التصوير الآلي شبه الإسفار من الأنسجة محددة في الزرد الأجنة
مايو 17, 2014
الموصوفة هنا هو بروتوكول للتصوير شبه الآلي من مضان الأنسجة محددة في الأجنة الزرد.
الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف التلقائي عن الخلايا المستجيبة للإستروجين في يرقات الزرد الحية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تربية خمس أسماك بالغة X-E-R-E-G-F-P أولا لتوليد أجنة أسماك الزرد المراسلة للإستروجين. بعد ذلك ، يتم وضع الأجنة في آبار فردية من صفيحة 96 بئر.
ثم يضاف هرمون الاستروجين إلى صفيحة الأجنة. أخيرا ، يتم مسح اللوحة بحثا عن التألق باستخدام مجهر فلوري epi مع مرحلة آلية. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري الفلوري لإظهار نشاط محدد للأنسجة لمستقبلات هرمون الاستروجين.
لذا فإن الميزة الرئيسية لاستخدام هذه التقنية على التقنيات التقليدية الأخرى مثل الإنتاجية العالية أو الفحص عالي المحتوى ، هي أنه يمكن تصوير التألق الخاص بالأنسجة في يرقات سمك الزرد باستخدام مجهر فلوري epi قياسي فقط. مجهزة بمرحلة آلية ، لا يلزم وجود قارئ لوحة متخصص. تحذير: المواد الكيميائية التي تحتوي على BPA و estradiol خطرة ويمكن أن يكون لها آثار ضارة على الجنين البشري.
تعامل مع اضطرابات الغدد الصماء بعناية واستخدم دائما معدات الحماية الشخصية المناسبة. في هذا العرض التوضيحي ، سيتعرض أسماك الزرد لهرمون الاستروجين 17 بيتا استراديول وثنائي الفينول أ والجينين بجرعات مختلفة ، بدءا من 48 ساعة بعد الإخصاب بعد تربية أسماك الزرد ، وجمع البيض ومعادلته. وفقا للنص في يوم العلاج ، قم بتخفيف المحاليل الكيميائية للمخزون ، واحد إلى 1000 في مليلتر واحد من E ثلاثة B بالإضافة إلى دوامة PTU بقوة.
كتحكم في السيارة. استخدم مخففا من واحد إلى 1000 من DMSO في E و ثلاثة و B و PTU باستخدام نقل بلاستيكي كبير التجويف. تنقل الماصة ثلاثة أجنة لكل بئر إلى صفيحة 96 بئر لإعداد ثلاثة آبار لكل حالة.
تجنب وضع الأجنة في الآبار الخارجية لمنع تبخر الوسط أثناء العلاج المطول. العمل بسرعة لتجنب جفاف الأجنة ، وإزالة الوسط من كل بئر وإضافة 200 ميكرولتر من محلول المعالجة المختلط جيدا. تأكد بصريا من أن جميع الأجنة مغمورة في المحلول وليست عالقة بجانب البئر.
احتضان الأجنة عند 28.5 درجة مئوية في 72 ساعة. تخدير الأجنة بعد الإخصاب بإضافة 10 ميكرولتر من أربعة ملليغرام لكل مليلتر من التراكا. لكل منها ، ضع لوحة البئر 96 جيدا على مرحلة آلية وباستخدام برنامج Zeiss Zen Blue 2011.
قمبمعايرة المرحلة عن طريق تحديد خيار حامل العينة واختيار متعدد الآبار 96. ثم حدد معايرة قبل اتباع التوجيهات المتدرجة ، باستخدام هدف 10 × وإعداد المجال الساطع أو BF ، وتحديد جنين التحكم الإيجابي وتعيين إعدادات التعريض الضوئي بشكل مناسب لقنوات BF و GFP ، مع التأكد من أن إشارة التألق لا تشبع الكاميرا. ركز على جنين واحد وقم ببرمجة المجهر للحصول على ما مجموعه ثلاثة أقسام Z تتضمن صورة واحدة 50 ميكرومتر أعلى وصورة واحدة 50 ميكرومتر أسفل المستوى البؤري الحالي.
بعد ذلك ، لتعيين معلمات البرنامج للحصول على صورة متجانبة باستخدام قنوات GFP و BF. ضمن علامة التبويب الاكتساب، حدد الإعداد المتقدم، وحدد مناطق التجانب، ثم اللوحات اختر الدائرة.
خيار البئر حدد الناقل وعامل التعبئة 90٪ لالتقاط صور متعددة للآبار المحددة ، بحيث تكون 90٪ من مساحة كل بئر مرئية في الصورة المركبة. ضمن الخيارات ، حدد مقدار التداخل المطلوب ، مثل خمسة إلى 10٪ مما يسمح بخط سلس بين الصور. ثم ابدأ التصوير لالتقاط الصور يدويا باستخدام هدف 20 × وإعداد BF ، وتحديد جنين التحكم الإيجابي.
اضبط إعدادات BF و GFP كما كان من قبل والتقط الصور. يوضح هذا الشكل صورا مركبة من آبار فردية لصفيحة 96 بئر. تتكون كل صورة من 59 صورة فردية مع تداخل 5٪ للصورة.
لاحظ أن سمك الزرد الحي يتم توجيهه بشكل عشوائي داخل كل بئر. ومع ذلك ، فنحن قادرون على التمييز بين التألق في القلب والمضان في الكبد. تعد صور Brightfield مفيدة كمراجع لتقييم اتجاه أسماك الزرد وتصور التشوهات المورفولوجية.
تم التقاط الصور المعروضة هنا بهدف مسافة عمل طويلة 20 × لتحليل أكثر تفصيلا ، وتم التقاطها مباشرة بعد الفحص الآلي الذي تم عرضه للتو دون إزالة اللوحة من مرحلة المجهر. باستخدام هدف 20 × ، يمكن توطين التألق في القلب بدقة في صمامات البطين الأذيني التي تشير إليها الأسهم والصمامات الأبهرية كما هو موضح في رأس السهم. بمجرد إتقان هذه التقنية ، يمكن التقاط صور من 3 96 لوحة حائط يوميا.
لا تنس أن العمل مع المركبات المسببة لاضطراب الغدد الصماء يمكن أن يكون خطيرا ، لذلك اتخذ دائما الاحتياطات المناسبة مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول طريقة للتصوير شبه الآلي للفلورة النوعية للأنسجة في أجنة أسماك الزيبرا، مع التركيز على الخلايا المستجيبة للإستروجين. وتستخدم هذه الإجراءات المجهر الفلوري لتصور نشاط مستقبلات الإستروجين في يرقات أسماك الزيبرا الحية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- البيولوجيا التنموية
- التصوير الفلوري
خلفية علمية
- تلعب مستقبلات الإستروجين دوراً حاسماً في مختلف العمليات البيولوجية.
- تُستخدم أسماك الزيبرا ككائن نموذجي لدراسة بيولوجيا التطور.
- يسمح المجهر الفلوري بتصوير أنشطة خلوية محددة.
- تُعزز تقنيات التصوير الآلي من كفاءة جمع البيانات.
الغرض من الدراسة
- تطوير بروتوكول للكشف عن الخلايا المستجيبة للإستروجين في سمك الزيبرا.
- تحسين دقة وكفاءة تقنيات التصوير في الأجنة الحية.
- المساهمة في فهم نشاط مستقبلات الإستروجين أثناء عملية النمو.
الطرق المستخدمة
- تربية أسماك الزيبرا البالغة من سلالة X-E-R-E-G-F-P لإنتاج الأجنة.
- توزيع الأجنة في آبار فردية من طبق يحتوي على 96 بئرًا.
- إضافة الإستروجينات إلى الآبار التي تحتوي على الأجنة.
- مسح الطبق للكشف عن الفلورة باستخدام مجهر فلوري انعكاسي مزود بمنصة آلية.
النتائج الرئيسية
- الكشف الناجح عن الخلايا المستجيبة للإستروجين في يرقات سمك الزيبرفيش الحية.
- تصوير النشاط النوعي للأنسجة لمستقبلات الإستروجين.
- إثبات فعالية بروتوكول التصوير شبه الآلي.
- المساهمة في مجال علم الأحياء النمائي من خلال تقنيات التصوير المحسنة.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة لدراسة نشاط مستقبِل الإستروجين.
- يمكن للتصوير الآلي أن يساهم بشكل كبير في تبسيط عمليات البحث.
- قد يكون لهذه النتائج دلالات في فهم التأثيرات الهرمونية على التطور.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح نهج التصوير شبه الآلي هذا الكشف الفلوري منخفض التكلفة والخاص بأنسجة معينة في أجنة سمك الزيبرا باستخدام معدات مجهرية قياسية، مما يقلل الاعتماد على أنظمة الفحص عالية المحتوى الباهظة الثمن. ومن خلال دعم فحص ربيطات مستقبلات الإستروجين بدقة مكانية، فإنه يعزز الثقة في التحقق من الهدف في مقايسات الاضطرابات الغدية. وتتناسب هذه الطريقة مع سير عمل الاكتشاف المبكر حيث يتم إعطاء الأولوية للحد من المخاطر الآلية والقيمة التنبؤية قبل تحسين المركبات الرائدة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير الصيدلاني الحيوي
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء تنشيط مستقبلات الإستروجين الخاصة بأنسجة معينة لتوضيح مدى التفاعل الوظيفي مع الهدف في الجسم الحي.
- القيمة التشغيلية: تستخدم خطوط مراسل جينية معدلة وراثياً لقياس تعبير GFP المستحث بالربيطة في أنسجة محددة مثل صمامات القلب مقابل الكبد.
- القيمة التنبؤية: تدعم تقليل المخاطر الميكانيكية من خلال التمييز بين النشاط الغدي المستهدف والآثار غير المستهدفة أو السامة للخلايا.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تجهيز أجنة سمك الزيبرفيش في تنسيق 96 بئراً للتعريض للمركبات والتصوير الفلوري الآلي.
- المخرجات الكمية: توليد صور مجمعة (tiled) بنظام المجال المضيء وGFP، مما يتيح التقييم اليدوي لأنماط الفلورة النوعية للأنسجة.
- القابلية للتوسع: متوافق مع المنصات الآلية في مجاهر الفلورة العلوية (epifluorescence) القياسية، مما يسمح بمعالجة عدة أطباق يومياً دون الحاجة إلى أجهزة قراءة متخصصة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الأهمية المرضية: ينمذج الأنسجة المستجيبة للإستروجين لتقييم الاضطرابات الغددية التطورية، وهو أمر ذو صلة بمسح السمية التناسلية والأيضية.
- الاستمرارية الانتقالية: يربط بين اختبارات ارتباط المستقبلات في المختبر والاستجابات على مستوى الأنسجة في الكائن الحي الكامل ضمن نظام فقاري.
- القرارات المعدلة حسب المخاطر: يساعد في تحديد أولويات المركبات ذات ملفات التنشيط النسيجية الانتقائية لإجراء مزيد من التقييمات قبل السريرية.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تدعم هذه الطريقة تسلسلاً استكشافياً يبدأ من التحقق من الهدف، مروراً بتطوير المقايسة، وصولاً إلى التوصيف الميكانيكي، خاصةً فيما يتعلق بمعدِّلات المستقبلات النووية حيث تساهم الانتقائية النسيجية في تحديد هوامش الأمان.
- بيولوجيا الاكتشاف: يختبر النشاط النسخي لمستقبلات الإستروجين في الأجنة الحية، مما يوضح الاستجابات الخاصة بالمسارات بما يتجاوز فحوصات الارتباط البسيطة.
- المسح: يتيح الجمع الآلي للصور عبر أطباق ذات 96 بئراً، مما يحسن قابلية التكرار والإنتاجية للمسح القائم على الفلورية للربيطات.
- التحليلات: يوفر قراءات فلورية مكانية تسمح بالتمييز بين الأنسجة، مما يدعم التحليل المقارن لتأثيرات المركبات.
- البحث الانتقالي: يربط الأحداث الجزيئية المبدئية بالنتائج على مستوى الأنسجة في فقاري في طور النمو، مما يعزز القدرة على التنبؤ بالسمية النمائية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس منصة تصوير قابلة لإعادة الاستخدام وتطبيقها على مراسلين تحوليين آخرين خارج نطاق إشارات الإستروجين.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الأهداف من خلال الكشف عن أنماط تأشير خاصة بالأنسجة يتم إغفالها في المقاييس الإجمالية.
- القيمة التشغيلية: توحد عمليات التعامل مع الأجنة والتصوير عبر المنصات الآلية، مما يحسن قابلية التكرار بين المستخدمين والمختبرات.
- القيمة الاستراتيجية: تقلل من حالات الفشل في المراحل المتأخرة من خلال تحديد المسؤوليات المسببة لاضطرابات الغدد الصماء مبكرًا باستخدام الدقة المكانية.
- التأثير على مجموعة المشاريع: توجه عملية تحديد أولويات المركبات المعدلة وفقًا للمخاطر من خلال تسليط الضوء على الليجاندات ذات الخصائص المرغوبة في انتقائية الأنسجة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تربية أسماك الزيبرا، وصيانة السلالات المعدلة وراثياً، والمجهر الفلوري.
- يعتمد على توفر مجاهر الفلورة فوق البؤرية المزودة بمنصات آلية وبرمجيات استحواذ متوافقة (مثل Zeiss Zen Blue).
- يستلزم توحيد معايير تحديد مراحل نمو الأجنة، وتوقيت التعرض للمواد الكيميائية، وبروتوكولات التركيز البؤري بين المستخدمين.
- يتضمن اعتبارات التكيف عند التطبيق على مراسلين مختلفين خاصين بأنسجة معينة أو مراحل نمو مختلفة.
- يشمل قيوداً عملية مثل الفحص اليدوي للصور لتقدير الفلورة وتفاوت اتجاهات الأجنة داخل الآبار.
