوز إلى الحافة الخارجية التي يتم ماصتها ببطء وسلاسة ، ويجب ألا يختلط الجلوكوز في محلول الدهون. في غضون 10 دقائق ، ستتشكل طبقة ثنائية دهنية في وسط الغرفة.
يعد إعداد الطبقة الثنائية الخطوة الأكثر أهمية لأن الطبقة الثنائية غير مستقرة ويمكن أن تنكسر حسب التحضير. اصطبر. سوف ينجح بمجرد التدرب على ملء الغرفة عدة مرات.
الآن ، أدخل طرف نفث الحبر بعناية مرة أخرى في الغرفة عندما يكون الطرف في حدود 200 ميكرون من واجهة القطرة. ثنائي الطبقة ، ابدأ عملية النفث وسجل البيانات باستخدام نفث الحبر الذي قدم نظرة ثاقبة لعملية إنشاء الحويصلة. على سبيل المثال ، أثر تغيير المسافة بين فوهة نفث الحبر والطبقة الدهنية الثنائية على القوة التي تشوه الغشاء. غلق.
ركز القرب من الطبقة الثنائية التيار النفاث ومنع الغشاء من تشتيت الطاقة بعيدا عن نقطة توليد الحويصلة. أيضا ، زاد انتقال الدوامة مع الجهد المطبق على المشغل الكهربائي بيزو. تم تصور تكوين الحويصلة كسلسلة من الأحداث بعد تكوينها.
يميل استقرار الحويصلة إلى الاختلاف باختلاف قطر الحويصلة ، حيث تكون الحويصلات الأصغر أكثر استقرارا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد حويصلات منتهكة للدهون باستخدام نفث الموائع الدقيقة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تناقش هذه المقالة طريقة لتوليد حويصلات ثنائية الطبقة من الفوسفوليبيد باستخدام النفث الدقيق مقابل واجهة قطرة ثنائية الطبقة من الدهون. تسمح هذه التقنية بالتحكم الدقيق في عدم تناظر الغشاء، وإدراج البروتين عبر الغشاء، وتغليف المواد.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الفيزياء الحيوية
- التكنولوجيا الحيوية
الخلفية
- تعد حويصلات ثنائية الطبقة من الفوسفوليبيد ضرورية لدراسة الجزيئات الحيوية المجزأة.
- تعزز التقنيات الدقيقة قابلية تكرار وتحكم تكوين الحويصلات.
- فهم خصائص الغشاء أمر بالغ الأهمية للعديد من التطبيقات البيولوجية.
- يمكن أن تبسط تقنية النفث عملية توليد الحويصلات.
هدف الدراسة
- لتوليد حويصلات ذات خصائص غشائية خاضعة للتحكم.
- لتسهل إدراج بروتينات معينة في الطبقة الثنائية.
- لتمكين تغليف مواد متنوعة لأغراض البحث.
الطرق المستخدمة
- تصنيع غرفة من ألواح الأكريليك والمطاط الطبيعي.
- إنتاج طبقة ثنائية معلقة عن طريق تحميل الغرفة بالدهون والمحلول.
- إعداد جهاز نفث الحبر لتغليف المحاليل.
- تحديد الإعدادات المناسبة لنبضات السائل المنفوث لإنشاء الحويصلات.
النتائج الرئيسية
- ينتج النفث الدقيق حويصلات ثنائية الطبقة متكررة، ومتجانسة النطاق.
- تسمح الطريقة بالتحكم الدقيق في خصائص الحويصلات.
- يتم تحقيق تغليف المواد بشكل فعال.
- يمكن تصميم الحويصلات لتناسب دراسات بيولوجية متنوعة.
الاستنتاجات
- يعتبر النفث الدقيق تقنية موثوقة لتوليد الحويصلات.
- يتم تعزيز التحكم في عدم تناظر الغشاء وإدراج البروتين.
- تتمتع هذه الطريقة بآثار مهمة لدراسة الجزيئات الحيوية المجزأة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Microfluidic jetting enables precise control over lipid bilayer vesicle generation, supporting reproducible production of giant unilamellar vesicles (GUVs) with defined membrane composition and encapsulation capacity. This capability addresses a key challenge in synthetic biology and drug delivery research by providing a tunable platform for modeling cellular systems and testing bioactive compounds. The method enhances predictive confidence in early-stage target validation by allowing systematic interrogation of membrane-dependent processes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through controlled membrane asymmetry and transmembrane protein incorporation.
- Operational Value: Supports functional target validation by generating reproducible vesicle systems for pathway clarification.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing quantitative readouts on lipid-protein interactions and encapsulation efficiency.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by producing mono-dispersed vesicles with tunable size and internal content.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through precise jetting parameters that control vesicle formation.
- Screening Readiness: Highlights platform scalability and reuse for reliable compound evaluation across multiple conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance through the use of physiological-like osmolarity solutions and fluorescent tracking for vesicle monitoring.
- Preclinical Alignment: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling encapsulation of therapeutic candidates for stability and release studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports decision-making by providing measurable outputs on vesicle stability and diameter-dependent performance.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing to lead identification, particularly in assays requiring controlled membrane environments and encapsulated compound delivery.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing by enabling systematic variation of lipid composition and transmembrane protein incorporation to clarify pathway dependencies.
- Screening: Describes assay readiness through the generation of mono-dispersed vesicles that ensure consistent compound exposure and reproducible readouts.
- Analytics: Highlights quantitative measurements such as vesicle size, formation rate, and encapsulation efficiency that help teams compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by enabling encapsulation of drugs or biomolecules for stability testing and release profiling.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, adaptable across multiple projects requiring synthetic vesicle platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in membrane-related mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of vesicle production for high-throughput applications.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early de-risking of delivery mechanisms.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on vesicle performance data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, lipid handling, and microscopy for chamber assembly and bilayer formation.
- Depends on instrumentation including piezo-actuated inkjet devices, high-speed cameras, and vacuum drying systems.
- Necessitates cross-team standardization of lipid solutions, jetting parameters, and chamber alignment procedures.
- Involves adaptation considerations for different lipid types, transmembrane proteins, and encapsulation agents across model systems.
- Includes practical limitations such as bilayer instability during setup and sensitivity to environmental vibrations during jetting.
