عامل نمو Electrospinning الافراج الجزئي في الليفية السقالات

يجمع هذا البروتوكول بين الغزل الكهربائي والكريات المجهرية لتطوير سقالات هندسية للأنسجة لتوجيه الخلايا العصبية. تم تغليف عامل نمو الأعصاب داخل الكريات المجهرية PLGA ونسجها كهربائيا في سقالات ليفية من حمض الهيالورونيك (HA). تم اختبار النشاط الحيوي للبروتين عن طريق بذر السقالات بالعقد الجذرية الظهرية الأولية للكتكوت واستزراعها لمدة 4-6 أيام.

الهدف العام من هذا الإجراء هو خلق بيئة متعددة الأوجه لدعم نمو الأعصاب وإصلاحها. يتم تحقيق ذلك عن طريق تغليف عوامل النمو أولا داخل الكريات المجهرية القابلة للتحلل. الخطوة الثانية هي إعداد مواد الدعم للجزء الأكبر من البيئة.

بعد ذلك ، يتم دمج الكريات المجهرية والمواد الداعمة ونسجها كهربائيا في سقالة ليفية محاذاة. الخطوة الأخيرة هي اختبار السقالة باستخدام الخلايا العصبية للعقد الجذرية الجذرية للكتكوت. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري المناعي الفلوري لإظهار تسريع نمو الخلايا العصبية واتجاهها مقارنة بالضوابط.

على الرغم من أن هذا النظام مصمم للأنسجة العصبية مع تغييرات طفيفة في البروتينات والمواد المستخدمة ، إلا أنه يمكن أيضا تطبيقه على أنواع مختلفة من الأنسجة ، بما في ذلك القلوب والرئتين والعظام. قبل البدء في هذا الإجراء ، قم بإعداد الكواشف اللازمة ، 2٪ و 0.5٪ من الوزن لكل حجم من كحول البولي فينيل أو PVA في الماء منزوع الأيونات ، ومحلول 2٪ الحجم لكل حجم ، وكحول الأيزوبروبيل والماء منزوع الأيونات ، ومحلول مائي من البروتين المحب للماء المطلوب. مكان. 40 مل من محلول 0.5٪ PVA في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مليلتر ويوضع جانبا في قارورة صغيرة مذابة 300 ملليغرام من 65 إلى 35 حمض كو جليكوليك بولي لاكتيك أو PLGA وثلاثة ملليلتر من ثنائي كلورو ميثان.

يمكن استخدام خلاط دوامة لتسريع إذابة PLGA مجتمعة 200 ميكرولتر من محلول البروتين وأربعة ميكرولترات من محلول PVA بنسبة 2٪. صب خليط البروتين PVA في محلول PLGA. ستظل الحلول منفصلة في الغالب.

ضع القارورة في دورق من الماء المثلج باستخدام W ator عند حوالي 10 واط ، وقم بتحريك المحلول لمدة خمس إلى 10 ثوان حتى يتم تكوين مستحلب أبيض كريمي موحد. صب المستحلب في أنبوب 50 مليلتر المعد مسبقا والذي يحتوي على 0.5٪ PVA. امزج المحلول بسرعة عالية على خلاط دوامة لمدة 20 ثانية تقريبا.

سوف يطور الحل مظهرا غائما. انقل المستحلب إلى دورق سعة 200 مل وضعه على طبق تقليب بسرعة 350 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين. أضف 50 مل من كحول الأيزوبروبيل 2٪ إلى الدورق الموجود على طبق التقليب.

اترك الخليط يستمر في التقليب لمدة ساعة على الأقل للسماح لميثان الكلورو بالتبخر وتصلب. بعد ذلك ، انقل محلول الكرة المجهرية إلى أنابيب الطرد المركزي ، وأجهزة الطرد المركزي عند 425 مرة G لمدة ثلاث دقائق. سوف تتجمع الكريات المجهرية في الجزء السفلي من الأنبوب وتظهر بيضاء قم بإزالة المادة الطافية بعناية من الأنبوب فوق الكريات المجهرية وتخزينها في زجاجة سعة 500 مل.

اشطف الكريات المجهرية بالماء منزوع الأيونات عن طريق ملء كل أنبوب بثلاثة أرباع ممتلئة ورجها لإعادة توزيع الكريات المجهرية في السائل. كرر إزالة الطرد المركزي للطافي وشطف الكريات المجهرية بالماء منزوع الأيونات أربع مرات بعد الشطف النهائي. قم بإزالة المادة الطافية وضعها في زجاجة سعة 500 مل مع العينات الأخرى.

قم بتجميد الكريات المجهرية المجمعة في أنابيب الطرد المركزي عند سالب 20 درجة مئوية طوال الليل ، ثم قم بتجميد الملابس لمدة 24 ساعة على الأقل. يجب تحضير محلول الغزل الكهربائي التالي مسبقا في الماء منزوع الأيونات ، 2٪ الوزن لكل حجم ، حمض الهيالورونيك المرتبط بالميثامفيتامين أو ميها بوزن 3٪ لكل حجم ، 900 كيلو دالتون أكسيد البولي إيثيلين أو PEO و 0.05٪ وزن لكل حجم. حل بادئ الصور.

بعد عمل الحجم المطلوب لمحلول الغزل الكهربائي ، أضف الكريات المجهرية بالتركيز المطلوب حتى 400 ملليغرام لكل مليلتر. امزج المحلول في خلاط دوامة حتى يتم توزيع الكريات المجهرية بالتساوي في المحلول. انقل المحلول إلى حقنة وقم بإرفاق إبرة طرف حادة قياس 18 بوصة بقياس ستة بوصات.

ضع المحقنة في مضخة حقنة واضبطها على 1.2 مل في الساعة. قم بلصق طبقة من رقائق الألومنيوم على المغزل. هذا يسمح بسهولة تنظيف وتخزين السقالة النهائية.

يتم استخدام مغزل دوار لإنشاء ألياف محاذاة. قم بتوصيل السلك الأرضي من مصدر طاقة عالي الجهد بجهاز التجميع. قم بتوصيل الرصاص الموجب بالإبرة لضمان نجاح الغزل الكهربائي.

من المهم جدا التحقق من صحة جميع الاتصالات والإعدادات. ابدأ ضخ البوليمر وعندما يكون المحلول مرئيا في نهاية المحقنة ، قم بتشغيل مصدر الجهد واضبط الجهد على 24 كيلو فولت. قم بتشغيل المحلول حتى يتم تحقيق سمك السقالة المطلوب.

عند الانتهاء ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الجهد ومضخة الحقنة. لبدء هذا الإجراء ، قم بإرفاق زلات الغطاء ذات الصلة بمنطقة تجميع الدوار الكهربائي بشريط قابل للإزالة على الوجهين قبل الغزل الكهربائي. يؤدي الدوران على زلات الغطاء ، مما يسهل المناولة والعرض بعد الدوران الكهربائي إلى السماكة المطلوبة.

كما هو موضح في مقطع الفيديو السابق ، قم بإزالة زلات الغطاء بعناية من المغزل. ضع غطاء السقالة المطلي في غرفة نيتروجين شفافة وتأكد من تطهير كل الأكسجين. ضع الغرفة والسقالة تحت ضوء 10 مللي واط مربع 365 نانومتر لمدة 15 دقيقة.

بعد مكان الربط المتقاطع ، ينزلق الغطاء إلى لوحة بئر بحجم مناسب. تأكد من أن جانب السقالة متجها لأعلى. ضع 100 إلى 200 ميكرولتر من الوسائط على كل سقالة في لوحة البئر. عنايه.

ضع عقدا جذريا ظهريا أو DRG على كل سقالة في قطرة الوسائط. للحصول على سقالة سميكة ، قد تكون هناك حاجة إلى المزيد من الوسائط. يجب أن تكون DRG مغمورة بالكامل وليست عائمة.

احتضان السقالة و DRG عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات للسماح للخلية بالالتصاق بالسقالة. بعد ذلك ، املأ الوسائط إلى المستوى المناسب للبئر. أعد الطبق إلى الحاضنة واحتضنه لمدة أربعة إلى ستة أيام بعد فترة الحضانة.

قم بإزالة الوسائط بعناية من كل بئر واغسلها برفق مرة واحدة باستخدام PBS. قم بإصلاح الخلايا لمدة 30 دقيقة باستخدام 4٪ من الوزن لكل حجم. يقوم Para formaldehyde لاحقا بتلطيخ الخلايا بحثا عن الخيوط العصبية والنوى باتباع بروتوكول محدد.

لتصور الخلايا باستخدام مجهر الفلورسنت ، ضع لوحة البئر على مسرح المجهر وحدد كتلة الخلية باستخدام إعدادات المرشح والإثارة ل dpi. بمجرد تحديد الخلية ، قم بتبديل الفلتر إلى zi. لتصور الخلايا العصبية الممتدة ، استخدم وظيفة الغرز على المجهر لجمع ودمج أكبر عدد ممكن من الصور حسب الضرورة لرؤية الهيكل بأكمله.

كرر ذلك مع الكريات المجهرية dpi و fite و brightfield. تم إنتاج 50 زائد أو ناقص 14 ميكرومتر في القطر مع أكثر من 85٪ من تغليف البروتين باستمرار ونسج الإلكتروبات في سقالات بواسطة هذا البروتوكول. تظهر هذه الصورة الفلورية كريات مجهرية تمثيلية مع قضيب دومين في غلاف PLGA ويناسب BSA مغلفة بداخلها.

لتقييم التغليف ، تم ملء الكريات المجهرية ب BSA واختبارها لإطلاق البروتين لأكثر من 60 يوما باستخدام مقايسة بروتين برادفورد. يبدأ الإطلاق بانفجار أولي ثم يستمر مع تحلل الكريات المجهرية بعد الدوران الكهربائي. يمكن رؤية الكريات المجهرية في جميع أنحاء البنية الليفية ثلاثية الأبعاد.

في صورة SEM هذه للسقالة الكاملة. يمكن رؤية الكرات في طبقات متعددة يشار إليها بالأسهم. هذه الصورة عالية التكبير هي لكرة مجهرية واحدة مع ألياف النانو من السقالة فوقها.

تم استخدام العقد الجذرية الظهرية أو DRG لاختبار جدوى عامل نمو الأعصاب أو NGF في الكريات المجهرية داخل السقالة. هنا DRG جالسة على سقالة تحتوي على كريات مجهرية. يتم تحميل مع NGF يظهر بجوار واحد المجهرية مع عدم وجود بروتين داخل العصبية الأطول الامتدادات الممتدة من DRG على سقالة NGF تشير إلى أن NGF قابل للحياة ويمكن أن يعزز النمو.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تغليف البروتين في الكريات المجهرية ودمجها في السقالات الليفية.