مراقبة وظائف والصرف من الأوعية الدموية تجنيده من قبل العوامل التي يفرزها الخلايا المولدة للورم النمو السريع

نصف مقايسة matrigel لتوضيح إمكانات تولد الأوعية الدموية لمجموعة من العوامل التي تفرزها الخلايا السرطانية باستخدام طريقتين للتصوير التكميلي ، الموجات فوق الصوتية والفحص المجهري. يتم استخدام matrigel ، وهو هلام مقلد خارج الخلية (ECM) ، لإدخال المضيف (الفأر) بعوامل الأوعية الدموية التي تفرز في الوسائط التكييف (CM).

الهدف العام من التجربة التالية هو استخدام الموجات فوق الصوتية والفحص المجهري الداخلي لتوضيح إمكانات الأوعية الدموية لمجموعة من العوامل التي تفرزها الخلايا السرطانية. يتم تحقيق ذلك عن طريق زرع سدادة أولا لتوليد بيئة شبيهة بالورم في الفأر في حالة عدم وجود خلايا سرطانية. بعد ذلك ، يتم تقييم كثافة الأوعية الدموية والنسبة المئوية للأوعية الدموية الوظيفية داخل السدادة.

في الخطوة الأخيرة ، يتم تصور مورفولوجيا الأوعية الدموية. في النهاية ، يمكن تقييم التوازن بين العوامل المؤيدة والمضادة لتولد الأوعية التي تفرزها الخلايا وتأثيراتها على تكوين الأوعية الدموية بشكل حيوي وفي نقاط زمنية مختلفة من خلال طريقتي التصوير التكميليتين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل مقايسة سدادة matrigel التقليدية ، هي أنها تسمح بتحليل مجموعة من العوامل التي تفرزها الخلايا مع استخدام طرق التصوير التكميلية داخل الحيوية.

لإثبات هذا الإجراء ، ستدير طلاب الدكتوراه F Andra من مختبري لاستخدام الموجات فوق الصوتية لتقييم المصفوفة خارج الخلية أو ECM ، تبدأ الأوعية الدموية بوضع أنبوب einor سعة 1.5 مليلتر يحتوي على 80 ميكرولترا من الوسائط المكيفة المعدة حديثا على الجليد. أصعب جزء في الإجراء هو حقن الجل بدون فقاعات باستخدام أطراف مثلجة. سيضمن الخلط اللطيف والحقن البطيء إدارة الهلام المثلى.

ثم باستخدام أطراف مثلجة باردة 1000 ميكرولتر ، امزج 600 ميكرولتر من الثلج البارد أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. تم إذابة ECM الجل المقلد في وسائل الإعلام مع الحرص على عدم تكوين فقاعات. بعد التأكد من التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم ، احلق بطن كل فأر واستخدم حقنة مثلجة سعة مليلتر واحدة مجهزة بإبرة قياس 27 ببطء تحت الجلد.

حقن محتويات أنبوب EEND DPH واحد لكل. بمجرد إدارة الحجم بالكامل ، أمسك الإبرة في مكانها لعدة دقائق حتى يحدث التصلب. بعد ثلاثة أسابيع ، احلق منطقة البطن من الفئران مرة أخرى ، وقم بإزالة أي شعر زائد باستخدام كريم إزالة الشعر ، ثم ثبت الفئران في وضع ضعيف على مرحلة المناور الدقيق.

بعد ذلك ، املأ حقنة سعة مليلتر واحد مزودة بإبرة قياس 30 بمحلول ملحي. ثم ضع الإبرة داخل الوريد الذيل. ثبت الإبرة بإحكام وفك المحقنة.

الآن ضع محول الطاقة في منتصف منطقة المسح المطلوبة وانقر فوق 3D لتهيئة مرحلة المحرك ثلاثي الأبعاد. انقر فوق 3D. مرة أخرى ، أدخل مسافة المسح وحجم الخطوة واضغط على المسح الضوئي.

تأكد من أن القابس بأكمله قد تم مسحه ضوئيا في بيانات الصورة ثلاثية الأبعاد المعروضة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاضبط محول الطاقة بحيث يكون القابس بأكمله مرئيا وامسح المنطقة مرة أخرى كما هو موضح للتو. بعد ذلك ، حدد التباين واضبط تعويض كسب الوقت أو عناصر التحكم في tgc لتغميق الصورة ، استخدم خلاط قارورة لتنشيط الفقاعات الدقيقة لمدة 45 ثانية.

ثم اخلطي 50 ميكرولترا من الفقاعات الدقيقة مع 50 ميكرولترا من المحلول الملحي في حقنة سعة مليلتر واحد. استبدل المحلول الملحي الذي يحتوي على حقنة مفكوكة بالمحقنة التي تحتوي على الفقاعات الدقيقة المنشطة وحقن الفقاعات الدقيقة المخففة في وريد الذيل لكل فأر. انتظر بضع ثوان حتى تصل الفقاعات إلى حالة مستقرة ثم انقر فوق 3D وحدد مسح للحصول على 3D.

صور محسنة للتباين. انقر فوق متجر رأي لحفظ بيانات الصورة ، ثم حدد 3D وتدمير 3D. لتدمير الفقاعات الدقيقة ، انقر فوق 3D مرة أخرى وحدد مسح للحصول على حلقة cena بعد التدمير

ثم انقر على مشاهدة متجر مرة أخرى. بعد ذلك في إعدادات المرجع، انقر فوق إنشاء مرجع، ثم حدد إدارة الدراسة. لفتح حلقة cena قبل التدمير

الآن انقر فوق عملية cena لإنشاء تراكب تباين أخضر. ثم حدد التحميل في 3D في برنامج التصوير بالموجات فوق الصوتية. بعد ذلك ، انقر فوق إعدادات الوضع ، وانقر فوق مستوى الصوت وحدد متوازي.

ثم قم بتقسيم سلسلة من الخطوط لإنشاء حجم ثلاثي الأبعاد للأنسجة المستهدفة وانقر فوق النهاية لإكمال التجزئة. لاستخدام الفحص المجهري الداخلي متحد البؤر الليفي لتقييم مورفولوجيا الأوعية الدموية لسدادة الهلام المقلدة ECM ، قم بحقن 200 ميكرولتر من 10 ملليغرام لكل مليلتر ، ويناسب ديكستران المسمى C في وريد الذيل لكل تجريبي. ثم ضع شقا صغيرا على بعد سنتيمتر واحد تقريبا من القابس وضع مسبار المجهر الداخلي برفق فوق القابس مع الحفاظ على القابس سليما.

بمجرد وضع المسبار في مكانه ، استخدم دواسة القدم للضغط على بدء الليزر. بمجرد ظهور التألق على الشاشة ، اضغط على تحديد بدواسة القدم للحصول على أفلام قصيرة تصل إلى 32 بين الأفلام ، اغسل طرف المسبار في أنبوب يحتوي على الماء. عند الانتهاء من التصوير ، قم بتنظيف الطرف بقطعة قطن لتحليل متوسط قطر الوعاء.

بعد ذلك ، انقر فوق اكتشاف السفن الصغيرة لفتح نافذة وحدة الكشف عن السفن وانقر فوق التفضيلات. تأكد من أن متوسط قطر الوعاء في الإحصاء الفائد. يتم وضع علامة على أشرطة الرسم البياني للنافذة والعرض في وضع العرض.

انقر فوق اكتشاف لعرض القياسات المحددة. لتحليل شدة إشارة الفلورسنت في المناطق المجاورة للأوعية الدموية ، حدد إنشاء عائد استثمار دائري وإنشاء دائرة في منطقة الاهتمام. أخيرا ، حدد حساب الرسم البياني ضمن عائد الاستثمار لحساب القيم المتعلقة بالمنطقة المحاطة بالدائرة.

هنا يتم الكشف عن التوظيف المكثف للأوعية الدموية الوظيفية داخل سدادات متوسطة التحميل مكيفة U 87 mg من خلال التصوير بالموجات فوق الصوتية المعزز بتباين الفقاعات الدقيقة. على العكس من ذلك ، داخل المقابس التي تحتوي على وسط مكيف من الخلايا المولدة للورم الخاملة ، لا يمكن اكتشاف تدفق الدم تقريبا. يتم التأكيد على مورفولوجيا هذه الأوعية الدموية المشكلة حديثا من خلال الفحص المجهري الداخلي متحد البؤر الليفي للأوعية بعد إعطاء ديكستران المناسب كما هو موضح في هذه الصور التمثيلية ، لاحظ كيف تظهر الأوعية الدموية داخل المقابس المحملة بالوسط المكيف U 87 mg مورفولوجيا الأوعية الدموية المتضخمة المتسربة الحادة.

الأوعية الدموية المتضخمة والمتشابكة للغاية أيضا تدفقا غير مستمر وبطيئا ويلاحظ تسرب الدم في المنطقة المحيطة بالإضافة إلى إشارة الفلورسنت العالية الواضحة خارج الأوعية الدموية. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ساعات في عدة نقاط زمنية لتحسين حركية تكوين الأوعية.