طريقتين لإنشاء أولي خلايا وانسجة بطانة الرحم الإنسان من استئصال الرحم العينات

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء مزارع الخلايا اللحمية الأولية لبطانة الرحم من استئصال الرحم. يتم تحقيق ذلك عن طريق تمييز طبقات الرحم وفصلها أولا لعزل جزء من أنسجة بطانة الرحم. الخطوة الثانية هي اختيار تقنية عزل الخلايا بين طرق الكشط والتجربة عند استخدام طريقة الكشط.

تستخدم القوة الميكانيكية والكشط لفصل وفصل الخلايا اللحمية بطانة الرحم. بدلا من ذلك ، عند استخدام طريقة التربسين ، يتم استخدام النشاط الأنزيمي للتربسين لفصل وفصل الخلايا اللحمية بطانة الرحم. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري لمراقبة نمو الخلايا ومورفولوجيا ، بينما تستخدم التقنيات الأخرى التي تمت مناقشتها في المخطوطة للتحقق من مزارع لحمة بطانة الرحم.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة علم وظائف الأعضاء الرئيسية في ظواهر المجال الإنجابي مثل الدورة الإنجابية واستئصال الرحم الحيضي ، وقد تم جمع عينات المستخدمة في هذه المخطوطة بالتوافق مع بروتوكول أخلاقيات معتمد من IRB بالجامعة ، مرقمة I-R-B-H-S-R رقم 1 4 4 2 4. الحفاظ على الأنسجة المشتقة من المريض في أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على RPMI أو DMEM مع ارتفاع الجلوكوز عند أربع درجات مئوية لمدة لا تزيد عن 24 ساعة قبل معالجة العينة. عندما تكون جاهزا للبدء ، اغسل عينة المناديل ثلاث مرات باستخدام XPBS واحد وتخلص من المحلول بين كل غسلة.

ثم أضف أربعة إلى 10 ملليلتر من وسائط النمو المكملة ب 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين إلى عينة الأنسجة. أضف أيضا منطقة فطر إلى التركيز النهائي البالغ 0.25 ميكروغرام لكل مليلتر واحتضنه لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، تخلص من وسائط النمو واغسل المنديل مرتين باستخدام XPBS واحد.

ضع الأنسجة على صفيحة زراعة الخلايا التي يبلغ طولها ستة سنتيمترات وحدد طبقة بطانة الرحم باستخدام هذه الصور كدليل. ثم افصل بطانة الرحم واحفظ طبقات الأنسجة الأخرى لاستخدامها في المستقبل. استخدم مشرطا أو شفرة حلاقة لتحويل الأنسجة إلى قطع صغيرة أثناء خدشها على طبق زراعة الخلايا.

تسهل الخدوش ربط الخلايا اللحمية الأولية الناشئة في بطانة الرحم. بعد ذلك ، أضف ملليلترين من وسائط النمو برفق إلى الطبق المخدوش. في هذه المرحلة ، ستكون شظايا الأنسجة مرئية وثابتة من حركة الخدش.

ضع الطبق في حاضنة مخصصة لزراعة الخلايا منفصلة عن خطوط الخلايا الأخرى لتجنب التلوث. راقب الخلايا يوميا باستخدام المجهر الضوئي. ابحث عن مجموعات صغيرة من الخلايا التي تخرج من الأنسجة المقطعة في اليوم الثاني أو الثالث كل ثلاثة أيام.

قم بإزالة مزارع غسيل الوسائط القديمة برفق باستخدام XPBS واحد ثم أضف ملليلترين من وسائط النمو الطازجة. ابدأ في إضافة أربعة ملليلتر من وسائط النمو. بمجرد زيادة معدل التكاثر أثناء خطوات الغسيل ، قم بشفط القطع المتبقية من الأنسجة.

من غير المرجح أن تخرج مستعمرات جديدة من الأنسجة. بعد أسبوع واحد من مرور النمو ، تستخدم الخلايا 0.05٪ التربسين. عندما تصل الخلايا إلى ما بين 75 و 80٪ من الطلاقة المشتركة ، قم بتجميد لوحة واحدة من الخلايا.

بمجرد الحفاظ على صفيحتين أو ثلاث لوحات ، لا يمكن تمرير الخلايا الأولية إلى أجل غير مسمى. لبدء العزلة بوساطة تريبسين ، ضع قطعة صغيرة من أنسجة بطانة الرحم في أنبوب مخروطي الشكل مع ملليلترين من 0.25٪ التربسين مع 0.03 ملليغرام لكل مليلتر. يمكن بعد ذلك احتضان المايسين الأنسجة على منصة دوارة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بتدوير الأنسجة لفترة وجيزة ثم جهاز الطرد المركزي عند 200 إلى 400 مرة G لمدة دقيقتين ، وتخلص من المادة الطافية وأضف التربسين الطازج. ويمكن أن يحتضن المايسين بعد ذلك الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة أثناء الدوران. بعد الحضانة ، قم بتدوير الأنسجة لمدة خمس إلى 10 ثوان.

ثم أضف ملليلترين من وسائط النمو التي تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين. لإلغاء تنشيط التربسين ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 200 إلى 400 مرة G لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. ثم تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية.

في ملليلترين من لوحة وسائط النمو ، يتم تعليق الخلية على طبق ثقافة خلية يبلغ طوله ستة سنتيمترات وكشط اللوحة لتعزيز ارتباط الخلايا الأولية. راقب نمو الخلايا يوميا باستخدام مجهر ضوئي وقم بتغيير وسائط النمو كل يومين إلى ثلاثة أيام. بمجرد أن تصل الخلايا إلى طلاقة مشتركة من 75 إلى 80٪ ، استخدم 0.05٪ أو 0.25٪ تريبسين لتمريرها لعزل الخلايا اللحمية بطانة الرحم.

يؤدي استخدام طريقة الكشط إلى إنشاء مجموعات من الخلايا الناشئة المبكرة. على طول الخدوش التي يسببها المشرط ، يمكن التعرف على الخلايا اللحمية بطانة الرحم من خلال مورفولوجيا الخلايا الليفية. تتمتع طريقة التربسين بوقت تحضير أطول من طريقة الكشط ، ولكن يتم ملاحظة الخلايا القابلة للحياة في وقت سابق.

طريقة tryin أيضا خلايا ذات أنماط نمو متجمعة ومشتتة. لم يتم بعد اكتشاف علامة خاصة بالأنسجة لخلايا لحمة بطانة الرحم. تتمثل إحدى طرق تحديد الخلايا اللحمية بطانة الرحم في قياس فقدان العلامة.

للخلايا الظهارية مثل السيتوكيراتين. يدل نقص السيتوكيراتين على عدم وجود خلايا ظهارية بطانة الرحم. يؤكد فقدان تلطيخ السيتوكيراتين الذي لوحظ في المقطع الخامس مقارنة بالممر الثاني ، عدم وجود خلايا ظهارية.

يمكن توفير أدلة وظيفية على وجود الخلايا اللحمية بطانة الرحم باستخدام مقايسة إزالة الخلايا. تشير الزيادة في البرولاكتين والبروتين المرتبط بعامل النمو الشبيه بالأنسولين استجابة للعلاج باستخدام CAMP وخلات هيدروكسي البروجسترون إلى نجاح إنشاء مزرعة لحمة بطانة الرحم. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء مزارع الخلايا اللحمية الأولية لبطانة الرحم من استئصال الرحم المقطوعة.