ثنائي الفوتون في الجسم الحي التصوير من العمود الفقري شجيري في اللحاء باستخدام الماوس الجمجمة ضعفت إعداد

الهدف العام من هذا الإجراء هو السماح بالتصوير عبر الجمجمة ، وهو عبارة عن هياكل متشابكة مصنفة بالفلورسنت في قشرة الفأر الحية بواسطة اثنين من المجهريات الفوتونية. الخطوة الأولى بعد تخدير الفأر هي إجراء إعداد جمجمة ضعيفة. بعد ذلك ، يتم تثبيت رأس الماوس باستخدام لوحة تثبيت مخصصة.

ثم يتم الحصول على مكدسات الصور من خلال الجمجمة الرقيقة باستخدام منظارين مجهريين فوتونيين. في النهاية ، الانتقال والتصوير. سمحت المنطقة المصورة مسبقا بتتبع ديناميكيات العمود الفقري الشجيري على مدى فترات زمنية مختلفة في ظل ظروف مختلفة.

للتحضير للجراحة ، قم بتخدير الفأر بالكيتامين والزيلازين وقم بإجراء قرصة إصبع القدم لضمان التخدير الكامل. ثم ضع الماوس على وسادة تدفئة واستخدم شفرة حلاقة لحلق الرأس. امسح الجلد بضمادات كحولية متناوبة لتعقيم المنطقة المحلوقة وإزالة أي قصاصات شعر متبقية.

أيضا ، ضعي مرهم العين برفق على كلتا العينين. بعد ذلك ، قم بعمل شق مستقيم على طول خط الوسط لفروة الرأس وحرك الجلد بشكل جانبي نحو حواف الجمجمة. ثم قم بإزالة النسيج الضام المتصل بالجمجمة لبدء تحضير الجمجمة الرقيقة.

أولا ، حدد منطقة التصوير المطلوبة بناء على موقعها النسبي لخط الوسط و bgma. ثم بلل الجمجمة بالمحلول الملحي لمراقبة الأوعية الدموية لتجنب ترقق الجمجمة في منطقة بها أوعية دموية كبيرة لأنها تمنع تغلغل الضوء وتطمس هياكل الصورة. بمجرد تحديد مساحة قطرها من 0.5 إلى ملليمتر واحد ، استخدم مثقابا صغيرا عالي السرعة لتخفيف منطقة دائرية من الجمجمة.

حرك المثقاب بالتوازي مع سطح الجمجمة بدلا من تثبيته على الجمجمة والضغط لأسفل لمنع التلف الناجم عن ارتفاع درجة الحرارة. تجنب التلامس المطول بين لقمة الحفر ومثقاب الجمجمة حتى تتم إزالة كل من الطبقة العظمية الخارجية المدمجة وطبقة العظام الإسفنجية الوسطى. بعد ذلك ، استخدم شفرة جراحية مجهرية مثبتة عند 45 درجة تقريبا لتخفيف الطبقة العظمية الداخلية المدمجة في وسط المنطقة الرقيقة للحفر.

اكشط الجمجمة دون الضغط على الجمجمة حتى يتم الحصول على منطقة رقيقة بشكل متساو من 200 إلى 300 ميكرومتر بسمك حوالي 20 إلى 30 ميكرومتر. بمجرد ترقق الجمجمة بشكل كاف ، قم بإزالة بقايا العظام بعناية. الخطوة التالية هي إرفاق لوحة الرأس ، المصنوعة من شفرات الحلاقة ذات الحواف الحادة المغطاة بالأشرطة.

ابدأ بوضع قطرة صغيرة من غراء cyanoacrylate على كل حافة من الفتحة المركزية للوحة الرأس. ثم توسيط لوحة الرأس على المنطقة الرقيقة. امسكها بإحكام على الجمجمة.

الآن ، اسحب الجلد برفق من جانبي الجمجمة إلى حواف الفتحة المركزية للوحة الرأس. امسك لوحة الرأس في مكانها لمدة دقيقة إلى دقيقتين. ثم انتظر ثماني إلى تسع دقائق أخرى حتى يتم ربط صفيحة الرأس جيدا بالجمجمة.

بعد 10 دقائق ، ضع لوحة الرأس على الكتلتين الجانبيتين للوحة الإمساك. بعد ذلك ، قم بإحكام ربط البراغي على حواف لوحة الرأس لتثبيت الماوس على لوحة الإمساك. انظر إلى رأس الفأر من خلال مجهر تشريح أثناء حشو ظهر الماوس برفق للتأكد من أن الرأس قد تم تجميده بشكل صحيح.

بعد ذلك ، شطف الجمجمة المكشوفة بالمحلول الملحي لإزالة أي غراء غير مبلمر من أجل نقل المنطقة المصورة مسبقا. في جلسات التصوير اللاحقة ، التقط صورة للأوعية الدموية للمنطقة الرقيقة من الجمجمة المكشوفة ، والتي تم تعيينها خريطة واحدة. ثم ضع الماوس تحت مجهر التصوير وحدد موقع المنطقة الرقيقة أسفل هدف الهواء 10 ×.

باستخدام مضان epi ، انقل أنحف منطقة إلى مركز العرض. أضف الآن قطرة من المحلول الملحي إلى الجزء العلوي من الجمجمة وانتقل إلى الهدف 60 ×. حدد منطقة يتم فيها تصور العمود الفقري الشجيري الفردي بوضوح على طول التشعبات.

حدد المنطقة المقابلة وتسميتها على الخريطة الأولى من خلال مقارنة الأوعية الدموية بين عرض الفلورسنت epi وصورة الأوعية الدموية. بعد ذلك ، قم بضبط الطول الموجي ليزر الفوتون وفقا لأربعة الفلورو. ثم باستخدام هدف 60 × الحصول على مكدسات الصور بخطوتين ميكرومتر على طول المحور Z ، تغطي مساحة 200 ميكرومتر × 200 ميكرومتر تقريبا.

تم تعيين هذا على أنه الخريطة الثانية ويستخدم لنقل الجزء المتغصني للصورة أثناء جلسات التصوير اللاحقة. احصل الآن على تسع مجموعات صور داخل الخريطة الثانية باستخدام ثلاثة x تقريب رقمي. تغطي كل مجموعة صور مساحة تقريبية تبلغ 70 ميكرومتر × 70 ميكرومتر مع خطوات 0.7 ميكرومتر على طول المحور Z.

بعد التصوير ، افصل لوحة الرأس برفق عن الجمجمة. بعد ذلك ، استخدم شفرة جراحية مجهرية لإزالة الغراء المتبقي من الجمجمة. ثم اشطف الجمجمة والجلد بالمحلول الملحي عدة مرات وخياطة فروة الرأس بخيوط جراحية معقمة.

أثناء الشفاء ، احتفظ بالحيوان على وسادة تدفئة في قفص منفصل وقم بإعطاء مسكن البوبرينورفين تحت الجلد لألم ما بعد الجراحة. بعد الشفاء التام ، أعد إلى مقياس المنزل لإعادة تصوير التشعبات في يوم آخر ، تخدير وفضح الجمجمة. كما كان من قبل ، كرر تثبيت الرأس عن طريق تركيب لوحة الرأس وتثبيتها بلوحة الإمساك.

ثم حدد موقع المنطقة المصورة مسبقا من خلال مقارنة نمط الأوعية الدموية بتعيين واحد ونمط الفرع الشجيري لتعيين اثنين. إذا تم إجراء إعادة التصوير في غضون أسبوع واحد ، فيمكن إزالة الطبقة الرقيقة من العظام المزروعة حديثا بشفرة جراحية مجهرية. إذا تم إجراء إعادة التصوير بعد أكثر من أسبوع ، فاستخدم أولا المثقاب الدقيق ، ثم الشفرة المجهرية لتخفيف الجمجمة.

الآن اضبط الموضع والاتجاه تحت مجهر الفوتون للحصول على مكدسات الصور التي تتطابق مع مكدسات الصور التي تم التقاطها مسبقا. بعد الحصول على الصور ، اسمح للفأر بالتعافي وإعادته إلى قفصه كما كان من قبل ، ويتم استخدام صورة لنمط الأوعية الدموية المحيط بمنطقة الجمجمة الرقيقة المحددة على أنها خريطة واحدة للإشارة إلى جميع جلسات التصوير اللاحقة. يشير المربع الأسود إلى المنطقة التي تم فيها الحصول على صورتين فوتونين في الجسم الحي.

تم تعيين هذه الصورة للفروع المتغصنة في القشرة الحركية لفأر يبلغ من العمر شهرا واحدا على أنها الخريطة الثانية. يظهر المربع الأبيض الجزء الشجيري المحدد للتصوير. بمرور الوقت ، تم إجراء تصويرين فوتونيين لنفس الجزء الشجيري في اليوم صفر ، واليوم الثاني ، واليوم الرابع ، واليوم الثامن.

أشواك المشكلة حديثا. أي أن العمود الفقري الذي لم يكن موجودا في جلسة التصوير السابقة يتم عرضه بواسطة أشواك رأس السهم التي تم التخلص منها بين جلسات التصوير بواسطة الأسهم. يشار إلى فيليب بوديا بالنجوم بمجرد إتقانه.

يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ساعة إلى ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.