-سهلت صوتنة المناعي تلطيخ المرحلة الجنينية في وقت متأخر من اليرقات و ذبابة الفاكهة الأنسجة في الموقع

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور أو إشباع الأنسجة في C two باستخدام الفحص المجهري الفلوري بعد الصوتنة. يتم تحقيق ذلك عن طريق جمع العينات الجنينية واليرقات أولا ثم تثبيتها باستخدام الفورمالديهايد والهيبتان والميثانول. الخطوة الثانية هي صوتنة العينة الثابتة من أجل إزالة البشرة للسماح باختراق الجسم المضاد.

بعد ذلك ، العينة عبارة عن صبغة مناعية مع أجسام مضادة ثانوية أولية وفلورية. الخطوة الأخيرة هي تركيب العينة في محلول أنتيفا قائم على الجلسرين. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر أو epi لتصور الأنسجة النامية بالإضافة إلى التعبير عن البروتين وتوطينه.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الأخرى مثل تشريح الأنسجة ، هي أنها تسمح بتصور مجموعة متنوعة من الأنسجة النامية. بشكل عام ، سوف يكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن خطوة الصوتنة تعتمد على عدد من العوامل لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة ، بما في ذلك الوضع المناسب لمسبار الصوتية. سيظهر الإجراء آشلي فيدلر ولورين بول ، وهما باحثان جامعيان موهوبان من مختبري.

لبدء التجربة ، قم بإزالة الأجنة التي تم جمعها بعناية على صفيحة أجار باستخدام فرشاة طلاء صغيرة مربوطة بمحلول الفوسفات العازل Triton X 100 أو PBTX. بعد ذلك ، امسح فرشاة الرسم المحملة بالعينة على التلال الداخلية المواجهة لمصفاة الخلية. ضع غطاء طبق بتري أسفل مصفاة الخلية.

ثم اشطف فرشاة الرسم وجدران مصفاة الخلية بزجاجة بخ تحتوي على PBTX. بعد نقل العينة إلى المصفاة ، اسكب ما يكفي من PBTX في المصفاة لرفع العينة عن الشبكة. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات لإزالة الخميرة ونفايات الذباب ، وإزالة PBTX.

ثم صب محلول التبييض بنسبة 50٪ في المصفاة واترك اليرقات تجلس في المحلول لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة المحلول. ثم اغسل العينة باستخدام PBTX واترك العينة في المحلول لمدة ثلاث دقائق.

كرر الخطوة خمس مرات ، وجفف الجزء السفلي من مصفاة الخلية. ثم استخدم فرشاة رسم مربوطة ب PBTX لنقل العينة إلى قارورة تلألؤ تحتوي على 1.75 مل من البيم. في غطاء الدخان ، أضف 250 ميكرولتر من 37٪ فورمالديهايد وثمانية ملليلتر من درجة الكاشف.

هبتان إلى قارورة التلألؤ ، ورج القارورة على 200 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة. ثم أضف 10 مل من الميثانول إلى قارورة التلألؤ دون إزالة المرحلة المائية ورجها بقوة عند 500 دورة في الدقيقة. بعد الاهتزاز ، اسكب المحتويات على الفور في مصفاة خلية فوق حاوية نفايات سائلة.

أضف المزيد من الميثانول إلى القارورة وقم بتشغيل المحتويات من خلال مصفاة الخلية. لضمان إزالة العينة بأكملها. جرب الجزء السفلي من مصفاة الخلية بأنسجة المختبر.

ثم ضع فرشاة رسم لنقل العينة من المصفاة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على 0.5 مل من الميثانول. انتظر حتى تستقر العينة. ثم قم بإزالة الميثانول بماصة واستبدله بكمية جديدة من الميثانول سعة 0.5 ملليلتر.

كرر هذه الخطوة ثلاث مرات وأضف 0.5 ملليلتر أخير من الميثانول إلى الأنبوب قبل تخزينه عند سالب 20 درجة مئوية. في وقت لاحق ، استخدم استرجع العينة المخزنة من الفريزر وقم بإزالة الميثانول باستخدام ماصة. ثم أضف ملليلترا واحدا من محلول عازلة فوسفات الميثانول بنسبة 50٪ أو محلول PBTW إلى الأنبوب ، وهز الأنبوب لمدة ثلاث دقائق.

بعد ذلك ، اشطف العينة بمليلتر واحد من PBTW مرتين للسماح للعينة بالاستقرار قبل سحب PBTW بماصة ، وأضف 1.0 مل من فوسفات ألبومين مصل الأبقار المخزن ، أو BBTW إلى القارورة ، وهزها لمدة ثلاث دقائق. اسمح للعينة بالاستقرار وإزالة BBTW باستخدام ماصة. كرر هذه الخطوة مرتين.

مع الحرص على إزالة أكبر قدر ممكن من BBTW دون فقد أي من العينة. ثم أضف 0.5 مل من BBTW إلى الأنبوب وضعه على الثلج. بعد ذلك ، اضبط الصوتنة على 10٪ الحد الأقصى للسعة ووقت تشغيل لمدة ثانيتين مع ثابت ، وقم بتنظيف مسبار المحرك عن طريق وضع طرف المسبار في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر مملوء بالماء منزوع الأيونات وتشغيل الصوت

ثم جفف مسبار سونيكات بأنسجة مختبرية. اغمر المسبار في الأنبوب ، من ثلاثة إلى أربعة ملليمترات فوق العينة وابدأ الصوتنة. ثم قم بإزالة الأنبوب وضعه على الجليد لمدة 30 ثانية لمنع ارتفاع درجة الحرارة من الصوتنة ، وللسماح للعينة بالاستقرار في قاع الأنبوب.

كرر هذه الخطوة كما هو مطلوب من قبل عمر العينة بعد اكتمال الصوتنة. اشطف العينة مرتين بمليلتر واحد من BBTW. بعد كل شطف ، اترك العينة تستقر قبل التجفيف باستخدام ماصة ، أضف ملليلترا واحدا من BBTW إلى القارورة وضعها على هزاز.

بعد ثلاث دقائق ، اترك العينة تستقر وقم بإزالة BBTW باستخدام ماصة. ثم كرر هذا. الخطوة مرتين ، قم بحظر العينة ب 0.5 مل من المصل العادي بنسبة 5٪ المخفف في BBTW إلى الأنبوب ، وضع العينة على الروك لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، أضف 0.5 مل من محلول الأجسام المضادة الأولية وهز العينة طوال الليل عند أربع درجات مئوية ، واترك العينة تستقر في قاع الأنبوب. ثم اسحب الأجسام المضادة الأولية بماصة واشطفها مرتين بمليلتر واحد من BBTW. أضف ملليلتر واحد من BBTW إلى القارورة ثم ضعها على كرسي هزاز لمدة ثلاث دقائق.

ثم قم بإزالة BBTW بماصة وكرر ذلك. خطوة خمس مرات ، قم بحظر العينة بمحلول BBTW المصل العادي بنسبة 5٪ وهزها لمدة 30 دقيقة. ثم قم بإزالة المحلول.

أضف الجسم المضاد الثانوي المخفف بنسبة 5٪ محلول BBTW المصل العادي ولف الأنبوب بورق الألمنيوم. ثم هز العينة بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. اسحب الأجسام المضادة الثانوية بماصة واشطف العينة بمليلتر واحد من PBTW مرتين.

بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من PBTW إلى القارورة وضعها على كرسي هزاز لمدة خمس دقائق. ثم اترك العينة تستقر وقم بإزالة PBTW باستخدام ماصة. كرر هذا.

خطوة ثلاث مرات. أضف 80 إلى 100 ميكرولتر من محلول DAB المشترك إلى الأنبوب وقم بتخزينه عند سالب 20 درجة مئوية. أخيرا ، لتركيب العينة ، استخدم خمسة إلى 10 ميكرولترات من diam ثنائي الفينيل BCO p ، أو PPD المضاد للتلاشي.

ثم شاهده بالفحص المجهري الفلوري. توضح إسقاطات Z هذه لأربع شرائح متحدة البؤر فعالية البروتوكول في تصور السمات المورفولوجية بالإضافة إلى الخلايا الفردية في C اثنين خلال المراحل الثلاث المتأخرة الجنينية من خلال المراحل المبكرة والمتوسطة L من تطور ذبابة الفاكهة. يعد تطوير الخصيتين نظاما جيدا بشكل خاص لتوضيح فعالية البروتوكول لأن نضوج الخصيتين ديناميكي طوال تطور اليرقات.

تسلط هذه الصور الضوء على الخلايا الجرثومية في الخلايا الحمراء والخلايا المحورية ومناطق FU في الأقسام الخضراء أحادية البؤر في منتصف الأدمغة الثلاثة L. صبغة مناعية للخلايا الأم العقدية ، الخلايا العصبية غير المتمايزة في الخلايا العصبية الخضراء وغير الناضجة والأولية. باللون الأحمر تظهر تلطيخا قويا مع أنماط تعبير مميزة في فصوص الدماغ والحبل العصبي البطني ، اعتمادا على اتجاه التركيب ، يسمح التصوير بتصور أنسجة المخ من السطح الظهري أو السطح البطني أو في المقطع العرضي السهمي.

تسمح هذه التقنية في الموقع لعلماء الأحياء باستكشاف تطور الأعضاء في تشكل الأنسجة في الكائنات الحية حيث تمنع البشرة الواقية اختراق الأجسام المضادة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية صوتنة عينات المريء الجنينية واليرقاتية في المرحلة المتأخرة من أجل تصور الأنسجة النامية في C two. لا تنس أن العمل مع الفورمالديهايد والهيبتان والميثانول يمكن أن يكون خطيرا للغاية واحتياطات مثل العمل في غطاء الدخان.

يجب دائما مراعاة ارتداء القفازات المناسبة ومعطف المختبر أثناء تنفيذ هذا الإجراء.