توصيف G مستقبلات البروتين يقترن بها الكالسيوم تعبئة الفحص القائم على الإسفار

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد الروابط التي تنشط وظيفيا للمستقبلات المقترنة ببروتين G اليتيمة أو G PCRs. يتم تحقيق ذلك عن طريق التحويل العابر ، A-G-P-C-R ذي الأهمية وتقطيع بناء G alpha 16 المختلط في نظام التعبير الخلوي للحصول على تعبير غير متجانس مؤقت لكلا البروتينين. كخطوة ثانية ، يتم تحميل الخلايا المنقولة بصبغة الأنفلونزا الحساسة للكالسيوم أوه أربعة ، والتي تكتشف إطلاق الكالسيوم من المخازن داخل الخلايا من خلال زيادة إشارة الفلورسنت عند تفاعل الكالسيوم.

بعد ذلك ، يتم إجراء مقايسة تعبئة الكالسيوم القائمة على الفلورسنت عن طريق تحدي المستقبل المعبر عنه غير المتجانس بمكتبة مركبة من الروابط المرشحة لتحديد المركبات التي تنشط المستقبل وتثير سلسلة إشارات داخل الخلايا تؤدي إلى إطلاق الكالسيوم من الشبكة الإندوبلازمية ، والتي يمكن قياسها كإشارة فلورية. تم الحصول على النتائج التي تظهر منحنى استجابة التركيز مع نصف الحد الأقصى للتركيز الفعال للرابط المنشط ، والذي يعتمد على الكشف عن إشارات الفلورسنت المختلفة اعتمادا على تركيزات الترابط المعطاة لنظام التعبير الخلوي. الميزة الرئيسية لإجراء التحويل العابر للحصول على تعبير مؤقت عن GPCR الخاص بك على استخدام خطوط الخلايا النسيلة المستقرة هي أنه لا يتطلب إنشاء مثل هذه الخطوط الخلوية المستقرة التي تستغرق وقتا طويلا.

يمكن أن يؤدي تعداء الوحدة الفرعية G alpha 16 المختلطة إلى إعادة توجيه مسار الإشارات داخل الخلايا لمعظم GPCRs نحو إطلاق الكالسيوم بغض النظر عن مسار الإشارات الأصلي في البيئات الذاتية. على هذا النحو ، يسمح هذا الإعداد بفحص متوسط الإنتاجية لمئات المركبات على GPCRs ذات الأهمية في فترة زمنية قصيرة ، مما يدل على أن الإجراء سيكون غاز أصفر ، طالب دكتوراه سو ، فني من مختبرنا قم بزراعة خلايا HEK 2 93 T في قوارير T 75 قبل ثلاثة أيام من إجراء مقايسة تعبئة الكالسيوم الفعلية ، يمر الخلايا عند الوصول إلى التقاء 80٪. قم بإعداد قارورة T 75 واحدة للتعداء باستخدام بنية المستقبل وواحدة للتعداء باستخدام متجه تعبير فارغ كعنصر تحكم سلبي.

احتضان القوارير عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ CO2 لمدة 20 إلى 24 ساعة حتى تقترب مزارع الخلايا من 50 إلى 70٪ كما هو موضح هنا. بعد ذلك ، أضف 3.9 ميكروغرام من بنية المستقبل أو المتجه الفارغ و 3.9 ميكروغرام من تعبير G alpha 16 Construct إلى أنبوب fuge دقيق سعة 1.5 ملليلتر. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت الرئيسي للنفاثة.

تخلط جيدا عن طريق دوامة الأنبوب متبوعا بدوران قصير. ثم أضف 37.5 ميكرولتر من دوامة الكاشف الرئيسي النفاث وقم بالدوران لأسفل لمدة دقيقة واحدة بأقصى سرعة. احتضن مزيج التعداء لمدة 10 دقائق.

في درجة حرارة الغرفة ، قم بتسمية مجموعة واحدة من الخلايا على أنها منقولة باستخدام متجه التعبير ، مع ترميز GPCR محل الاهتمام وبناء G alpha 16 والقارورة الثانية بالمتجه الفارغ وبناء G alpha 16. بعد الحضانة ، أضف مزيج التعدي بالتنقيط إلى وسط زراعة الخلايا ، مع التأكد من الماصة مباشرة في الوسط وتجنب ملامسة جدران قارورة الاستزراع. احتضان القوارير عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ CO2 لمدة 20 إلى 24 ساعة لمقايسة تعبئة الكالسيوم.

يتم جمع الخلايا المنقولة وزرعها في 96. لوحات سفلية سوداء الجدران واضحة. قم أولا بتغطية الألواح ب 60 ميكرولتر لكل بئر من درجة حرارة الغرفة.

ملحي مخزن بالفوسفات مع فيبرونكتين. احتضن الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة مع الغطاء. قم بإزالة المحلول من الآبار واحتضان الألواح مرة أخرى لمدة ساعة واحدة بدون الغطاء في درجة حرارة الغرفة.

في هذه الأثناء ، قم بإزالة وسط النمو القديم من الخلايا. اشطف الخلايا الميتة بثلاثة ملليلتر من PBS وقم بإزالة PBS. ثم أضف ثلاثة ملليلتر من درجة حرارة الغرفة PBS tryin EDTA احتضان لمدة دقيقة واحدة قبل إزالة المحلول.

في هذه المرحلة ، يتغير مورفولوجيا الخلايا من شكل نجم إلى شكل كرة. قم بفك الخلايا من أسفل القارورة عن طريق النقر اللطيف واجمعها عن طريق الشطف عدة مرات ب 10 مل من درجة حرارة الغرفة. DM em نقل المتوسطة.

انقل الخلايا إلى أنبوب صقر سعة 50 ملليلترا. لحساب عدد الخلايا لكل مليلتر ، أضف 100 ميكرولتر من مزرعة الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول التحلل واخلطه عن طريق النقر على الأنبوب.

أخيرا ، أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثبيت واخلطه عن طريق النقر. املأ كاسيت النواة بتعليق الخلية وعد الخلايا بالعداد. يقوم برنامج عرض النواة تلقائيا بضرب عدد الخلايا في ثلاثة حيث تم تخفيف الخلايا بمعامل ثلاثة.

عند إضافة المخزن المؤقت للتحلل والتثبيت ، قم بتخفيف الخلايا إلى تركيز نهائي يبلغ 600 ، 000 خلية لكل مليلتر وبذرة 150 ميكرولترا من الخلايا لكل بئر في الألواح المطلية. للحصول على كثافة خلية تبلغ حوالي 90،000 خلية لكل بئر ، تجنب فقاعات الهواء واضغط على اللوحة لنشر الخلايا بالتساوي. من أجل الحصول على طبقة خلية متجاورة ، احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ CO2 لمدة 16 إلى 24 ساعة.

تخلص من الوسيط من الخلايا. اغسل الخلايا ب 200 ميكرولتر من PBS لكل بئر وقم بإزالة PBS. لاحظ أن جميع الخطوات التالية التي تتضمن عمليات مع الخلايا يجب أن يتم تنفيذها في الظلام لأنه من هذه النقطة فصاعدا ، سيتم تحميل الخلايا بالفلورو أربعة.

أضف 55 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتحميل لكل بئر لف اللوحة بورق الألمنيوم لمنع تعرض اللوحة للضوء واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، استخدم مخزن الغسيل المؤقتة لإذابة الببتيدات المجففة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المصنوعة من السيليكون سعة 1.5 مل. قم بإعداد سلسلة تخفيف لإجراء تحليل استجابة التركيز وتحديد قيمة EC 50 للترابط.

ضع في اعتبارك أنه سيتم نقل 50 ميكرولترا من الترابط من اللوحة المركبة إلى بئر به 100 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت على لوحة الخلية أثناء الفحص ، لذا قم بإعداد المركبات بثلاثة أضعاف تركيزها النهائي المطلوب. بعد ذلك ، أضف 70 ميكرولترا من الترابط في البئر المقابل للوحة المركبة في ثلاث نسخ. قم بتضمين عناصر تحكم إيجابية وسلبية في كل لوحة.

تخلص من مخزن التحميل من لوحة الخلية وأضف 100 ميكرولتر من محلول الغسيل إلى كل بئر لمنع التعرض للضوء. احتضن الطبق لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من مخزن الغسيل المؤقت من لوحة الخلية وأضف 100 ميكرولتر من مخزن الغسيل الجديد إلى كل منها.

احتضن جيدا لوحة الخلية واللوحة المركبة ورف الأطراف لمدة 15 دقيقة. عند 37 درجة مئوية ، قم بإنشاء وتحميل ملف البروتوكول المطلوب مع البرنامج وتنشيط وحدة التحكم في درجة الحرارة لغرفة القراءة هنا. تقاس استجابات الكالسيوم عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، صف واحد في كل مرة مع فاصل زمني 1.52 ثانية بين القراءات المتتالية عند 525 نانومتر.

اضبط إثارة الأنفلونزا أوه أربعة إلى 488 نانومتر وانقل الحجم الإجمالي 50 ميكرولتر من المركب إلى لوحة الخلية. بعد 18 ثانية من القراءة. ابدأ بضبط سرعة التوزيع على 26 ميكرولتر في الثانية وارتفاع الماصة 135 ميكرولترا.

ضع المركب ولوحة الخلية ورف الطرف في الأدراج المناسبة لجهاز المحطة. قم بإجراء قراءة واحدة للوحة الخلية بنفس الطول الموجي للإثارة والانبعاث في وضع نقطة النهاية قبل بدء تشغيل الشاشة الفعلية في الوضع المرن. ابدأ الفحص وتابع تحليل البيانات باستخدام البرنامج الموضح.

فيما يلي رسوم بيانية تتوافق مع واحدة من ثلاث نسخ متماثلة من سلسلة تركيز واحد قصيرة NPF. لم يحفز التحكم السلبي إشارة الفلورسنت. في حين أن التحكم الإيجابي أثار تنشيطا قويا للمستقبلات المنشطة للبروتياز الداخلي ، مما يؤدي إلى إشارة فلورية عالية.

يسمح البرنامج بإدخال الصيغ لتحديد النسبة المئوية للتنشيط أو الأخطاء القياسية للتركيزات المختلفة وغيرها. تستخدم البيانات الناتجة لتكوين منحنيات استجابة التركيز الأولية لتقدير قيم EC 50 كما هو موضح لببتيدات NPF القصيرة للمريء الأربعة. تتضمن المنحنيات أيضا بيانات التحكم السلبي ، حيث تم اختبار سلسلة تركيز ذبابة الفاكهة الببتيدات NPF القصيرة على الخلايا المنقولة بناقل فارغ.

تشير النتائج إلى أن إضافة الببتيدات إلى هذه الخلايا ليس لها أي تأثير على المستقبلات الذاتية ، ولكنها في الواقع تنشط المستقبلات ذات الاهتمام. تم إجراء منحنيات استجابة التركيز الأولية لمقايسة تعبئة الكالسيوم القائمة على التألق وتم تكييف التركيزات المختبرة لتغطية النطاق الديناميكي للمنحنى. تتشابه قيم EC 50 لذبابة الفاكهة القصيرة npf 1 و 2 و 3 و four ، مما يشير إلى أنها قوية بنفس القدر لتنشيط المستقبل باتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل نشاط الهيكل ودراسات العلاقات للإجابة على أسئلة إضافية مثل الأحماض الأمينية للببتيد التي تعتبر ضرورية لتنشيط المستقبلات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تعبئة الكالسيوم القائمة على الإحساس بالمفلوير لتحديد الروابط التي تنشط وظيفيا للمستقبلات المقترنة ببروتين G. يتضمن ذلك صيانة أنظمة التعبير الشمسي متبوعة بتحويل المتحولين جنسيا لنظام الخلية عن طريق مستقبلات الاهتمام.

بعد اختبار تعبئة الكالسيوم الصلبة يمكن أن تحدث.