Name: ثنائي الفوتون في الجسم الحي التصوير من العمود الفقري شجيري في اللحاء باستخدام الماوس الجمجمة ضعفت إعداد (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-12T22:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: تعلم تقنية التصوير ثنائي الفوتون عبر الجمجمة للهياكل المشبكية المُصبغة في قشرة الفأر الحي باستخدام تحضير الجمجمة الرقيقة. تتيح هذه الطريقة مراقبة ديناميكيات الأشواك الشجيرية بمرور الوقت.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر جيمس بيرنا لتوضيح الرسم. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد الوطني للصحة العقلية لYZ

يحتاج الى موافقة التي يمكن الحصول عليها من المؤسسات المنزل قبل بدء الجراحة ودراسة التصوير. وأجريت التجارب الموضحة في هذه المخطوطة وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح من جامعة كاليفورنيا في سانتا كروز المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة. 1. جراحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية وتعقيم مساحة العمل مع 70٪ كحول جيدا قبل الجراحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الماوس عن طريق داخل الصفاق (IP) حقن KX حل مخدر (200 ملغ / كغ الكيتامين و 20 مغ / كغ زيلازين) وفقا لوزن الجسم الماوس، ملاحظة: KX الجرعة يمكن تعديلها وفقا للسلالة، والعمر، والحالة الصحية من الفئران. ويوصى أيضا التشاور البيطرية لتحديد الجرعة المثالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء اختبار قرصة أخمص القدمين بشكل دوري عن طريق الضغط على أصابع القدم الماوس، والتحقق من وجود استجابة انعكاسية لمراقبة حالة التخدير.تأكد من أن الفأر هو تخدير كامل قبل البدء في الجراحة ملاحظة: خلال جلسات التصوير لفترات طويلة، تحقق من حالة التخدير الماوس، بشكل دوري وإداراتها إضافية KX إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس على وسادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم أثناء الجراحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلق الرأس من الفأرة باستخدام شفرة حلاقة لفضح فروة الرأس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم منطقة حلق بواسطة المسح الجلد بالتناوب مع منصات الكحول وبتدين. إزالة أي قصاصات الشعر المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق مرهم العين بلطف لتليين كلتا العينين، وبالتالي منع الأضرار الناجمة عن الجفاف دائمة أثناء التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق مستقيم على طول خط الوسط من فروة الرأس، ونقل الجلد أفقيا نحو حواف الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة النسيج الضام تعلق على الجمجمة. </li></ol> 2. ضعفت الجمجمة إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد المنطقة على أساس التصوير ستير. الإحداثيات eotaxic ملاحظة: في محاولة لتجنب الأوعية الدموية الكبيرة، والتي تغلغل ضوء كتلة وطمس الهياكل تصويرها. ويلاحظ الأوعية الدموية أفضل عند الجمجمة رطبة مع ملحي معقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الحفر الصغيرة عالية السرعة إلى منطقة دائرية رقيقة من الجمجمة (0.5-1.0 ملم القطر). نقل موازية الحفر إلى السطح الجمجمة، بدلا من عقد ضد الجمجمة والضغط على أسفل. الحفر حتى كل من طبقة العظم المضغوط الخارجي وطبقة العظم الإسفنجي منتصف تتم إزالة ملاحظة: لمنع الأضرار الناجمة عن ارتفاع درجة الحرارة، وتجنب الاتصال المطول بين مثقاب والجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تواصل ترقق الطبقة الداخلية العظام التعاقد مع شفرة المجهرية في وسط منطقة الحفر ضعيفة. عقد شفرة المجهرية في زاوية ما يقرب من 45 درجة إلى كشط الجمجمة دون الضغط انخفض مقابل الجمجمة حتى يتم ضعفت بالتساوي منطقة صغيرة (200-300 ميكرون قطر) مع سمك تقريبييتم الحصول لاي 20-30 ميكرومتر. نظرا لصناعة السيارات في مضان من الجمجمة، ويمكن قياس سماكة عن طريق مسح المسافة بين السطح العلوي والسفلي من الجمجمة تحت المجهر ثنائي الفوتون ملاحظة: على الرغم من أن سمك الجمجمة أقل من 20 ميكرون يوفر جودة تصوير جيدة، لا ينصح به لأنه يجعل عملية ترقق في جلسات لاحقة إعادة التصوير صعبا. لتجنب الإفراط رقيق، سمك الجمجمة يحتاج إلى أن يتم التحقق بشكل دوري أثناء الجراحة (انظر مناقشة). </li></ol> 3. تجميد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية إزالة الحطام العظام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة صغيرة من الغراء cyanoacrylate على كل حافة من افتتاح مركز لوحة الرأس العقيمة، والتي تم تعقيمها (انظر الشكل 1). عقد لوحة الرأس بإحكام ضد الجمجمة مع المنطقة ضعيفة تقع في وسط افتتاح ملاحظة: إذا كان الغراء يلوث ص ضعيفةegion عن طريق الصدفة، إزالته بعناية مع شفرة المجهرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> برفق الجلد من الجانبين من الجمجمة إلى حواف افتتاح مركز لوحة الرأس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتظر حوالي 10 دقيقة حتى يتم إرفاق لوحة رأس البئر في الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة الرأس على اثنين من كتل الجانبية من لوحة بعقد ثم تضييق الخناق على حواف لوحة الرأس لشل حركة الماوس على لوحة عقد (انظر الشكل 1) ملاحظة: تأكد من عدم وجود الجلد أو شعيرات بين لوحة الرأس والكتل قبل تشديد الخناق. A إعداد يجمد جيدة ينبغي أن لا تظهر أي حركة ملحوظة من الجمجمة تحت المجهر تشريح عند الجزء الخلفي من الحيوان يربت بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> . شطف الجمجمة يتعرض بمحلول ملحي لإزالة الغراء unpolymerized ملاحظة: من المهم لإزالة أي الغراء المتبقية، والغراء unpolymerized يطمس الصور والأضرار المجهر أهداف &lt;./ لى&gt; </ol> 4. التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صورة من الأوعية الدموية من الجمجمة يتعرض مع المنطقة ضعفت كما خريطة 1، والذي يستخدم لنقل المنطقة المصورة في جلسات التصوير لاحقة (انظر الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس تحت المجهر التصوير. تحديد المنطقة ضعيفة تحت الهدف 10X الهواء باستخدام epifluorescence ونقل أنحف المنطقة إلى مركز العرض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قطرة من المياه المالحة في الجزء العلوي من الجمجمة والتحول إلى الهدف 60X، والتي تم تشطف بالماء المعقم. تحديد المنطقة التي تصور العمود الفقري شجيري الفردية بوضوح على طول التشعبات. تحديد وتسمية المنطقة المقابلة على خريطة 1 من خلال مقارنة بين الأوعية الدموية وجهة نظر المجهر epifluorescent والصورة الأوعية الدموية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الطول الموجي ليزر ثنائي الفوتون وفقا لfluorophores. على سبيل المثال، 920 نانومتر لYFP؛ 890 نانومتر لGFP؛ 1،000 نانومتر لDsRed وtdTomato 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صورة أكوام مع 2الخطوات ميكرومتر على طول ض محور باستخدام الهدف 60X. هذه الصورة كومة يغطي × 200 ميكرون المنطقة حوالي 200 ميكرون (512 X 512 بيكسل) ويتم استخدام خريطة 2 لنقل خلال جلسات التصوير لاحقة (انظر الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على تسعة مداخن صورة داخل الخريطة 2 باستخدام تقريب رقمي 3X. كل صورة كومة يغطي مساحة تقارب 70 ميكرومتر × 70 ميكرون (512 X 512 بكسل)، مع 0.7 ميكرومتر الخطوات على طول ض محور ملاحظة: يجب أن تكون كثافة الليزر أقل من 40 ميغاواط عند قياسها على عينات لتقليل الضيائية. </li></ol> 5. استعادة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التصوير، وفصل بلطف لوحة الرأس من الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تماما تنظيف الجمجمة والجلد لإزالة كافة الغراء المتبقية ملاحظة: إن أي الغراء المتبقي على الجلد يسبب تهيج وتبطئ الشفاء الجلد في حين أن أي الغراء المتبقية على الجمجمة ويسبب تآكل الجمجمة وngiogenesis في طبقة العظام نمت حديثا، مما يجعل نقل اللاحقة وإعادة التصوير صعبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الجمجمة والجلد بمحلول ملحي عدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خياطة فروة الرأس مع خياطة جراحية معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الحيوان على وسادة التدفئة في قفص منفصل. إدارة مسكن البوبرينورفين (0.1 ملغ / كلغ) تحت الجلد لتخفيف آلام ما بعد الجراحة. عودة الحيوان إلى قفص المنزل بعد الشفاء التام. مراقبة الحيوانات عن كثب (فحص مرة واحدة يوميا على الأقل) حتى تشفى شق ويتم إزالة الغرز. إدارة الحقن اللاحقة من البوبرينورفين مسكن إذا لزم الأمر. </li></ol> 6. Reimaging <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 1،1-1،8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3،1-3،6 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد موقع المنطقة تصويرها سابقا بمقارنة نمط الأوعية الدموية لخريطة 1 ونمط فرع شجيري إلى خريطة 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا تم تنفيذ reimaging في حدود 1 في الاسبوع، كرر الخطوة 2.3 لإزالة طبقة رقيقة من العظام نمت حديثا على رأس إعادة ضعيفةجيون باستخدام شفرة المجهرية. إذا تم تنفيذ reimaging بعد أكثر من 1 أسبوع، كرر الخطوات على حد سواء 2.2 و 2.3 ملاحظة: تتكون طبقة العظام نمت حديثا هيكل أقل مكثف مقارنة مع طبقة العظم المضغوط الأصلي، مما يؤدي إلى انخفاض جودة الصورة. لذا، للحصول على نفس النوعية، فمن الضروري رقيقة الجمجمة أكثر قليلا من الدورة السابقة التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الموقف والتوجه للحصول على أكوام الصورة التي تطابق المتخذة سابقا مداخن صورة تحت المجهر ثنائي الفوتون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صور كما في الخطوة 4.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 5،1-5،5 بعد التصوير. </li></ol>

<ol><li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).</li>
<li>Fu, M., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+plasticity+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural plasticity in the cortex.</a> Trends in neurosciences. 34, 177-187 (2011).</li>
<li>Yu, X., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spine+plasticity+in+the+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Spine plasticity in the motor cortex.</a> Current opinion in neurobiology. 21, 169-174 (2011).</li>
<li>Harms, K. J., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+plasticity%3A+looking+beyond+development%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine plasticity: looking beyond development.</a> Brain research. 1184, 65-71 (2007).</li>
<li>Segal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spines+and+long-term+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dendritic spines and long-term plasticity.</a> Nature reviews. Neuroscience. 6, 277-284 (2005).</li>
<li>Tada, T., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of dendritic spine morphogenesis.</a> Current opinion in neurobiology. 16, 95-101 (2006).</li>
<li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annual review of neuroscience. 30, 79-97 (2007).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature protocols. 5, 201-208 (2010).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature protocols. 4, 1128-1144 (2009).</li>
<li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nature methods. 7, 981-984 (2010).</li>
<li>Szu, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cortical+window+technique+for+in+vivo+optical+coherence+tomography+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cortical window technique for in vivo optical coherence tomography imaging.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+formation+and+selective+stabilization+of+synapses+for+enduring+motor+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories.</a> Nature. 462, 915-919 (2009).</li>
<li>Fu, M., Yu, X., Lu, J., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repetitive+motor+learning+induces+coordinated+formation+of+clustered+dendritic+spines+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Repetitive motor learning induces coordinated formation of clustered dendritic spines in vivo.</a> Nature. 483, 92-95 (2012).</li>
<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature neuroscience. 8, 752-758 (2005).</li>
<li>Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrillar+amyloid+deposition+leads+to+local+synaptic+abnormalities+and+breakage+of+neuronal+branches%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches.</a> Nature neuroscience. 7, 1181-1183 (2004).</li>
<li>Pan, F., Aldridge, G. M., Greenough, W. T., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+instability+and+insensitivity+to+modulation+by+sensory+experience+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine instability and insensitivity to modulation by sensory experience in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 17768-17773 (2010).</li>
<li>Liu, Z., Condello, C., Schain, A., Harb, R., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1+in+microglia+regulates+brain+amyloid+deposition+through+selective+protofibrillar+amyloid-beta+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">CX3CR1 in microglia regulates brain amyloid deposition through selective protofibrillar amyloid-beta phagocytosis.</a> J Neurosci. 30, 17091-17101 (2010).</li>
<li>Tremblay, M. E., Zettel, M. L., Ison, J. R., Allen, P. D., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+aging+and+sensory+loss+on+glial+cells+in+mouse+visual+and+auditory+cortices%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Effects of aging and sensory loss on glial cells in mouse visual and auditory cortices.</a> Glia. 60, 541-558 (2012).</li>
<li>Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embolus+extravasation+is+an+alternative+mechanism+for+cerebral+microvascular+recanalization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization.</a> Nature. 465, 478-482 (2010).</li>
<li>Kelly, E. A., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+imaging+of+mouse+visual+cortex+using+a+thinned-skull+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin-skull+window+technique+for+chronic+two-photon+in+vivo+imaging+of+murine+microglia+in+models+of+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+glioma+initiation+in+vivo+through+a+polished+and+reinforced+thin-skull+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging glioma initiation in vivo through a polished and reinforced thin-skull cranial window.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+genetic+manipulation+of+dendrites+and+spines+in+the+mouse+cerebral+cortex+and+hippocampus+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental biology. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+injection+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intracranial injection of adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71, 995-1013 (2011).</li>
<li>Zariwala, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> J Neurosci. 32, 3131-3141 (2012).</li>
<li>Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+labeling+and+functional+manipulation+of+specific+neuron+types+in+mouse+brain+by+Cre-activated+viral+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression.</a> PloS one. 3, (2008).</li>
</ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

للحصول على نجاح إعداد ضعفت الجمجمة، عدة خطوات في هذا البروتوكول حاسمة. 1) سمك الجمجمة. عظم الجمجمة لديها بنية ساندويتش، مع اثنين من طبقات من العظم المضغوط عالي الكثافة وطبقة وسطى من الاسعار المنخفضة للكثافة العظام الاسفنجية. في حين أن الحفر الصغيرة عالية السرعة مناسبة لإزالة الطبقات الخارجية من العظم المضغوط والعظم الإسفنجي، شفرة المجهرية مثالية لترقق الطبقة الداخلية من العظم المضغوط. كما سمك وصلابة من الزيادات الجمجمة خلال التنمية، والتصوير من الفئران الكبار يتطلب المزيد من العظا...

تشارك القشرة الثدييات في العديد من وظائف الدماغ، من الحسي الإدراك والحركة التحكم لمعالجة المعلومات المجردة والإدراك. وظائف القشرية المختلفة بناء على الدوائر العصبية المختلفة، والتي تتكون من أنواع مختلفة من الخلايا العصبية التواصل وتبادل المعلومات في نقاط الاشتباك العصبي الفردية. وباستمرار يتم تعديل هيكل وظيفة نقاط الاشتباك العصبي ردا على الخبرات والأمراض. في الدماغ ناضجة، اللدونة متشابك يأخذ شكل كلا من التغيرات قوة وبالإضافة إلى ذلك / إزالة نقاط الاشتباك العصبي، ولعب أدوارا مهمة في تشكيل والحفاظ على الدوائر العصبية الوظيفية. العمود الفقري شجيري هي المكونات بعد المشبكي الأغلبية من نقاط الاشتباك العصبي في الدماغ مثير الثدييات. ويعتقد أن دوران مستمر وتغيرات شكلية في العمود الفقري لتكون بمثابة مؤشر جيد من التعديلات في الاتصالات متشابك 1-7. ثنائي الفوتون المسح الضوئي ليزر الصغيرةيقدم SCOPY الاختراق العميق في السراء، والأعمال التحضيرية مبهمة والضيائية منخفضة، مما يجعلها مناسبة للتصوير الحية في الدماغ سليمة 8. في تركيبة مع وضع العلامات الفلورسنت، ويوفر اثنين من الفوتون التصوير أداة قوية لنظرة خاطفة إلى الدماغ يعيشون واتبع إعادة التنظيم الهيكلي في نقاط الاشتباك العصبي الفردية مع مكانية عالية والقرار الزماني. وقد استخدمت أساليب مختلفة لإعداد الفئران لتصوير حي 9-13. هنا، نحن تصف إعداد ضعفت الجمجمة من الجسم الحي في اثنين من الفوتون التصوير للتحقيق في اللدونة الهيكلية في العمود الفقري شجيري بعد المشبكي في القشرة الماوس. باستخدام هذا النهج، وقد صورت دراساتنا الأخيرة صورة ديناميكية التغيرات العمود الفقري شجيري ردا على تعلم المهارات الحركية مع زيادة توافر الحيوانات المعدلة وراثيا مع fluorescently المسمى فرعية العصبية والتطور السريع للتقنيات وضع العلامات في الجسم الحي، وإجراءات مماثلة وصفها هنا يمكن أن تطبق أيضا لinvestigaالشركة المصرية للاتصالات أنواع أخرى الخلية والمناطق القشرية، جنبا إلى جنب مع معالجات أخرى، فضلا عن استخدامها في نماذج المرض 16-23.

<table><tbody><tr><td>كيتامين</td><td>Bioniche Pharma</td><td>67457-034-10</td><td>ممزوج بالزيلازين للتخدير</td></tr><tr><td>مختبرات</td><td>زيلازين</td> لويد <td>139-236</td><td>ممزوج بالكيتامين للتخدير</td></tr><tr><td>محلول ملحي</td><td>Hospira</td><td>0409-7983-09</td><td>0.9٪ كلوريد الصوديوم للحقن والتصوير</td></tr><tr><td>شفرات الحلاقة</td><td>علوم المجهر الإلكتروني</td><td>72000</td><td>شفرات حلاقة مزدوجة الحواف من الفولاذ المقاوم للصدأ</td></tr><tr><td>وسادات الكحول</td><td>فيشر Scientific</td><td>06-669-62</td><td>وسادات تحضير الكحول المعقمة</td></tr><tr><td>مرهم العين</td><td>هنري شاين</td><td>102-9470</td><td>مرهم الفازلين للعيون زيوت تشحيم العين المعقمة</td></tr><tr><td>مثقاب صغير عالي السرعة</td><td>أدوات العلوم الدقيقة</td><td>18000-17</td><td>المثقاب الصغير عالي السرعة مناسب لتخفيف الطبقة الخارجية للعظام المدمجة واستهداف مساحة صغيرة</td></tr><tr><td>نتوءات فولاذية للحفر الصغير</td><td>أدوات العلوم الدقيقة</td><td>19007-14</td><td>قطر 1.4 مم</td></tr><tr><td>شفرة جراحية مجهرية</td><td>Surgistar</td><td>6961</td><td>الشفرة الجراحية المجهرية مناسبة لتخفيف الطبقة الداخلية للعظم المضغوط والطبقة الوسطى من العظام الإسفنجية</td></tr><tr><td>غراء سيانواكريليت</td><td>فيشر NC9062131 ثبت</td><td></td><td>لوحة الرأس على خياطة الجمجمة</td></tr><tr><td></td><td>جهاز هافارد</td><td>510461</td><td>خياطة حريرية معقمة غير ماصة ، 6-0 الشعيرات الأحادية</td></tr><tr><td>تشريح المجهر</td><td>أوليمبوس</td><td></td><td>SZ61</td></tr><tr><td>كاميرا CCD</td><td>إنفينيتي</td><td></td><td></td></tr><tr><td>مجهر ثنائي الفوتون</td><td>تقنيات</td><td></td> البراري <td>Ultima IV</td></tr><tr><td>10X الموضوع</td><td>أوليمبوس</td><td></td><td>NA 0.30 ، هواء</td></tr><tr><td>60X الموضوع</td><td>أوليمبوس</td><td></td><td>NA 1.1 ، نفاذية الأشعة تحت الحمراء ، الغمر في الماء</td></tr><tr><td>ليزر Ti-sapphire</td><td>ألطيف الفيزياء</td><td></td><td>ماي تاي إتش بي</td></tr></tbody></table>

ثنائي الفوتون<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من العمود الفقري شجيري في اللحاء باستخدام الماوس الجمجمة ضعفت إعداد

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

في القشرة الثدييات، الخلايا العصبية تشكيل شبكات معقدة للغاية، وتبادل المعلومات في نقاط الاشتباك العصبي. التغيرات في قوة متشابك، فضلا عن إضافة / إزالة نقاط الاشتباك العصبي، تحدث بطريقة تعتمد على الخبرة، وتوفير الأساس الهيكلي للاللدونة العصبية. كمكونات بعد المشبكي من نقاط الاشتباك العصبي معظم مثير في القشرة، وتعتبر العمود الفقري شجيري أن يكون وكيل جيدة من نقاط الاشتباك العصبي. الاستفادة من مزايا وتقنيات الوراثة الماوس وضع العلامات الفلورسنت، والخلايا العصبية الفردية وهياكلها متشابك يمكن أن توصف في الدماغ سليمة. ونحن هنا نقدم بروتوكول التصوير عبر الجمجمة باستخدام اثنين من الفوتون المجهري المسح الضوئي ليزر لمتابعة fluorescently المسمى العمود الفقري شجيري بعد المشبكي على مر الزمن في الجسم الحي. هذا البروتوكول يستخدم إعداد ضعفت الجمجمة، والتي تحافظ على الجمجمة سليمة ويتجنب الآثار الناجمة عن التعرض للالتهابات السحايا والقشرة. لذلك، يمكن الحصول على الصور مباشرة بعد سويتم تنفيذ rgery. لا يمكن أن يؤديها إجراء التجارب بشكل متكرر على مدى فترات زمنية مختلفة تتراوح من ساعات إلى سنوات. يمكن أيضا استخدام هذا المستحضر يتم توسيع التحقيق في مختلف المناطق القشرية وطبقات، وكذلك أنواع الخلايا الأخرى، في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية.

في YFP-H خط الفئران 25، بروتين فلوري الصفراء يعبر في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية الهرمية طبقة V، التي توقع لها قمية التشعبات إلى طبقات سطحية في القشرة. من خلال إعداد ضعفت الجمجمة، وقطاعات شجيري fluorescently المسمى ولا يمكن تصوير تحت المجهر متكررة اثنين من الفوتون على فترات التصوير المختلفة، بدءا من ساعات لأشهر. نحن هنا تظهر مثال على التصوير أربع مرات من نفس التشعبات أكثر من 8 أيام في القشرة الحركية على فأرة الحاسوب 1 الشهر القديمة، حيث العمود الفقري الفردية وكذلك أ...

يوفر التصوير بفاصل زمني في الحي معلومات قيمة عن إعادة التنظيم الهيكلي في الدماغ السليم. هنا ، نقدم مستحضر جمجمة رقيق يسمح بالتصوير عبر الجمجمة للهياكل المشبكية المصنفة بالفلورسنت في قشرة الفأر الحي عن طريق الفحص المجهري ثنائي الفوتون.

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو السماح بالتصوير عبر الجمجمة للبنى التشابكية الموصومة بالفلورسنت في قشرة الفأر الحية باستخدام مجهر الفوتونين. تتمثل الخطوة الأولى بعد تخدير الفأر في إجراء تحضير لترقيق الجمجمة. بعد ذلك، يتم تثبيت رأس الفأر باستخدام لوحة تثبيت مصنعة خصيصاً.بعد ذلك، يتم الحصول على مجموعات الصور عبر الجمجمة الرقيقة باستخدام مجهر الفوتونين. وفي النهاية، أتاح إعادة تحديد موقع المنطقة التي تم تصويرها سابقاً وتصويرها تتبع ديناميكيات الأشواك الشجيرية عبر فترات زمنية مختلفة وفي ظل ظروف متنوعة.للتحضير للجراحة، يتم تخدير الفأر باستخدام ketamine وxylazine، مع إجراء اختبار قرص إصبع القدم للتأكد من التخدير الكامل. بعد ذلك، يوضع الفأر على وسادة تدفئة وتُستخدم شفرة حلاقة لحلاقة الرأس. تُمسح البشرة بمسحات كحولية بالتناوب لتعقيم المنطقة المحلوقة وإزالة أي بقايا لشعر الحلاقة.كذلك، ضع مرهم العين برفق على كلتا العينين. بعد ذلك، قم بإجراء شق مستقيم على طول الخط الناصف لفروة الرأس وحرك الجلد جانبياً نحو حواف الجمجمة. ثم أزل النسيج الضام الملتصق بالجمجمة لبدء عملية تحضير الجمجمة الرقيقة.أولاً، حدد منطقة التصوير المطلوبة بناءً على موقعها النسبي بالنسبة لخط المنتصف والـ bgma. ثم قم بترطيب الجمجمة بمحلول ملحي لملاحظة الأوعية الدموية، وذلك لتجنب ترقيق الجمجمة في منطقة تحتوي على أوعية دموية كبيرة لأنها تحجب نفاذ الضوء وتؤدي إلى تشوش تراكيب الصورة. بمجرد اختيار منطقة بقطر يتراوح بين 0.5 إلى 1 مليمتر، استخدم مثقاباً دقيقاً عالي السرعة لترقيق منطقة دائرية من الجمجمة.حرك المثقاب بشكل موازٍ لسطح الجمجمة بدلاً من تثبيته مقابل الجمجمة والضغط لأسفل، وذلك لمنع التلف الناتج عن ارتفاع درجة الحرارة. تجنب التلامس المطول بين ريشة المثقاب والجمجمة حتى تتم إزالة طبقة العظم المدمج الخارجية وطبقة العظم الإسفنجي الوسطى. بعد ذلك، استخدم شفرة جراحة مجهرية ممسوكة بزاوية 45 درجة تقريباً لترقيق طبقة العظم المدمج الداخلية في مركز المنطقة التي تم ترقيقها بالمثقاب.قم بكشط الجمجمة دون الضغط عليها حتى يتم الحصول على منطقة رقيقة بشكل متساوٍ يتراوح قطرها بين 200 إلى 300 micrometers وبسمك يتراوح تقريباً بين 20 إلى 30 micrometers. وبمجرد ترقيق الجمجمة بشكل كافٍ، قم بإزالة بقايا العظام بعناية. الخطوة التالية هي تثبيت صفيحة الرأس، المصنوعة من شفرات حلاقة ذات حواف حادة ومغطاة بأشرطة لاصقة.ابدأ بوضع قطرة صغيرة من غراء السيانوأكريليت على كل حافة من الفتحة المركزية للصفيحة الرأسية. ثم قم بتوسيط الصفيحة الرأسية فوق المنطقة التي تم ترقِيِقها. ثبتها بإحكام مقابل الجمجمة.الآن، اسحب الجلد برفق من جوانب الجمجمة باتجاه حواف الفتحة المركزية للصفيحة الرأسية. ثبّت الصفيحة الرأسية في مكانها لمدة تتراوح من دقيقة إلى دقيقتين. ثم انتظر من ثماني إلى تسع دقائق أخرى حتى تلتصق الصفيحة الرأسية جيداً بالجمجمة.بعد مرور 10 دقائق، ضع لوحة الرأس على الكتلتين الجانبيتين للوحة التثبيت. بعد ذلك، أحكم ربط البراغي الموجودة فوق حواف لوحة الرأس لتثبيت الفأر على لوحة التثبيت. افحص رأس الفأر عبر مجهر تشريحي مع الضغط بلطف على ظهر الفأر للتأكد من تثبيت الرأس بشكل صحيح.بعد ذلك، اشطف الجمجمة المكشوفة بمحلول ملحي لإزالة أي غراء غير متبلمر من أجل إعادة تحديد المنطقة التي تم تصويرها سابقاً. في جلسات التصوير اللاحقة، التقط صورة للأوعية الدموية في المنطقة الرقيقة من الجمجمة المكشوفة، والتي تُسمى "الخريطة 1". ثم ضع الفأر تحت مجهر التصوير وحدد المنطقة الرقيقة باستخدام العدسة الهوائية 10 x.باستخدام تقنية الفلورسنس فوق البؤري (epi fluorescence)، قم بنقل المنطقة الأكثر رقة إلى مركز مجال الرؤية. أضف الآن قطرة من المحلول الملحي إلى الجزء العلوي من الجمجمة وانتقل إلى العدسة الشيئية 60x. اختر منطقة تظهر فيها الأشواك التغصنية الفردية بوضوح على طول التغصنات.حدد المنطقة المقابلة على الخريطة الأولى وقم بتسميتها من خلال مقارنة الأوعية الدموية بين عرض الفلورة فوق البنفسجية وصورة الأوعية الدموية. بعد ذلك، اضبط الطول الموجي لليزر ثنائي الفوتون وفقاً للمجموعات الفلورية. ثم باستخدام عدسة شيئية 60x، قم بالتقاط مجموعات من الصور بخطوات قدرها 2 µm على طول المحور Z، بحيث تغطي مساحة تبلغ تقريباً 200 µm × 200 µm.تُخصص هذه المنطقة كخريطة ثانية وتُستخدم لإعادة تحديد موقع الجزء الشجيري من الصورة خلال جلسات التصوير اللاحقة. الآن، قم بالتقاط تسع مجموعات من الصور ضمن الخريطة الثانية باستخدام تقريب رقمي ثلاثي (3x). تغطي كل مجموعة صور مساحة تقريبية تبلغ 70 µm في 70 µm مع خطوات قدرها 0.7 µm على طول المحور Z.بعد التصوير، قم بفصل صفيحة الرأس بلطف عن الجمجمة. بعد ذلك، استخدم شفرة جراحية مجهرية لإزالة الغراء المتبقي من الجمجمة. ثم اشطف الجمجمة والجلد بمحلول ملحي عدة مرات وقم بخياطة فروة الرأس باستخدام غرز جراحية معقمة.أثناء فترة الإفاقة، ضع الحيوان على وسادة تدفئة في قفص منفصل، وقم بإعطائه مسكن الآلام بوبـرينورفين عن طريق الحقن تحت الجلد لعلاج آلام ما بعد الجراحة. وبعد التعافي الكامل، أعِد الحيوان إلى قفصه الأصلي. ولإعادة تصوير التغصنات في يوم آخر، قم بتخدير الحيوان وكشف الجمجمة. وكرر عملية تثبيت الرأس كما سبق، وذلك عن طريق تركيب صفيحة الرأس وتثبيتها في صفيحة التثبيت.ثم حدد موقع المنطقة التي تم تصويرها سابقاً عن طريق مقارنة نمط الأوعية الدموية بالخريطة الأولى، ونمط التفرعات الشجيرية بالخريطة الثانية. إذا تم إجراء إعادة التصوير خلال أسبوع واحد، يمكن إزالة الطبقة الرقيقة من العظم الذي نما حديثاً باستخدام شفرة جراحة مجهرية. أما إذا تم إجراء إعادة التصوير بعد أكثر من أسبوع، فاستخدم أولاً المثقاب المجهري، ثم شفرة الجراحة المجهرية لترقيق الجمجمة.قم الآن بضبط الموضع والتوجه تحت مجهر الفوتونين للحصول على مجموعات صور متطابقة مع مجموعات الصور التي تم التقاطها سابقاً. بعد الحصول على الصور، اترك الفأر ليتعافى ثم أعِده إلى قفصه كما في السابق، وتُستخدم صورة للنمط الوعائي المحيط بمنطقة الجمجمة الرقيقة المحددة كخريطة أولى كمرجع لجميع جلسات التصوير اللاحقة. يشير المربع الأسود إلى المنطقة التي تم فيها التقاط صور حية باستخدام مجهر الفوتونين.يُشار إلى هذه الصورة للتفرعات الشجيرية في القشرة الحركية لفأر يبلغ من العمر شهراً واحداً باسم الخريطة الثانية. يوضح المربع الأبيض الجزء الشجيري الذي تم اختياره للتصوير. وبمرور الوقت، تم إجراء تصوير ثنائي الفوتون لنفس الجزء الشجيري في اليوم صفر، واليوم الثاني، واليوم الرابع، واليوم الثامن.الأشواك حديثة التكوين؛ أي الأشواك التي لم تكن موجودة في جلسة التصوير السابقة، يشار إليها برؤوس السهام. أما الأشواك التي تمت إزالتها بين جلسات التصوير فيشار إليها بالسهام. ويشار إلى الأقدام الناتئة (Podia) بالنجوم بمجرد نضجها.يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون ساعة إلى ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

two-photon-vivo-imaging-dendritic-spines-mouse-cortex-using-thinned

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

في هذا الفيديو والمواد التكميلية ، وتبين لنا بروتوكول...

مزمنة التصوير ماوس القشرة البصرية باستخدام إعداد ضعفت - الجمجمة

نقدم وسيلة لتشكيل نافذة التصوير في جمجمة الفأر الذي يمتد ملليمتر وغير مستقرة لشهور دون التهاب في الدماغ. هي مناسبة تماما هذه الطريقة لدراسات طولية من تدفق الدم، وديناميات الخلوية، وخلية / بنية الأوعية الدموية باستخدام ثنائي الفوتون المجهري.

مصقول وعززت ضعيفة، جمجمة نافذة على المدى الطويل التصوير من مخ الفأر

من خلال الجمع بين ومصقول المقوى رقيقة الجمجمة (منافذ) الجمجمة وورم أرومي دبقي إطار حقن الخلايا (GBM)، يمكننا أن نلاحظ بدء دبقي والنمو من خلايا GBM حقن في دماغ فأر حي طوليا.

بدء تصوير دبقي<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; من خلال نافذة رقيقة الجمجمة ملمع وعززت القحف

المصدر: Pekarek, B. T., et. al., تصوير وقياس التشعبات العصبية السليمة عبر CLARITY Tissue Clearing. J. Vis. Exp. (2021) في هذا الفيديو ، نوضح إعداد وتصوير وتحليل دماغ الفأر الذي تم تطهيره لفحص العرش الشجيرية ومورفولوجيا العمود الفقري وتوزيع الخلايا العصبية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر وتقنيات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد.

التصوير المجهري متحد البؤر للأشجار المتغصنة السليمة ومورفولوجيا العمود الفقري في دماغ الفأر الذي تم تطهيره

يصف هذا المقال بروتوكول عمل لصورة العمود الفقري شجيري من الخلايا العصبية قرن آمون في المختبر باستخدام منظم الإضاءة مجهرية (SIM). فائقة الدقة باستخدام المجهر SIM توفر دقة وضوح الصورة بشكل كبير إلى أبعد من الحد حيود الضوء في جميع الأبعاد المكانية الثلاثة، والسماح للتصوير العمود الفقري شجيري الفردية مع تحسين التفاصيل.

التصوير شجيري العمود الفقري من الفئران الابتدائية الحصين الخلايا العصبية باستخدام منظم الإضاءة المجهر

يظهر هذا الفيديو إجراء بضع القحف الذي يسمح بالتصوير المزمن للخلايا العصبية في قشرة خلف الطحال للفأر باستخدام الفحص المجهري للفوتون في الجسم الحي في الخط المعدل وراثيا Thy1-GFP. يتم الجمع بين هذا النهج مع حقن الفيروس المرتبط بالغدة المعبر عن mCherry في الحصين الظهري. تسمح هذه التقنيات بمراقبة طويلة الأمد للدونة الهيكلية المعتمدة على الخبرة في RSC.

في وقت واحد ثنائي الفوتون<em&gt; في فيفو</em&gt; تصوير متشابك المدخلات والأهداف بعد المشبكي في اللحاء ماوس خلف الطحال

تصف هذه الطريقة إعداد مزمن يسمح بالوصول البصري إلى الحصين من الفئران الحية. ويمكن استخدام هذا الإعداد لأداء التصوير البصري الطولي من اللدونة الهيكلية العصبية واللدونة الخلوية التي تثير النشاط على مدى عدة أسابيع.

التصوير الطولي اثنين من الفوتون من CA1 فرس النهر الأورسيال في الفئران الحية

يتم تطبيق المجهر الإلكتروني التسلسلي لمسح الوجه الكتلي (SBEM) على صورة وتحليل العمود الفقري التشجر في قرن آمون مورين.

المسلسل كتلة الوجه المسح المجهري الإلكترون (SBEM) لدراسة العمود الفقري Dendritic

هنا ، نصف بروتوكولا يجمع بين حقن الفيروس المرتبط بالغدي وزرع نافذة الجمجمة للتصوير المتزامن لديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة والنشاط العصبي في الفئران المستيقظة.

التصوير المتزامن لديناميات الخلايا الدبقية الصغيرة والنشاط العصبي في الفئران المستيقظة

يحتوي هذا البروتوكول على وصف شامل لنهج خطوة بخطوة لنموذج فأر نافذة جمجمة مزمنة وميكروفوعية وعائية محسن للتصوير بمجهر ثنائي الفوتون في الجسم الحي باستخدام مجهر بوليسترين فلوري.

نموذج الفأر للانسداد الميكروأوعية الدموية للمجهر ثنائي الفوتون في الجسم الحي باستخدام مجهر البوليسترين الفلورية

تعلم تقنية التصوير ثنائي الفوتون عبر الجمجمة للهياكل المشبكية المُصبغة في قشرة الفأر الحي باستخدام تحضير الجمجمة الرقيقة. تتيح هذه الطريقة مراقبة ديناميكيات الأشواك الشجيرية بمرور الوقت.

ثنائي الفوتون

استكشف المزيد من الفيديوهات