فهم توالد المبكر باستخدام المبسطة

يتمثل الهدف العام من التجربة التالية في توضيح مكان تعبير جين معين داخل جنين سليم. ويتحقق ذلك عن طريق تثبيت الحمض النووي الريبوزي (RNA) المراد تحديد موضعه في مكانه داخل الجنين كخطوة ثانية. ثم يتم تهجين مسبار RNA مضاد للمعنى (antisense RNA probe) خاص بالجين المستهدف مع الـ RNA المستهدف داخل الجنين.

يحتوي هذا المسبار على إيبيتوب (epitope)، وعادةً ما يكون ديغوجينين (digogenin)، والذي يمكن اكتشافه لاحقاً. بعد ذلك، يتم تهجين جسم مضاد مقترن بإنزيم الفوسفاتاز القلوي مع الإيبيتوب الموجود على مسبار RNA، ويتبع ذلك استخدام صبغة لونية. ومن أجل تصور مكان تموضع RNA داخل الجنين، يتم الحصول على نتائج تُظهر بدقة مكان تعبير الجين المستهدف بناءً على التفاعل اللوني والمعرفة بتشريح الجنين.

تكمن الميزة الرئيسية لبروتوكول معهدنا مقارنة بالبروتوكولات الموجودة في كونه أسرع ويستخدم كواشف أقل دون أي فقدان ملحوظ في الجودة. ويمكن لهذه الطريقة الإجابة على أسئلة جوهرية في علم الأجنة، مثل كيفية تحديد الأنسجة وتشكيل أنماطها. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول تطور opus، إلا أنه يمكن استخدامها أيضاً للعديد من الأجنة الصغيرة الأخرى، مثل أجنة zebrafish وأجنة الفئران في مراحلها المبكرة.

بدأنا أولاً في تطوير هذه الطرق لأن الطرق الأصلية كانت تستغرق وقتاً طويلاً، لذا شرعنا في تجربة حذف خطوات Ed لزيادة كفاءة الإجراء دون المساس بالجودة. يتم إجراء تثبيت الأجنة على مراحل؛ أولاً، قم بتجهيز القوارير الزجاجية التي ستُستخدم في جميع الخطوات، بما في ذلك التخزين النهائي للأجنة، وذلك للسماح بمراقبة الأجنة خلال كافة مراحل العملية.

استخدم قوارير شفافة ذات سدادة تيفلون (Teflon) محكمة في الغطاء، وقم بتسمية القوارير باستخدام قلم تحديد دائم بالمعلومات التجريبية المناسبة. غطِّ الملصق بشريط لاصق شفاف لمنع فقدان البيانات المكتوبة خلال سير الإجراء. ونظراً لاستخدام الكحوليات والمذيبات الأخرى، قم بتحضير محلول تثبيت MFA كما هو موضح في نص البروتوكول.

املأ كل قارورة زجاجية مُصنفة بثلاثة إلى أربعة مليليترات من محلول MFA. احفظ محلول ميثانول بتركيز 100% عند درجة حرارة 20- درجة مئوية. اصنع ماصة زجاجية مقطوعة واستخدمها لنقل الأجنة إلى القوارير الزجاجية التي تحتوي على محلول ميمفيس للتثبيت.

أضف الأجنة مع نقل أقل كمية ممكنة من سائل وسط الأجنة. قم بتثبيت ما لا يزيد عن 20 إلى 30 جنيناً في كل أنبوبة. اترك الأجنة في محلول Memphis لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة على جهاز هزاز.

عند الانتهاء من التثبيت باستخدام البارافورمالدهيد، استبدل محلول ميمفيس بنحو 4 mL من الميثانول 100% المبرد عند -20 °C لتخزين الأجنة قبل تجميع تفاعل تخليق المسبار، واترك مزيج DNA والماء و NTP والمنظم البوليميرازي ليدفأ حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة. تعد عملية تجميع تفاعل المسبار بشكل صحيح إحدى أهم الخطوات لضمان نجاح هذا الإجراء.

قم بتجميع تفاعل تخليق المسبار في درجة حرارة الغرفة. أضف المكونات التالية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر بهذا الترتيب: DNA القالب، والماء بحيث يتم ضبط الحجم ليصل الحجم الإجمالي للتفاعل إلى 20 ميكرولتر، ومزيج NTP، ومثبط RNA، ومحلول RNA polymerase المنظم، وRNA polymerase. ثم قم بحضن تفاعل النسخ لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية.

لا تؤدي عمليات التحضين التي تزيد مدتها قليلاً عن ساعتين إلى آثار سلبية، ولكنها أيضاً لا تظهر زيادة كبيرة في الإنتاجية؛ أما إذا تمت عملية التحضين لمدة ساعة واحدة، فستنخفض الإنتاجية، رغم أنها ستظل كافية لتصنيع مسبار جيد. عند اكتمال تفاعل النسخ، اسحب ميكرولتر واحد من خليط التفاعل للتحقق منه بواسطة هلام TAE بتركيز 1%aros. أضف خليط التفاعل المتبقي إلى...

أضف 80 µL من 1%SDS في محلول TE المنظم، و10 µL من خلات الأمونيوم بتركيز خمسة مولار، و220 µL من الإيثانول البارد. قم برج الخليط بقوة باستخدام جهاز Vortex واتركه على الثلج حتى تظهر نتائج فحص جودة RNA. بعد إضافة الماء وصبغة التحميل القياسية إلى 1 µL من RNA الذي تم سحبه قبل الترسيب، قم بتشغيل RNA على هلام agarose بتركيز 1% وTAE يحتوي على بروميد الإيثيديوم.

افحص الحمض النووي الريبوزي (RNA) المسمى ببروميد الإيثيديوم على الهلام باستخدام جهاز التصوير بالأشعة فوق البنفسجية (UV light transluminator) للتحقق من جودة المسبار. يجب أن تظهر حزمة واحدة فقط دون وجود تلطخ فوقها أو تحتها. وبمجرد التحقق من جودة الـ RNA، قم بترسيب كمية الـ RNA المتبقية التي كانت محفوظة على الثلج عن طريق الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي دقيق (micro centrifuge) بالسرعة القصوى لمدة 10 إلى 15 دقيقة.

أزل الطافي باستخدام ماصة زجاجية مسحوبة واترك الحمض النووي الريبوزي RNA ليجف لفترة وجيزة. بعد ذلك، يتم إعادة تعليق المسبار في محلول تهجين RNA ويُحفظ في أنبوب بولي ستيرين سعة 15 milliliter بغطاء لولبي عند درجة حرارة minus 20 degrees Celsius. لبدء هذا الإجراء، استخرج الأجنة التي تم تخزينها في ميثانول عند درجة حرارة minus 20 degrees Celsius واتركها لتصل إلى درجة حرارة الغرفة.

تُجرى العملية بأكملها في قوارير زجاجية. وإذا كانت الأجنة المختلفة من مجموعة واحدة ستُفحص باستخدام مسابر مختلفة، فيجب الاحتفاظ بها في قارورة واحدة حتى لحظة إضافة المسابر مباشرةً. ولتقليل التباين والجهد في اليوم الأول تمهيداً لإضافة المسبار، قم بإعادة ترطيب الأجنة عبر سلسلة من الميثانول كما هو موضح في هذا الجدول، واستخدم ماصات زجاجية لإزالة وإضافة كل محلول بعناية، حيث يمكن أن تتعرض الأجنة للتلف بسهولة خلال هذه الخطوة.

عند نقل السوائل، افحص الجزء الداخلي من الأغطية للتأكد من عدم احتباس الأجنة هناك. قم بتدوير الأجنة بلطف بعد كل عملية تغيير لضمان عدم التصاقها بالجوانب أو ببعضها البعض. وقم بهز الأجنة عن طريق تثبيت القوارير على جهاز هزاز (mutator) قبل الاستخدام، ويجب تسخين محلول تهجين RNA والمسبار مسبقاً إلى 65 °C.

أجرِ تهجين الأجنة في محلول المسبار طوال الليل مع الهز عند 65 °C في اليوم التالي. قم بإزالة محلول المسبار وحفظه في أنبوب بوليسترين بسعة 15 milliliter ذي غطاء لولبي، مع تدوين التاريخ وعدد مرات استخدام المسبار. يُحفظ محلول المسبار عند -20 °C.

بمجرد إزالة المسبار، قم بتحضير الأجنة لصبغ الأجسام المضادة ضد المسبار من خلال سلسلة من عمليات الغسل كما هو موضح هنا، وقم بتغيير درجة الحرارة حسب الحاجة عن طريق نقل جهاز التحريك مع قوارير الأجنة المتصلة به مباشرة إلى أفران التهجين المضبوطة على درجة الحرارة المناسبة. وأثناء فترة تحضين الأجنة في محلول الحجب، قم بتحضير الحجم المناسب من محلول الحجب مضافاً إليه الجسم المضاد anti-D dig بحيث يتم حجب الجسم المضاد قبل إضافته إلى الأجنة. حضّن الأجنة في محلول الأجسام المضادة طوال الليل مع التحريك عند درجة حرارة 4 °C في اليوم التالي.

قم بإزالة محلول الأجسام المضادة واغسل باستخدام mab، وهو محلول يحتوي على حمض الماليك وكلوريد الصوديوم. قم بإجراء عمليات غسيل لمدة 1230 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة مع التقليب المستمر. استبدل محلول الغسيل الأخير بركيزة الفوسفاتاز القلوي.

قم بإجراء تفاعل الصبغ في درجة حرارة الغرفة مع الرج طوال الليل حتى اليوم التالي. أوقف تفاعل الصبغ وجهز الأجنة للتخزين والتصوير عن طريق تغيير السوائل كما هو موضح في هذا الجدول. بعد إعادة ترطيب الأجنة، قم بتثبيت الصبغة باستخدام MFA لمدة 30 دقيقة.

بمجرد التثبيت، قم بإزالة MFA واغسل الأجنة باستخدام 25%methanol. إذا كانت هناك حاجة لإزالة الصبغة الداخلية، فقم بإزالة 25%methanol وأضف محلول التبييض. راقب عملية التبييض عن كثب لأنها تحدث بسرعة نسبيًا، ويمكن تغيير درجة التبييض لتحقيق تأثيرات مختلفة.

للتخزين طويل الأمد، يتم تجفيف الأجنة من خلال سلسلة من الميثانول وصولاً إلى 100% methanol، أما للتخزين قصير الأمد والتصوير اللاحق، فبعد عملية التبييض يتم نقل الأجنة إلى PBS. يفضل فحص وتصوير الأجنة غير المصفاة على خلفية من aros بتركيز 1%. لتحضير محلول aros، يُضاف aros إلى الماء ويُغلى حتى يذوب aros تماماً في المحلول. وبعد أن يبرد aros إلى 50 degrees Celsius، يُصب في طبق بتري بعمق يصل إلى حوالي مليمتريْن.

عندما يصبح طبق aros جاهزاً، ضع الأجنة غير المصفاة في الطبق وابدأ عملية التصوير. يوفر aros خلفية باللون الرمادي المزرق تتباين بشكل جيد مع الجنين واللون الأزرق الناتج عن تفاعل الصبغ. كما يساعد أيضاً في تشتيت الظلال والانعكاسات المشتتة التي قد تصرف الانتباه عن الجنين، وذلك لتصوير الجنين من زوايا بديلة، مثل الجانب البطني.

استخدم ملاقط دقيقة لإجراء شقوق في الحلقات لتناسب الجنين. ضع الأجنة في تلك القنوات للتوجيه. توخَّ الحذر عند التعامل مع الأجنة لأنها عرضة للتلف بسهولة.

استخدم مصدر الضوء بالألياف الضوئية لإضاءة الجنين من زاوية ضحلة، مما يؤدي إلى تكوين ظلال على الجنين تمنح الصورة عمقاً وتساعد في تمييز البنى السطحية، وذلك لأن التبييض يمكن أن يزيل الصبغة التي توفر علامات استدلالية مفيدة. استخدم تقنية التظليل للأجنة التي تعرضت لتبييض قوي. وتُستخدم الأجنة المصفاة لتصوير الصبغات الموجودة في عمق الجنين، كما هو الحال في الحبل السري، أو الرئة، أو مناطق الدماغ.

في هذا البروتوكول، تُستخدم مستويات مختلفة من التبييض لتصوير الصبغ في الجنين. إذا كان الصبغ قوياً، فإن التبييض الخفيف الذي يترك بعض الصبغات يتيح تحديداً أفضل لمرحلة الجنين وتوجهه. ومع ذلك، إذا كان الصبغ في منطقة ذات مستويات عالية من التصبغ مثل الكلية، فإن التبييض الأكبر يعطي نتيجة أفضل.

يمكن أن تساعد معالجة قاعدة الـ ARO في توجيه الجنين. فعلى سبيل المثال، من خلال قطع قناة دقيقة في الـ aros، يمكن عرض جنين في مرحلة الشرغوف يكون مستلقياً على جانبه من الجهة البطنية مع استقرار كافٍ لالتقاط صورة جيدة. لقد وُضع هذا الجنين في ثقب صغير عمل على تثبيت موضعه بحيث تكون الجهة البطنية للأعلى، مما أتاح رؤية كاملة لنمط تعبير الجين المستهدف.

يمكن رؤية الأعضاء الداخلية في كل من الأجنة غير الشفافة والشفافة، حيث يظهر الجنين غير الشفاف المصبوغ لـ PAX two. في المرحلة 34، يمكن تصور السويقة البصرية وكذلك الأنبوب العصبي. ومع ذلك، لا تكون التفاصيل دقيقة؛ ومن خلال جعل الجنين شفافاً، تصبح حدود مواقع التعبير، بما في ذلك السويقة البصرية، أكثر وضوحاً.

يظهر مدى الشفافية من خلال القدرة على رؤية كلتا العينين في هذا الجنين. ومع ذلك، فإن إحدى المشكلات الشائعة في الأجنة الشفافة هي تراكم بعض الصبغات في التجويفات الداخلية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك تصور جيد عن كيفية إجراء تهجين موضعي كامل (whole mount in situ) بسرعة وبكمية أقل من الكواشف والتقاط صور عالية الجودة.