-النوع الفرعي انتقائية Electroporation للمن القشرية Interneurons

الهدف العام من هذا الإجراء هو استهداف العصبونات البينية في دماغ الفأر النامي عن طريق التثقيب الكهربائي في الرحم. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير إبر الحقن، تليها الخطوة الثانية وهي إزالة الجنين من الحيوان المخدر.

بعد ذلك، يتم إجراء حقن DNA والتثقيب الكهربائي في الدماغ. وتتمثل الخطوة النهائية في السماح للحيوان بالتعافي من الجراحة. وفي نهاية المطاف، يُستخدم التثقيب الكهربائي في الرحم للسماح بالاستهداف الانتقائي للأنماط الفرعية من العصبونات البينية.

تكمن ميزة هذه الطرق مقارنة بتقنياتنا الحالية، مثل عمليات التثقيب الكهربائي غير النوعية داخل الرحم، في أنها توفر الوسائل اللازمة لإجراء تحليل ذاتي خلوي لمجموعة فرعية من العصبونات البينية القشرية. وتسمح المستويات العالية من تعبير GFP بتصور وتحليل العصبونات البينية المفردة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال التطور العصبي، مثل القواعد التي تحكم دمج العصبونات البينية الناضجة.

لبدء هذا الإجراء، قم بتجهيز ماصة الحقن المجهري عن طريق سحب شعيرة زجاجية باستخدام سحابة الماصات. بعد ذلك، قم بإزالة الشعيرة بعناية واجمع الإبرة السفلية المخصصة للحقن المجهري. الآن، ضع فأراً حاملاً مخدراً على وسادة التسخين بحيث يكون الجانب البطني للأعلى.

قم بتغطية وجهه بقناع يستمر في تزويده بغاز الإيزوفلورين طوال فترة الجراحة. ثم ضع مرطب العين على كلتا العينين. اضبط وسادة التدفئة على 36 درجة Celsius لمنع انخفاض درجة حرارة الجسم بعد ذلك.

تحقق من غياب منعكسات القدم والذيل عن طريق قرص القوائم الخلفية أو الذيل. بعد ذلك، قم بتنظيف الجلد في منطقة البطن باستخدام 70%ethanol. استخدم الملقط لسحب الجلد إلى الأعلى.

بعد ذلك، قم بإجراء شق عمودي صغير بطول 2 cm على طول الخط الناصف، بدءاً من منتصف المسافة بين الزوجين الثالث والرابع من الغدد الثديية. كن حريصاً على عدم إتلاف جدار البطن باستخدام ملقط مستدير. اسحب السلسلة الجنينية برفق بعيداً عن التجويف.

اترك السلسلة تستقر فوق المناديل المبللة. ابدأ بكشف نصف واحد من الرحم، ثم تابع عملية التثقيب الكهربائي للأجنة قبل الانتقال إلى النصف الآخر.

في هذا الإجراء، يتم تحضير محلول DNA عن طريق إذابة الراسب الذي تم الحصول عليه من بروتوكول تنقية maxi prep القياسي في ماء مقطر. ثم يُضاف صبغ fast green إلى محلول DNA بنسبة 1 إلى 20 للسماح بالرؤية أثناء الحقن. بعد ذلك، يتم قطع طرف ماصة دقيقة مسحوبة مسبقاً باستخدام ملقط دقيق لترك ستة مليمترات من بداية الكتف حتى نهاية الطرف.

بعد ذلك، قم بتعبئة الماصة الدقيقة بـ 1 µL من محلول DNA مع صبغة fast green من أجل الحقن. ثبت رأس الجنين باستخدام ملاقط مستديرة. أدخل الماصة في الدماغ بزاوية 45 درجة، مستهدفاً البطين الجانبي الموجود بالقرب من الخط الناصف.

إذا نفذت الإبرة عبر البطين، فاسحب الماصة ببطء. يجب أن يتحول لون البطين إلى الأخضر عندما يبدأ المحلول في ملئه. عند هذه النقطة، توقف عن تحريك الماصة واحقن 1 µL من DNA.

بعد ذلك، اسحب الماصة برفق. اضبط جهاز ECM eight 30 ator على 5 نبضات جهد بقوة 45 فولت، بمدة 50 milliseconds وبفاصل زمني بين النبضات يبلغ 950 millisecond. اغمس أقطاب التوصيل ذات الريش مقاس خمسة مليمتر في محلول PBS لضمان النقل الفعال للتيار.

بعد ذلك، ضع أقطاب التوصيل الكهربائي حول رأس الجنين، بحيث يكون القطب الموجب على البطين الذي يحتوي على محلول DNA. ضع القطب الموجب في مستوى أدنى قليلاً من القطب السالب لإحداث تيار بطني عبر البروزات العقدية. سيؤدي ذلك إلى تقليل التعبير المنتبذ في الخلايا المجاورة للمسار.

الآن، قم بإعطاء نبضة واحدة بالضغط على دواسة القدم مرة واحدة، ثم قم بإزالة الأقطاب الكهربائية ومسحها لتنظيفها. كرر هذه الخطوات لكل جنين من الأجنة. وبعد الانتهاء من التثقيب الكهربائي لجميع الأجنة.

صب ثلاثة milliliters من PBS في التجويف البطني ثم أعد الأجنة إلى التجويف البطني. بعد ذلك، قم بخياطة جدار البطن باستخدام إبرة منحنية وخيط جراحي من الحرير قياس 5-0، ثم خيط الجلد. ضع lidocaine على الجرح وأعطِ 120 milligrams لكل kilogram من aspirin في البداية لتسكين الألم.

أخرج الحيوان من أنابيب التخدير واتركه ليتعافى على وسادة تدفئة فوق منديل ورقي. بعد ذلك، أعد الحيوان إلى القفص. أبقه على وسادة التدفئة عند 37 °C وراقب حالته الصحية.

في هذه التجربة، يتم تحديد العصبونات البينية التي خضعت للتثقيب الكهربائي من خلال التعبير عن علامات الأنواع الفرعية المشتقة من CGE. وتوضح هذه الصورة أن العصبونات البينية المشتقة من CGE قد خضعت للتثقيب الكهربائي باستخدام بلازميد DLX five six EGFP. كما تُظهر هذه الصورة عصبوناً بينياً يعبر عن VIP في اليوم الثامن من عمر الجنين (P eight).

يحدد تعبير EGFP الشجرة التغصنية الكاملة والتشعب المحوري للعصبونات المفردة، وهنا يظهر عصبون بيني يعبر عن NPY في اليوم الثامن بعد الولادة (P 8). ويحدد تعبير NPY الخلايا الدبقية العصبية. وأخيرًا، يظهر هنا عصبون بيني يعبر عن NPY في اليوم الخامس عشر بعد الولادة (P 15).

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون 20 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. ومن خلال الجمع بين استخدام بلازميد محدد وسلالات فئران معدلة وراثياً، يمكن تحقيق تحكم زماني ومكاني في تعبير الجينات المستهدفة. وفي بعض التجارب، نستخدم بلازميد A-D-L-X-T-T-A لتحفيز تعبير الجينات المنقولة المعتمدة على AU.

في هذه التجارب، قمنا بتثبيط تعبير الجين المنقول عن طريق إعطاء doxycycline.