Name: التصوير الآلي شبه الإسفار من الأنسجة محددة في الزرد الأجنة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: اكتشف التصوير شبه الآلي للخلايا المستجيبة للإستروجين في أجنة الزرد باستخدام المجهر الفلوري. يُمكّن هذا البروتوكول الباحثين من دراسة نشاط مستقبلات الإستروجين في الأنسجة الحية بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر سوزان المزارعين وموظفي البنك العربي المتحد الزرد مرفق البحوث لرعاية الزرد. التمويل التي تقدمها صناديق بدء من قسم علم الأدوية والسموم.

ملاحظة: تمت الموافقة على هذا البروتوكول من جامعة ألاباما في جنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية برمنغهام. 1. تربية اسماك الزرد ومجموعات البيض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل ثلاثة أيام من بداية التعرض للمواد الكيميائية وتجميع الدبابات تربية مع فواصل للذكور والإناث منفصلة. ملء كل منتصف الطريق خزان المياه مع نظام تربية الأحياء المائية. باستخدام صافي، ونقل تيراغرام (5xERE: GFP) الأسماك c262/c262 إلى خزانات تربية، ووضع 2 ذكور و 3 إناث في كل خزان مفصولة المفرق. وضع غطاء على كل خزان وتسمية مع التاريخ والسلالات إلى أن عبروا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في صباح اليوم التالي، وإزالة كافة الحواجز والميل يحير لإنشاء منطقة ضحلة في نهاية واحدة من خزان التربية. السماح الزرد لزميله، وجمع الأجنة في 10 دقيقة فترات لضمان انطلاق التنموية دقيقة. البيض نظيفة من قبل الشطف من خلال مصفاة الشاي باستخدام E3B المتوسطة والأجنة تدفق برفق في أطباق بتري. العودة الأسماك البالغة لدائمةالدبابات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر تشريح والفرز والعد، وإزالة أي أجنة غير مخصبة، والشاذ أو التالفة. المكان الأجنة في أطباق بتري في E3B المتوسطة ومنزل في 28.5 درجة مئوية مع ضوء 14:10: دورة الظلام. كثافة الجنين يمكن أن تؤثر على التنمية. وضع ما لا يزيد عن 100 ملم الأجنة في صحن 100 × 35 و لا يزيد عن 50 الأجنة في 60 × 15 مم طبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بنسبة 24 HPF، استبدال وسائل الإعلام مع E3B تحتوي على 200 ميكرومتر 1-2-فينيل ثيويوريا (PTU). PTU يمنع تشكيل الصباغ ويحافظ الأجنة الزرد واليرقات شفافة لتحسين وضوح الصورة. تنبيه: الأسهم PTU تتركز خطرة؛ ارتداء القفازات عند اتخاذ الحل E3B + PTU. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الإخصاب آخر 1 يوم (DPF)، يدويا إزالة المشيماء من كل جنين باستخدام ملقط غرامة. لا يظهر المشيماء أن تؤثر تغلغل هرمون الاستروجين، ولكن إزالة يعزز وضوح الصورة. ليست هناك حاجة لإزالة chorions من وسائل الإعلام. ملاحظة: كبديل لdechorionation دليل، دفعات من الأجنة يمكن تشيdechorionated mically باستخدام 1 ملغ / مل pronase العلاج، كما هو موضح سابقا 11. </li></ol> 2. العلاج الكيميائي للأجنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم قبل العلاج، وإعداد الحلول الأسهم من كل مادة كيميائية في تركيز 1،000 أضعاف في DMSO (أو المذيبات المناسبة). على سبيل المثال، لفضح الأجنة إلى 10 ميكرومتر ثنائي الفينول أ (BPA)، وإعداد محلول المخزون 10 ملي BPA في 100٪ DMSO. وهذا يضمن تركيز DMSO موحدة في كل معاملة ويسمح للغير سامة 1:1،000 التخفيف من DMSO لتكون بمثابة السيطرة على السيارة. حلول تخزين السهم عند -20 درجة مئوية. لهذا البروتوكول، سوف يتعرض الأجنة إلى 1 ميكرومتر و 10 ميكرومتر BPA، نانومتر 18.5 و 1.85 ميكرومتر الجينيستين، 367 نانومتر استراديول (مراقبة إيجابية) وسيارة (0.1٪ DMSO، ومراقبة سلبية). تنبيه: المواد الكيميائية مثل BPA واستراديول هي خطرة ويمكن أن يكون لها آثار ضارة على الجنين البشري. معالجة اختلال الغدد الصماء مع الرعاية ودائما استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم من العلاج، أعدت ذوبان المحاليل الكيميائية الأسهم. تمييع 1:1،000 بواسطة pipetting 1 مل + E3B PTU في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل وإضافة 1 ميكرولتر من محلول المخزون الكيميائية. دوامة بقوة. تمييع DMSO 1:1،000 في E3B + PTU بمثابة السيطرة على السيارة. استخدام 1 مل + E3B PTU في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل كعنصر تحكم غير المعالجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة كبيرة تتحمل نقل البلاستيك، ونقل الأجنة من أطباق بتري في كل بئر من لوحة 96 جيدا، 3 أجنة لكل بئر، 3 آبار في الشرط. لمنع التبخر خلال فترة العلاج لفترات طويلة، حذفت الأجنة من الصفوف والأعمدة الخارجي من لوحة (الصفوف A و E، والأعمدة 1 و 12). يمكن ملء الآبار الخارجي مع 300 ميكرولتر من E3B + PTU. تسمية لوحة غطاء مناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام من كل بئر مع غرامة يميل نقل البلاستيك ماصة. العمل بسرعة لتجنب جفاف الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من محلول معالجة في المقابلة أيضا. وضع غطاء underneath لوحة كدليل لضمان إضافة العلاجات المناسبة في الآبار. دوامة كل أنبوب قبل pipetting لتوزيع هذه المادة الكيميائية في المحلول. تأكيد بصريا كل جنين في الحل العلاج. إذا الأجنة على جانب البئر، واستخدام الماصة نقل نظيفة لغسلها في البئر مع الحل العلاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة في الحاضنة في 28.5 درجة مئوية. وسيتم تحليل الأجنة لمضان في 72 HPF. </li></ol> 3. التصوير الآلي من الأجنة في لوحات 96 جيد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الأجنة عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من 4 ملغ / مل تريكين إلى كل بئر. ملاحظة: تخدير الأجنة قبل التصوير. في 24-96 HPF، الزرد يحمل حركة عفوية وردود الفعل المفاجئة لمصدر الضوء المتغيرة أثناء التقاط الصور. التخدير الأجنة يقلل من الحركة أثناء التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة 96 جيدا في مرحلة الآلية ومعايرة المرحلة. باستخدام زايس زن الأزرق 2011 برنامج للفحص المجهري ومحوالسيطرة على، حدد الخيار الناقل العينة وتحديد multiwell 96. اختر معايرة. اتبع الإرشادات خطوة بخطوة لمعايرة المرحلة. ملاحظة: لا إلغاء الزر البلاط بعد هذه الخطوة. إذا كان الزر البلاط غير محددة، قد يتم فقدان إعدادات المعايرة وسيتعين على لوحة 96 جيدا أن تعديلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الهدف 10X وbrightfield (BF) وضع وتحديد الجنين مراقبة إيجابية وتعيين إعدادات التعرض بشكل مناسب لBF وقنوات GFP، والتأكد من أن إشارة مضان لا تشبع الكاميرا. التركيز على الجنين واحد وبرنامج المجهر للحصول على إجمالي 3 Z-أقسام وصورة واحدة 50 ميكرون أعلاه واحدة 50 ميكرومتر تحت البؤري الحالي. ملاحظة: نظرا لأن أنسجة مختلفة تشغل طائرات التنسيق المختلفة، وهذا سوف يضمن ليتم التقاط كل الصور الزرد مع القلب والكبد في التركيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين المعلمات البرمجيات للحصول على صورة من البلاط باستخدام GFP وBF CHANNEليرة سورية. تحت علامة التبويب الاستحواذ، حدد الإعداد المتقدمة. حدد المناطق البلاط، ثم البلاط. اختر الخيار الدائرة أيضا. ملاحظة: يتم استخدام التبليط لخلق صورة مركب من كل بئر. وجهة نظر ميدانية من واحد يلتقط سوى جزء صغير من كل بئر. وظيفة تبليط يمكن التقاط تلقائيا متعددة الحقول المتاخمة للرؤية من كل جانب، وخلق صورة مركبة من البئر بأكمله. وبالتالي فإنه من الممكن التقاط الصور تلقائيا 96 مركب في لوحة، حيث يحتوي كل صورة مركب عشرات الصور الفردية من بئر واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الناقل وملء عامل 90٪. واختيار عامل تعبئة 90٪ من التقاط صور متعددة من آبار مختارة مثل التي من شأنها أن 90٪ من مساحة كل بئر تكون مرئية في الصورة المركبة. ملاحظة: عند اختيار عامل تعبئة، سيتم عرض رسم بياني يمثل المنطقة المراد تصويرها. تحديد النسبة التي سوف تشمل منطقة البئرغير مناسبة للتجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمن خيارات، حدد مقدار التداخل المطلوب. ملاحظة: عند ترقيع البلاط للحصول على صورة ممثل واحد، تداخل من 5-10٪ يسمح لالتماس السلس بين الصور. ومع ذلك، إذا الصورة خياطة لا لزوم لها، وذلك باستخدام التداخل 0٪ سوف يقلل وقت التصوير. باستخدام 90٪ عامل تعبئة و 5٪ التداخل، صورة مركبة من بئر واحد يتكون من 59 الصور الفردية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء التصوير. سوف المجهر الحصول على صور تلقائيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفقد الصور مركب من كل بئر لمضان الأنسجة محددة (الشكل 1) يدويا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملاحظة: فمن الأفضل أن تبدأ مع مراقبة إيجابية للتأكد من أن التعرض للمواد الكيميائية عملت قبل مراقبة الآبار العلاج التجريبي. </li></ol> 4. دليل التقاط الصور من الأجنة في 96 لوحة جيدا ملاحظة: لتأكيد النتائج، استخدم الهدف 20X مسافة العمل الطويلة لميلانكراس الصور أكثر تفصيلا يدويا (الشكل 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الهدف 20X وbrightfield (BF) وضع وتحديد الجنين مراقبة إيجابية وتعيين إعدادات التعرض للقنوات BF وGFP بشكل مناسب، والتأكد من أن إشارة مضان لا تشبع الكاميرا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الأجنة الفردية والتقاط الصور يدويا. ملاحظة: مرة واحدة وقد تم اختيار إعدادات التعرض لالجنين مراقبة إيجابية، لا تغير من الإعدادات. هذا يسمح للمقارنة بين كثافة مضان كما يتم التقاط كل صورة في ظل ظروف موحدة. </li></ol>

<ol><li>Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Developmental Biology. 7, 62(2007).</li>
<li>Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid-mediated+gene+expression+in+transgenic+reporter+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish.</a> Developmental Biology. , 89-101 (2001).</li>
<li>Gorelick, D. A., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Estrogen+Receptor+Transcriptional+Activation+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish.</a> Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).</li>
<li>Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+A+tool+for+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C%3A+Embryo+Today%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: A tool for chemical screens.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).</li>
<li>Peravali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+feature+detection+and+imaging+for+high-resolution+screening+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 50, 319-324 (2011).</li>
<li>Walker, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+reporter+quantification+in+vivo%3A+high-throughput+screening+method+for+reporter-based+assays+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Vogt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).</li>
<li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+estrogen+response+element%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the estrogen response element.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).</li>
<li>Rovira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+screen+identifies+FDA-approved+drugs+and+target+pathways+that+induce+precocious+pancreatic+endocrine+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+Book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , 4th edn, University of Oregon Press. (2000).</li>
</ol>

والكتاب ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

يصف هذا البروتوكول وسيلة مباشرة لتلقائيا صورة مضان الأنسجة محددة في الأجنة الزرد. وقد تم تطوير بروتوكول باستخدام زايس محوري المراقب. Z1 مع زن الأزرق 2011 برنامج، ولكن هذه التقنية يمكن تكييفها باستخدام أي مجهر مقلوب مع مرحلة الآلية وبرامج التحكم المجهر التي يمكن أن تؤدي تبليط لخلق صور مركبة. يمكن تجهيز مجهر مقلوب مع مرحلة الآلية توفر عملية بديلة أقل تكلفة لشراء معدات متخصصة لفحص عالية المحتوى. تتراوح مراحل بمحركات من عدة آلاف إلى عشرات الآلاف من الدولارات الأميركية، اعتمادا على تقد...

وقد وضعت الزرد المعدلة وراثيا التي تسمح لرؤية مباشرة من النشاط في مسارات الإشارات، مثل عوامل نمو الخلايا الليفية 1، حمض الريتينويك 2 و 3 الاستروجين، في الأجنة الحية. هذه الأدوات تمكين الكشف عن المواد الكيميائية التي التشويش على مسارات إشارات (يعاير مثل تغير في كثافة مضان) أو المواد الكيميائية التي تعدل يشير بطريقة الأنسجة محددة (تغيير في مضان التعريب) 4. التقاط الصور الآلي يزيد من الإنتاجية بشكل كبير من شاشات الكيميائية 5،6. الشاشات التي مضان فحص تلقائيا في الزرد يعيش غالبا ما تعتمد على تكلفة، والمعدات المتخصصة. يوفر ما يسمى الفرز الفائق محتوى صالح ارتفاع القرار، والتصوير الكمي ولكن على حساب من استخدام لوحة القراء المتخصصة المجهزة لالمجهري متحد البؤر 7،8. الهدف من هذا الأسلوب هو تلقائيا مقايسة مضان الأنسجة محددة في الأجنة الزردفي لوحة 96 جيدا باستخدام مجهر epifluorescence القياسية. ويمكن تمييز مضان الأنسجة محددة باستخدام هذه التقنية، وربما يكون نهجا معقولا للمختبرات التي تفتقر إلى الوصول إلى القراء لوحة المتخصصة أو معدات الفحص العالية المحتوى. في هذا البروتوكول، ونحن نستخدم التصوير الآلي للكشف عن الأنسجة محددة مستقبلات هرمون الاستروجين (ER) منبهات في الزرد حية في 3 أيام بعد الإخصاب (DPF). خط المعدلة وراثيا تيراغرام (5xERE: GFP) c262/c262 يحتوي على 5 جنبا إلى جنب استجابة هرمون الاستروجين تسلسل الحمض النووي عنصر (موسوعة الدين و الأخلاق) المنبع من البروتين الفلورية الخضراء (GFP) 3. في غياب يجند، المتطلبات البيئية عادة ما تكون غير نشطة. يجند ملزم يتسبب في تغيير متعلق بتكوين جزئي، مما يسمح للمستقبلات لربط ااا الحمض النووي وتنظيم النسخ 9. 5xERE: الأسماك GFP يمكن استخدامها لفحص المكتبات الكيميائية لجهري ER، ويمكن استخدامها لفحص عينات المياه للملوثات البيئية استروجين.

<table><tbody><tr><td>ماصات نقل البلاستيك ؛ ماصات نقل بلاستيكية واسعة التجويف</td><td>فيشر</td><td>13-711-23</td><td></td></tr><tr><td>؛ طرف ناعم</td><td>فيشر</td><td>13-711-26</td><td></td></tr><tr><td>96 بئر ، مستديرة ، ألواح مسطحة</td><td>القاع فيشر</td><td>21-377-203</td><td></td></tr><tr><td>100 × 35 مم</td><td>ألواح فيشر</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>35 × 60 مم</td> لوحات <td>فيشر</td><td>08-757-100B</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5 ملقط دقيق</td><td>أدوات العلوم الدقيقة</td><td>11254-20</td><td>أبعاد الطرف 0.05 × 0.01 مم ، لإزالة المشيمات يدويا من الأجنة</td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>انظر كتاب الزرد للوصفة (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)&nbsp;</td></tr><tr><td>1-فينيل 2-ثيوريا (PTU)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>P7629-10G</td><td>تحضير مخزون 20 ملي (100x) واستخدامه عند 200 مو ؛ M في E3B&nbsp;</td></tr>يتطلب <tr><td>Zeiss Axio Observer Z1</td><td>بروتوكول Carl Zeiss</td><td></td><td>مجهر مضان مقلوب مع هدف مسافة عمل طويلة 20x بمرحلة آلية</td></tr><tr><td></td><td>كارل زايس</td><td></td><td>نستخدم هدفا مع 0.4 NA و 8.4 مم مسافة عمل</td></tr><tr><td>Axiocam HRm كاميرا رقمية</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZenBlue 2011 برنامج التحكم في المجهر</td><td>كارل زايس</td><td></td><td>يتطلب البروتوكول أتمتة الفحص المجهري وبرنامج التحكم لتمكين التقاط الصور المبلطة باستخدام مرحلة آلية</td></tr><tr><td>الميثيلين الأزرق</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>MB-1 ؛ 25 جراما</td><td>تصنع محلول 2٪ في ماء التناضح العكسي للاستخدام في E3B (أدناه)</td></tr> <tr><td>E3B</td><td></td><td></td><td>60X E3 SOLUTION: NaCl &nbsp ؛ &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 17.2 جرام KCl &nbsp ؛ &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0.76 جرام CaCl 2 -2H 2 O & nbsp ؛ &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 2.9 جرام MgSO4-7H 2O & nbsp ؛ - 4.9 جرام أو MgSO4 - 2.39 جرام يذوب في 1 لتر ماء Milli-Q ؛ تخزينها في زجاجة معقمة سعة 1 لتر. 1X E3B لأسماك الزرد: 60X E3 &NBSP ؛ &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 150 مل 2٪ ميثيلين أزرق &nbsp ؛ &nbsp; &nbsp; &nbsp; 100 مو ؛ l&nbsp; أحضر ما يصل إلى 9 لترات مع ماء Milli-Q &nbsp ؛</td></tr></tbody></table>

التصوير الآلي شبه الإسفار من الأنسجة محددة في الزرد الأجنة

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

الأجنة الزرد هي أداة قوية لفحص واسعة النطاق من جزيئات صغيرة. وكثيرا ما تستخدم الزرد المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية مراسل لتحديد المواد الكيميائية التي تعدل التعبير الجيني. شاشات الكيميائية التي مقايسة مضان في الزرد يعيش غالبا ما تعتمد على تكلفة، والمعدات المتخصصة لفحص نسبة عالية. نحن تصف الإجراء باستخدام المجهر epifluorescence معيار مع مرحلة الآلية تلقائيا صورة الأجنة الزرد وكشف مضان الأنسجة محددة. باستخدام الزرد المعدلة وراثيا التي تبلغ عن نشاط مستقبلات هرمون الاستروجين عن طريق التعبير عن GFP، وضعنا الداخلي شبه الآلي للكشف عن بروابط مستقبلات هرمون الاستروجين التي تنشط مراسل بطريقة الأنسجة محددة. في هذا الفيديو وصفنا إجراءات arraying الأجنة الزرد في 24-48 ساعة بعد الإخصاب (HPF) في لوحة 96 جيدا وإضافة جزيئات صغيرة التي تربط مستقبلات الاستروجين. في 72-96 HPF والصور من كل بئر منيتم جمع لوحة بأكمله تلقائيا وتفتيشها يدويا لمضان الأنسجة محددة. يوضح هذا البروتوكول القدرة على اكتشاف هرمون الاستروجين التي تنشط المستقبلات في صمامات القلب ولكن ليس في الكبد.

ويبين الشكل 1 الصور المركبة من الآبار الفردية لوحة 96 جيدا. وتتكون كل صورة مركب من 59 الصور الفردية مع 5٪ صورة التداخل. لاحظ أن الزرد الحية موجهة عشوائيا داخل كل بئر، ولكن نحن قادرون على التمييز مضان في قلب من الكبد. الصور Brightfield مفيدة كمرجع لتقييم التوجه الزرد وتصور شذوذ المورفولوجية (أرقام 1A و 1C). يستخدم التصوير الآلي باستخدام الهدف 10X لفحص المواد الكيميائية وتحديد التي تبرر التقييم دليل على التكبير العالي. الشكل 2 يوضح ...

الموصوفة هنا هو بروتوكول للتصوير شبه الآلي من مضان الأنسجة محددة في الأجنة الزرد.

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف التلقائي عن الخلايا المستجيبة للإستروجين في يرقات سمك الزيبرا الحية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تزويج خمس أسماك بالغة من سلالة X-E-R-E-G-F-P لإنتاج أجنة سمك زيبرا كاشفة للإستروجين. بعد ذلك، يتم وضع الأجنة في آبار فردية داخل طبق يحتوي على 96 بئراً.بعد ذلك، تُضاف الإستروجينات إلى طبق الأجنة. وأخيراً، يُفحص الطبق للكشف عن الفلورة باستخدام مجهر فلوري فوقي (epi fluorescent microscope) مزود بمنصة متحركة. وفي النهاية، يُستخدم المجهر الفلوري لإظهار النشاط النوعي للأنسجة لمستقبلات الإستروجين.تكمن الميزة الرئيسية لاستخدام هذه التقنية مقارنة بالتقنيات التقليدية الأخرى، مثل الفرز عالي الإنتاجية أو الفرز عالي المحتوى، في إمكانية تصوير الفلورة النوعية للأنسجة في يرقات zebrafish باستخدام مجهر فلوري تقليدي فقط. وعند تزويده بمنصة آلية، لا تكون هناك حاجة إلى قارئ أطباق متخصص. تنبيه: المواد الكيميائية التي تحتوي على BPA وestradiol خطيرة ويمكن أن يكون لها آثار ضارة على الجنين البشري.تعامل مع مسببات اضطرابات الغدد الصماء بحذر واستخدم دائمًا معدات الوقاية الشخصية المناسبة. في هذا العرض التوضيحي، سيتم تعريض أسماك zebrafish للإستروجينات 17 beta estradiol وbisphenol A وgenine بجرعات متنوعة، بدءًا من 48 ساعة بعد الإخصاب، وذلك بعد تربية أسماك zebrafish وجمع البيض ومساواته في العدد. وفقًا للنص، في يوم المعالجة، قم بتخفيف المحاليل الكيميائية المخزنة والمذابة بنسبة 1 إلى 1000 في 1 mL من E3 B plus PTU، ثم قم بالرج بقوة باستخدام جهاز vortex.كعينة تحكم للناقل. استخدم تخفيفاً بنسبة 1 إلى 1000 من DMSO في E3B و PTU باستخدام ماصة نقل بلاستيكية ذات فتحة واسعة. انقل ثلاثة أجنة لكل بئر في طبق ذي 96 بئراً، مع تجهيز ثلاثة آبار لكل حالة.تجنب وضع الأجنة في الآبار الخارجية لمنع تبخر الوسط خلال فترة المعالجة الطويلة. وبسرعة لتجنب جفاف الأجنة، قم بإزالة الوسط من كل بئر وأضف 200 microliters من محلول المعالجة المخلوط جيداً. تحقق بصرياً من أن جميع الأجنة مغمورة في المحلول وغير ملتصقة بجدار البئر.يتم تحضين الأجنة عند درجة حرارة 28.5 °C لمدة 72 ساعة بعد الإخصاب، ثم تُخدر الأجنة بإضافة 10 µL من محلول trica بتركيز 4 mg/mL إلى كل بئر. يوضع طبق الـ 96 بئر على منصة آلية، ويتم التشغيل باستخدام برنامج Zeiss Zen Blue 2011.قم بمعايرة المنصة عن طريق تحديد خيار حامل العينة واختيار multi well 96. ثم اختر معايرة قبل اتباع الإرشادات خطوة بخطوة، وباستخدام عدسة شيئية 10x وإعداد المجال المضيء أو BF، حدد جنينًا من مجموعة الضبط الموجبة واضبط إعدادات التعريض الضوئي بشكل مناسب لقنواتي BF و GFP، مع التأكد من أن إشارة الفلورة لا تؤدي إلى إشباع الكاميرا. ركز على جنين واحد وبرمج المجهر لالتقاط ما مجموعه ثلاثة مقاطع Z تتضمن صورة واحدة على بُعد 50 micrometers فوق مستوى التركيز الحالي وصورة واحدة على بُعد 50 micrometers تحته.بعد ذلك، يتم ضبط معاملات البرنامج للحصول على صورة مجمعة (tiled image) باستخدام قنوات GFP وBF. من علامة تبويب الاستحواذ (acquisition)، اختر الإعداد المتقدم (advanced setup)، ثم اختر مناطق التجميع (tile regions)، ثم المربعات (tiles). اختر الدائرة.من قائمة خيارات الآبار، اختر حامل الآبار وعامل التعبئة 90% لالتقاط صور متعددة للآبار المختارة، بحيث تكون 90% من مساحة كل بئر مرئية في الصورة المركبة. وتحت قائمة الخيارات، حدد مقدار التداخل المطلوب، مثل 5 إلى 10%، مما يضمن وجود وصلة سلسة بين الصور. ثم ابدأ عملية التصوير لالتقاط الصور يدويًا باستخدام عدسة شيئية 20 x وإعداد BF، وحدد جنينًا يعمل كعينة ضبط موجبة.اضبط إعدادات BF وGFP كما في السابق والتقط الصور. يوضح هذا الشكل صوراً مركبة من آبار فردية في لوحة ذات 96 بئراً. تتكون كل صورة من 59 صورة فردية مع تداخل في الصور بنسبة 5%.لاحظ أن أسماك الزيبرا الحية موزعة بشكل عشوائي داخل كل بئر. ومع ذلك، يمكننا تمييز الفلورة في القلب عن الفلورة في الكبد. وتعتبر صور المجال المضيء مفيدة كمراجع لتقييم اتجاه أسماك الزيبرا وتصور التشوهات المورفولوجية.تم التقاط الصور المعروضة هنا باستخدام عدسة شيئية بمسافة عمل طويلة وقوة تكبير 20x لإجراء تحليل أكثر تفصيلاً، وقد أُخذت مباشرة بعد المسح الآلي الذي عُرض للتو دون إزالة الطبق من منصة المجهر. وباستخدام عدسة شيئية 20x، يمكن تحديد موقع الفلورسنس في القلب بدقة عند الصمامات الأذينية البطينية التي تشير إليها الأسهم، والصمامات الأبهرية كما يوضح رأس السهم. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن التقاط صور من 3 أطباق بـ 96 بئرًا يوميًا.لا تنسَ أن العمل مع المركبات المسببة لاضطرابات الغدد الصماء قد يكون خطيراً، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات المناسبة مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية الملائمة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

semi-automated-imaging-tissue-specific-fluorescence-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

ووصف طريقة لphotoactivate الخلايا واحدة تحتوي على البروتين في قفص الفلورسنت باستخدام اثنين من الفوتون امتصاص من تي: الياقوت مذبذب يزر الفيمتو ثانية. إلى خريطة مصير الخلية photoactivated، يتم استخدام المناعية. ويمكن تطبيق هذه التقنية إلى أي نوع من الخلايا.

واحدة رسم الخرائط ذات الصلة مصير الخليوي في الزرد

المصدر: Zhang, X., et al. نموذج جنين سمك الزرد للتصور في الجسم الحي والتحليل داخل الحيوية لعدوى المكورات العنقودية الذهبية المرتبطة بالمواد الحيوية. J. Vis. خبرة. (2019)يوضح هذا الفيديو التصوير الفلوري لأجنة أسماك الزرد المحقونة بالمكورات العنقودية الذهبية ، مما يتيح التقدير الكمي لتطور العدوى وتوزيع البكتيريا لتقييم تأثير الكريات المجهرية للمواد الحيوية على تفاعلات المضيف والعامل الممرض في الجسم الحي.

 التصوير الفلوري للعدوى البكتيرية المرتبطة بالمواد الحيوية في أجنة أسماك الزرد

يمكن اتباعها لتطوير الزرد خلال الأيام مع المجهري ورقة الضوء عندما يتم تضمين الأجنة في أنابيب البوليمر واضحة بصريا مع منخفضة التركيز الاغاروز.

متعدد الطبقات لتركيب المدى الطويل المجهر الضوئي ورقة من الزرد

يمكن أن يلقي تصوير السلوك الديناميكي للعضيات والهياكل الخلوية الأخرى في الجسم الحي الضوء على وظيفتها في الظروف الفسيولوجية والمرضية. هنا ، نقدم طرقا لوضع علامات وراثية على عضيتين ، الجسيمات المركزية والميتوكوندريا ، وتصوير ديناميكياتها في أجنة الزرد الحية باستخدام الفحص المجهري واسع المجال ومتحد البؤر.

التصوير الهياكل التحت خلوية في الأجنة الحية اسماك الزرد

الانقسام الحي أمر بالغ الأهمية لكل كائن حي وغالبا ما تؤدي العيوب إلى السرطان واضطرابات النمو. باستخدام بروتوكول التصوير هذا وسمك الزرد كنظام نموذجي ، يمكن للباحثين تصور الانقسام في كائن فقاري حي والعديد من العيوب التي تنشأ عندما تكون العمليات الانقسامية معيبة.

مراقبة قسم الميتوزى وديناميكية في الأجنة الزرد لايف

أهداب التنمية أمر حيوي ل organogenesis السليم. ويصف هذا البروتوكول أسلوب أمثل التسمية ووضع تصور لخلايا عضو من الزرد.

تصور الخلايا مولتيسيلياتيد في الزرد من خلال بروتوكول مجتمعة في الموقع كله جبل فلوري التهجين والفلوره

Microinjection اليرقات والأجنة الزرد أسلوب حاسم ولكنها صعبة المستخدمة في نماذج الزرد كثيرة. نقدم هنا، مجموعة من الأدوات عبارة للمساعدة في تحقيق الاستقرار والتوجه الزرد microinjection والتصوير.

أجهزة ميكروستروكتوريد Microinjection الأمثل وتصوير يرقات الزرد

ويبين هذا البروتوكول الفلورة المناعية المتسلسلة والكيمياء المناعية على التبريد من أجنة سمك الحمار الوحشي في المرحلة المبكرة مما يتيح إجراء تحليلات دقيقة للتوطين المشترك في مجموعات خلايا محددة.

الفلورة المناعية المتسلسلة والكيمياء المناعية على أجنة حمار وحشي مقطعة بالتبريد

يصف هذا البروتوكول نهجا لوضع العلامات في توتو والتصوير متعدد الأبعاد لسمك الحمار الوحشي في وقت مبكر من نمو العين. نحن نصف وضع العلامات والتضمين والتصوير رباعي الأبعاد (4D) باستخدام المجهر confocal المسح بالليزر ، واعتبارات لتحسين الحصول على مجموعات البيانات لتشريح آليات مورفوجينيسيس كوب البصرية.

4-التصوير الأبعاد من زيبرافيش كأس البصرية Morphogenesis

يستخدم هذا البروتوكول التصوير بالورقة الضوئية للتحقيق في وظيفة انقباض القلب في يرقات الزرد واكتساب نظرة ثاقبة لميكانيكا القلب من خلال تتبع الخلايا والتحليل التفاعلي.

4D ضوء ورقة التصوير من تقلص القلب الزرد

تم وصف استراتيجية تحضير العينة لتصوير أجنة الزرد المبكرة داخل مشيمة سليمة باستخدام مجهر صفائح ضوئي. يحلل الاتجاهات المختلفة التي تكتسبها الأجنة داخل المشيمة في مراحل 70٪ من المشيمة والبراعم ويفصل استراتيجيات التصوير للحصول على دقة على نطاق خلوي في جميع أنحاء الجنين باستخدام نظام الورقة الضوئية.

التصوير المجهري للورقة الضوئية واستراتيجيات التركيب لأجنة أسماك الزرد المبكرة

اكتشف التصوير شبه الآلي للخلايا المستجيبة للإستروجين في أجنة الزرد باستخدام المجهر الفلوري. يُمكّن هذا البروتوكول الباحثين من دراسة نشاط مستقبلات الإستروجين في الأنسجة الحية بدقة عالية.

التصوير الآلي شبه الإسفار من الأنسجة محددة في الزرد الأجنة

استكشف المزيد من الفيديوهات