Name: تقييم مساهمات أنواع محددة لتنمية الجمجمة عن طريق الوهم السمان بطة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: اكتشف كيفية إنشاء أجنة كيميرية بين السمان والبط لدراسة مساهمات الخلايا العصبية الظاهرية في تطور الجمجمة والوجه. تساعد هذه الطريقة الباحثين على فهم الأنماط النوعية للأنواع.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للأبحاث الأسنان والجمجمة (NIDCR) منحة F32 (DE021929) لJLF ومنحة DE016402 NIDCR R01 إلى RAS

1. إعداد الإبر التنغستن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع قضيب التنغستن في نصف باستخدام قواطع للاسلاك بحيث قضيب لا ينحني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموضوع قضيب حتى نهاية مدبب من 5 3/4 في الزجاج البورسليكات باستور ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك حوالي 3/4 في قضيب الشائكة للخروج من الزجاج، والتمسك قضيب لغيض ماصة مع حبة صغيرة من &quot;لاصقة تذوب الساخنة&quot; (HMA)، وهو عصا الغراء يستخدم لمسدس الغراء. وHMA ينبغي ذاب سريعا في لهب الكحول، مع الحرص على عدم حرق الغراء وتوليد الدخان الاسود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام زوج من ملقط، ثني غيض من قضيب التنغستن (حوالي 1/4 في نهاية من أعلى) حتى يتم التوصل إلى زاوية 45 درجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد ماصة باستور، ووضع حوالي 1/8 في لغيض من قضيب التنغستن في لهب الشعلة البروبان. عقد غيض ثابت ومتعامدة تماما مع اللهب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب الإبرة من اللهب لحظة بقعة صغيرة من البرتقال tungsعشرة الذباب الخروج من إبرة. </li></ol> 2. إعداد سبيمان الماصات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام موقد بنسن، تسخين نهاية ضيقة من ماصة باستور الزجاج حتى ما بعد فترة وجيزة من تفتق يبدأ في الذوبان. إزالة من اللهب وسحب غيض حتى يصبح مختومة ماصة. تأكد أنه لا يزال هناك جزء من جزء مدبب يحتوي على ما يقرب من OD 0،7-1،0 مم. كسر نهاية أغلقت حوالي 4 سم من تفتق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق حوالي 2 قدم (60 سم) من أنابيب مطاطية لواسعة (مفتوح) نهاية ماصة. ضربة على الطرف الآخر من الأنبوب المطاطي لضمان عدم وجود الهواء يمكن أن تمر من خلال جزء مدبب من ماصة باستور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام اسطوانة الوقود البروبان مع تعلق لهب الشعلة قلم رصاص، وتسخين مساحة البيضاوي على جانب واحد من ماصة أسفل بداية تفتق. ضربة الهواء بلطف شديد ومستمر من خلال أنابيب المطاط مع كمية ضئيلة من الضغط (حوالي كمية الضغط اللازم أن أقول بداية letteص &quot;P&quot; على مستوى محادثة). عندما يصبح الزجاج الناعمة على جانب واحد ويبدأ في مشبك الخارج، وإزالة بسرعة ماصة من اللهب وضربة الثابت والمطرد من خلال أنابيب المطاط. وسوف يسبب هذا الجزء ساخنة من الزجاج لتشكيل فقاعة على شكل النقانق التي قد البوب، التي على ما يرام. إذا كانت فقاعة صغيرة جدا، في محاولة ذوبان وتهب الزجاج مرة أخرى. ينبغي أن يكون نافذة مفتوحة النهائي في الزجاج نحو 0.25 في (6.35 ملم) واسعة بنسبة 0.5 في (12.7 ملم) لفترة طويلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مشيرا نهاية مدبب صعودا، كشط فقاعة في حاوية النفايات الزجاجية في حين تهب بلطف من خلال أنابيب لمنع شظايا الزجاج من دخول ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام لهب البروبان وحرق الحواف المتبقية من فقاعة والنار البولندية الجانبين من نافذة مفتوحة. والحرص على عدم إذابة رمح ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام قلم رصاص نقطة الماس، والنتيجة نهاية مدبب من ماصة حوالي 1.25 في (30 ملم) من النافذة وكسر قبالة الطرفمع ملقط بحيث يتم خفض افتتاح ماصة نظيفة (ماصات مع نصائح تجاهل مكسورة أو غير متساو). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط وحافة لهب الموقد من الكحول، وثني الجزء الضيق من ماصة 0.375 في (9.5 ملم) من طرف إلى زاوية من 60 درجة تقريبا بحيث الجزء عازمة هو في الطائرة العمودية عند فتح نافذة هو في موقف 1:00 للاستخدام اليد اليمنى والساعة 11:00 لاستخدام أعسر. تتم هذه الخطوة في أفضل خالية من مشروع ضميمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النار تلميع غيض باستخدام لهب الكحول تحت المجهر تشريح. تأكد من عدم إغلاق قبالة الطرف بل تبقي افتتاح الجولة وسلس دون أي انقباض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع 1 في (25 ملم) قطعة من أنابيب المطاط، رش قطعة من الأنابيب مع الايثانول 70٪، وحرك الأنبوب على رمح من ماصة حتى يتم تغطية افتتاح نافذة تماما. هذا يعمل باسم &quot;الحجاب الحاجز&quot; من ماصة سبيمان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لمبة مل اللاتكس المطاط 2على الجزء السفلي المفتوحة للماصة. يحافظ على لمبة الضغط السلبي في ماصة سبيمان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لممارسة باستخدام ماصة سبيمان، نقل حبات اللوني حوالي 100-200 ميكرون في القطر من بقعة ملحوظ في واحدة طبق بيتري إلى بقعة ملحوظ في آخر تحت المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتنظيف ماصة سبيمان، وإزالة لمبة المطاط ومكان ماصة، تلميح إلى أسفل، في كوب طويل القامة اصطف مع القطن أو الشاش على الجزء السفلي ومملوءة بالماء المقطر والمنظفات والأواني الزجاجية. </li></ol> 3. تعقيم واحتضان البيض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح البيض مع الايثانول 70٪ ووضع البيض على أطباق البيض من البلاستيك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين البيض في حاضنة ساخنة في 37.5 درجة مئوية و 85-87٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان البيض حتى تصل HH9.5، ما يقرب من 26 ساعة لالسمان والبط 48 ساعة ل. </li></ol> 4. نافذة بيض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة قطعة صغيرة من الغلاف الخارجي من الجزء العلوي من البيض مع ملقط، مع الحرص على عدم ثقب قذيفة الداخلية مembrane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام حقنة مع 18 G بمقدار 1 بوصة إبرة، كزة حفرة في أضيق غيض من البيض وسحب ما يقرب من 1-2 مل من الزلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشريط الشفاف خلال ثقب وثقب علامة في وعاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع &quot;نافذة&quot; على طول السطح العلوي للبويضة (من خلال الشريط الشفاف) باستخدام مقص المنحني. </li></ol> 5. تصور الأجنة والتحضير للجراحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام قضيب الزجاج، وفرشاة بلطف كمية صغيرة من الأحمر محايد (0.02 جم / مل في BSS هانك) على الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الغشاء المحي وتسحبه على الجنين باستخدام إبرة التنغستن شحذ-اللهب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة ختم البيض عن طريق وضع شريط شفاف على النافذة. </li></ol> 6. فصل الأنسجة المانحة من الأجنة المانحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشريط من نافذة على بيضة الجنين المانحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لخفض أضعاف العصبية من الأديم الظاهر المتاخمة للجنين المانحة، وجعل الشقوق على حد سواء SIDوفاق في الأنبوب العصبي، وذلك باستخدام إبرة التنغستن شحذ-اللهب (المصنعة كما هو موضح أعلاه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم، وقطع عبر الأنبوب العصبي على المستويين الأمامي والخلفي المطلوب من الكسب غير المشروع وفصل الكسب غير المشروع عن بقية الأنبوب العصبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أضعاف العصبية من الجنين المانحة باستخدام ماصة سبيمان أو أي نوع آخر من micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم، قم بإزالة الشريط من نافذة على البيض المضيفة واستخدام ماصة سبيمان لوضع العصبية أضعاف المانحة إلى جانب الجنين المضيف المتاخمة لمنطقة الأنبوب العصبي الذي سيتلقى عملية الزرع. </li></ol> 7. فصل الأنسجة المضيف وزرع الأنسجة المانحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل أضعاف العصبية من الأنبوب العصبي للجنين المضيف، كما فعلت مع الجهة المانحة. الحرص على إزالة الكسب غير المشروع متساوية في الحجم مثل الأنسجة المانحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دفع برفق هذا النسيج المضيف بعيدا عن الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم، مع إبرة التنغستن حادة أو مدورة غيض من ميلcropipette، حرك بلطف العصبية المانحة أضعاف في الأنبوب العصبي المضيفة، والحفاظ على التوجهات انتيرو الخلفي وظهراني بطني المناسبة. تأكد من هو مدسوس الكسب غير المشروع في طول الجانبين ولكن تأكد من عدم لكزة أو الأضرار التي لحقت الأنسجة الكامنة. للمساعدة على ابقاء المسار من المذكرة التوجه الأصلي أي التفاوت في الأنسجة المانحة أو تلطيخ التفاضلية من الأحمر لاشئ. نحن أيضا الصور ثيقة الجنين المانحة مع الأنسجة رفعه المصاحبة لها، فضلا عن الوهم على الفور بعد الجراحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن يضاف ملحي معقم إلى البويضة إذا تبين الجنين المضيف علامات الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن، بعناية إعادة الختم وتسمية البيض، وبلطف إعادته إلى حاضنة الرطوبة العالية (70-80٪) حيث يمكن للجنين خيالية تطوير إلى المرحلة المطلوبة للتحليل. </li></ol> 8. مجموعة من الوهم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من جمع الأجنة خيالية في تقدم طازجة تثبيتي الباردة سيرا ووضعها فورا على ريال عمانيCKER في 4 درجات مئوية لO / N التثبيت. وهذا سوف يسمح لمزيد من الكشف عن الخلايا الحساسة السمان مع الأجسام المضادة لمكافحة السمان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليحلل التعبير الجيني عن طريق RT-QPCR، وتجميد الأجنة مباشرة في النيتروجين السائل قبل استخراج الحمض النووي الريبي. </li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

قمة العصبية هي الخلايا الجنينية السكان عابرة أن يهاجر على نطاق واسع في جميع أنحاء الجنين ويفرق في أنواع الخلايا المتنوعة، بما في ذلك غضروفية وبانيات، التي تسهم في الهيكل العظمي القحفي. وقد ساهم زرع قمة العصبية في النظام خيالية السمان البطة إلى حد كبير في فهمنا للتفاعلات الأنسجة ومسارات الإشارات التي تنظم تطوير الهيكل العظمي القحفي. ومع ذلك، وبالنظر إلى الإمكانات الهائلة للقمة العصبية لتوليد خلايا العضلات الملساء أيضا، الخلايا الشحمية، الخلايا الصباغية، وخلايا شوان، والخلايا العصبية، ونظام الوهم السمان بطة لديها امكانات هائلة لتطبيقات المستقبل، لا سيما بالتزامن مع التقدم السريع في بيولوجيا الخلايا الجذعية والطب التجديدي. منذ السمان والبط وكلاهما الأنواع المرباة تجاريا، وإمدادات جاهزة من البويضات المخصبة غير مكلفة نسبيا هو متاح من مجموعة متنوعة من المزارع. وبالتالي، ينبغي أن تكون هذه التقنية في متناول الأبحاث وراتبها العاملة ضمن مجموعة واسعة من الميزانيات ومساحة المنشأة. على الرغم من أن هذه التقنية هي قوية جدا، لا تزال هناك العديد من القيود. مثل تقنيات جراحية أخرى، ونوعية وجدوى الوهم السمان بطة الاعتماد على المهارات الجراحية للباحث، وبالتالي، لن يكون هناك اختلاف بين أكثر وداخل الفرد بين التجارب بالمقارنة مع نماذج أخرى، مثل تلك التي تستخدم الماوس علم الوراثة. وعلاوة على ذلك، هناك أيضا تباين في معدلات التنمية ومراحل الأجنة الفردية التي تسهم في استنساخ ونجاح كل زرع. أجنة الطيور هي أيضا عرضة للجفاف وبالتالي تشمل الخطوات الحاسمة أثناء الجراحة الحفاظ على مستويات الضوء المنخفضة، وهي المرة تحت المجهر إلى أدنى حد ممكن، والبيض مختومة بالشمع قدر الإمكان، وارتفاع نسبة الرطوبة في الحاضنة بعد الجراحة ل تجنب الجفاف. من حيث الجدوى من الوهم، شيو sually بين 50-75٪ البقاء على قيد الحياة، على الرغم من هذه النسب يمكن أن تقلل من كبار السن في مرحلة جمع. في جلسة 4-6 ساعة نموذجية من الجراحة، يمكن للجراح من ذوي الخبرة تولد 10-15 الوهم. نجاح زرع يعتمد أيضا إلى حد كبير على نوعية الأدوات. أدوات جيدة تؤدي إلى أكثر اتساقا، والنتائج استنساخه. باستخدام الشعلة البروبان لجعل الإبر التنغستن يسمح الإبر الحادة للغاية في هذا الشأن. نوع الشعلة تستخدم لإحداث فرق كبير لأنه يتحكم في حجم اللهب. ويمكن أيضا أن تستخدم شحذ كهربائيا، ولكن هذا النهج لا يقترب حتى من إنتاج الإبر الحادة كما. استخدام قضبان التنغستن بدلا من الأسلاك المخزنة مؤقتا بحيث الإبر ويمكن إجراء على التوالي. وmicropipette سبيمان، في حين تستغرق وقتا طويلا وصعبا لجعل، هو أداة مثالية لنقل الأنسجة. يمكن تخصيص ماصة مع فتحات مختلفة الحجم، ويمكن استخدامها مرارا وتكرارا. وثمة عامل حاسم لالنقيبالجا سبيمان micropipette هو أن يكون بعض السوائل في ماصة قبل لمس طرف على سطح الجنين. وبعض من السائل تتدفق دائما عندما يتم الاتصال مع الغضروف المفصلي على الجنين. الضغط على الحجاب الحاجز يسمح الأنسجة السوائل والكسب غير المشروع يمكن إخراجه بدقة متناهية، في حين أن السماح بارتفاع طفيف على الحجاب الحاجز تمتص بلطف الكسب غير المشروع الأنسجة المانحة في ماصة. الحفاظ على القليل من الضغط الايجابي على الحجاب الحاجز تحافظ على الأنسجة الكسب غير المشروع المانحة في غيض من ماصة أثناء النقل، وضغط إضافية قليلة على الحجاب الحاجز يسمح الأنسجة المانحة الكسب غير المشروع لتوضع عمدا في البلد المضيف. لحماية ماصة سبيمان أثناء التخزين والتعقيم، وإزالة لمبة من نهاية واسعة وبعناية إدراج غيض مدبب إلى لمبة. وضع ماصة سبيمان في أنبوب اختبار زجاجي، وتغطي الجزء العلوي مع رقائق الألومنيوم، والأوتوكلاف قبل الجراحة. بعد ماصات متعددة هي إعادةعدي المراد تعقيمها مرة أخرى لإجراء عملية جراحية، عكس الماصات، تسخين منهم تقريبا ليغلي في نفس الحل من الماء المقطر والمنظفات والأواني الزجاجية، ثم شطف مرارا مع الماء المقطر. ماصات الأوتوكلاف في أنابيب الفردية. يجب أن يتم استبدال أنابيب المطاط الذي يشكل الحجاب الحاجز وبعد عدة لمبة المطاط التعقيم أو عندما تصبح مظلمة وقاسية. العديد من مكونات هذا البروتوكول تنطوي المعدات الخطرة. على سبيل المثال، فإن الإجراء لصنع سبيمان Micropipette ينطوي على ثلاثة أنواع من النيران وكذلك التدفئة، وسحب، وتهب، والانحناء، وقطع، وتلميع الزجاج. وبالتالي، وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة (PPE) أن يزيد من السلامة مثل نظارات واقية ومعطف المختبر أمر بالغ الأهمية. بالإضافة إلى ذلك، لأن الكثير من الناس يعانون من، أو لديها القدرة على تطوير والحساسية البيض، ودائما استخدام قفازات عند التعامل مع البيض. مع هذه الاحتياطات في الاعتبار، ونظام خيالية السمان بطة طسا طريقة آمنة وفعالة، ويمكن الوصول إليها نسبيا والتي لديها العديد من التطبيقات المستقبلية.

الهيكل العظمي الوجه يتطور من النمو واندماج العمليات الوجه المتعددة التي تتكون من قمة العصبية وأرومية متوسطة اللحمة المتوسطة محاطة الأدمة والطبقات الظهارية الأديم الباطن 1-11. تخضع الأحداث التخلق في كل عملية من قبل التفاعلات إشارات متميزة بين اللحمة المتوسطة وظهائر المحيطة 12-16. تعديلات على هذه التفاعلات إشارة و / أو المستجيبات المصب على المساهمة في الظواهر والأمراض قد تكون ذات صلة أيضا تطور الهيكل العظمي القحفي 17، 18. لذلك، توضيح توقيت وطبيعة التفاعلات الأنسجة لديها امكانات كبيرة لزيادة فهمنا للبيولوجيا التطورية والتنموية من الهيكل العظمي في الوجه. استخدام الأجنة خيالية للتحقيق في التفاعلات الأنسجة لديها تاريخ طويل في البيولوجيا التطورية. كان رائدا هذا النهج هانز سبيمان ومختبرهالذي اكتشف الجنينية &quot;المنظمين&quot; عن طريق زرع أنسجة الأجنة بين الأنواع البرمائية مختلفة. كان سبيمان على درجة الماجستير من التقنيات الجراحية الدقيقة التي تم استكمالها تطوره من الأدوات المتخصصة، ولا سيما ماصة سبيمان مهارات اليد. وكان فيكتور همبرغر وهو طالب دراسات عليا في مختبر هانز سبيمان في فرايبورغ خلال 1920s، وهو عندما أجريت التجارب زرع الأصلية التي أدت إلى جائزة نوبل سبيمان. عندما انتقلت همبرغر لجامعة واشنطن في سانت لويس في عام 1935، وقال انه مفصل عملية صنع micropipette سبيمان في دليل له من علم الأجنة التجريبية 19. كان درو Noden وهو طالب دراسات عليا في مختبر همبرغر في جامعة واشنطن حتى عام 1972، وبعد انتقاله إلى جامعة ماساشوستس، أمهرست ثم إلى جامعة كورنيل، واصلت Noden افتعال وباستخدام بال micropipettes سبيمان لزرع الجراحية التي تنطوي الوهم السمان-الفرخ. و# 160؛ في حين طالب دراسات عليا، واحدة من الكتاب (ريتش شنايدر) تدرب مع درو Noden في جامعة كورنيل 1995-1998 ويستند البروتوكول التالي لصنع micropipette سبيمان على أوصاف مكتوبة من قبل همبرغر وNoden، وتشمل التعديلات اللاحقة التي بواسطة شنايدر. كان رائدا في استخدام الوهم السمان-الفرخ لدراسة تطوير القحفي وخصوصا لفهم المساهمات من الخلايا العصبية التي كتبها قمة Noden ولو Douarin في أوائل 1970s، استعرض في لو Douarin وآخرون 20. وقد اعتمد هذا النهج على نطاق واسع في العديد من الدراسات والعديد من المحققين الآخرين 1، 4، 5، 21-38. معدلات يعادل النمو والتشكل من السمان وفرخ جعل زرع داخل يجعلها مثالية لدراسة مصير الخلايا وتتبع النسب. ومع ذلك، ونظرا للتشابه بين السمان وفرخ، والتغيرات المورفولوجية دائرة الهجرة والجنسيةuced بواسطة الخلايا المانحة يصعب فك. في المقابل، وشملت غيرها من نظم خيالية الطيور البط المحلية باعتبارها وسيلة لدراسة الآليات التي تجعل الأجنة متميزة تشريحيا 39-50. وبشكل أكثر تحديدا، فإن النظام خيالية السمان بطة يقدم فوائد متعددة لالمميزين آثار المانحة على المضيف، والعكس بالعكس. الأولى، والسمان والبط الأجنة تختلف في حجم الجسم والشكل، والذي يوفر وسيلة مباشرة لاستكشاف أو المانحين آليات المضيف محددة من تشكيل نمط من قبل يعاير للنطاقات الفرق في التعبير الجيني (الشكلان 1 A و B). الثانية، والسمان والبط الأجنة لديهم معدلات مختلفة إلى حد كبير من النضج، مع السمان تفقيس في 17 يوما والبط تفقيس في 28 يوما. يحافظ على قمة العصبية المزروعة معدل نضوج الجوهرية في إطار البيئة المضيفة، وبالتالي، تحديد التغيرات الزمانية في التعبير الجيني، والتفاعلات الأنسجة، وتكون الأنسجة، والتشكل من الممكن51-57. وأخيرا، فإن الأجسام المضادة النووية المضادة للالسمان (س ¢ PN) يسمح المانحة والمضيفة المساهمات الخلوية لتكون متميزة عن بعضها البعض بشكل دائم من خلال الاعتراف البروتين الذي يتم التعبير بتواجد مطلق في خلايا السمان ولكن غاب عن خلايا بطة.

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>TEK</td><td>TEKZR114</td><td></td></tr><tr><td>هانك s BSS w / o الفينول الأحمر</td><td>Invitrogen</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>أحمر محايد</td><td>سيجما Aldrich</td><td>N4638-5G</td><td>0.22 & مايكرو ؛ م</td></tr><tr><td>إبر معقمة بالفلتر 18 جرام</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>5 مل حقنة</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>رقم 5 ملقط دومون</td><td>أدوات العلوم الدقيقة</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>مقص مستقيم</td><td>أدوات العلوم الدقيقة</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>مقص منحني</td><td>أدوات العلوم الدقيقة</td><td>14029-10</td><td></td></tr><tr><td>ماصة</td><td></td> <td>سبيمان</td><td>مصنوع يدويا في</td></tr><tr><td>المختبر حامل</td><td></td><td></td> البيض <td>منفضة سجائر زجاجية ونمذجة من الطين</td></tr><tr><td>موقد الكحول</td><td>فيشر</td><td>04-245-1</td><td></td></tr><tr><td>شريط شفاف</td><td>3M سكوتش</td><td>600</td><td></td></tr><tr><td>قضيب تحريك زجاجي</td><td>فيشر</td><td>11-380C</td><td>يتم تضييق الطرف وتقريبه باستخدام سلك تنجستون لهب</td></tr><tr><td>(0.004 × 3 بوصات)</td> <td>أنظمة AM</td><td>7190</td><td>يتم شحذ الطرف باللهب في شعلة البروبان</td></tr><tr><td>Bunsun Burner</td><td>Fisher Scientific</td><td>S49117</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>22-183-632</td><td>9 بوصة (229 مم)</td></tr> <tr><td>أنابيب مطاطية</td><td>فيشر Scientific</td><td>14-178C</td><td>كهرماني ، مطاط طبيعي رقيق الجدار ؛ سمك الجدار: 0.0625 بوصة / 1.6 مم ؛ OD: 0.375 بوصة / 9.5 مم ؛ معرف: 0.25 بوصة / 6.4 مم</td></tr><tr><td>أسطوانة وقود البروبان</td><td>BernzOmatic</td><td>UL2317</td><td>TX-9 بنمط الشعلة "A" مع شعلة نحاسية لولبية "لهب قلم رصاص"</td></tr><tr><td>قلم رصاص</td><td>فيشر Scientific</td><td>22-268912</td><td></td></tr><tr><td>لمبات مطاطية</td><td>Fisherbrand</td><td>S32325</td><td></td></tr></tbody></table>

تقييم مساهمات أنواع محددة لتنمية الجمجمة عن طريق الوهم السمان بطة

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

توليد أجنة خيالية هو نهج واسع النطاق وقوية لدراسة مصير الخلايا والتفاعلات الأنسجة، والمساهمات أنواع محددة إلى النسيجي والتنمية المورفولوجية للأجنة الفقاريات. على وجه الخصوص، وقد أنشأت استخدام الأجنة خيالية على أهمية قمة العصبية في توجيه التشكل أنواع محددة من مجمع القحفي. الطريقة الموصوفة هنا يستخدم اثنين من أنواع الطيور والبط والسمان، مع مختلف بشكل ملحوظ التشكل القحفي. هذا الأسلوب يسهل كثيرا من التحقيق في تنظيم الجزيئية والخلوية من نمط أنواع محددة في مجمع القحفي. تجارب في السمان والبط الأجنة خيالية وقد كشفت بالفعل العصبية التفاعلات الأنسجة بوساطة قمة والسلوكيات خلية مستقلة التي تنظم نمط أنواع محددة في الهيكل العظمي القحفي، الجهاز العضلي، وإهاب. التنوع الكبير في المشتقات قمة العصبية تقترح إمكانية كبيرةللتطبيقات المستقبلية لنظام خيالية السمان بطة لفهم تطور الفقاريات، والمرض، والتطور.

قبل إجراء مزيد من التحليل، وكفاءة عملية الزرع يحتاج إلى أن يعاير. لالنسيجي وتحليل الصرفي، أو التعبير الجيني على عينات الأنسجة، ويجب أن يتم الكشف عن الخلايا المناعية باستخدام السمان التي كتبها س ¢ PN الضد كما هو موضح 36. لتحليلات الحمض النووي الريبي، والمساهمات أنواع محددة لأنسجة الفائدة يمكن حسابها باستخدام إستراتيجية تعتمد PCR-58. بعد أن تم التحقق من صحة فعالية عملية الزرع، يمكن تقييم نتائج المزيد من التدابير الشكلية أو الجزيئية في الوهم. التفاعلات بين الخلايا العصبية قمة المانحة والأنسجة المحيطة المستمدة من المضيفة التي تكمن وراء تكون الأنسجة السليمة والتشكل من مجمع القحفي سبق دراستها على نطاق واسع. على وجه الخصوص، العصبية قمة اللحمة المتوسطة يوجه التشكل أنواع محددة من الوجه 7، 13، 51، 59، 52 نمط الريش، ونمط العضلات 56 </s<html> تصل&gt;، والغضاريف 53 و 57 من خلال تنظيم التعبير الجيني المضيف. على سبيل المثال، العصبية قمة اللحمة المتوسطة يملي عندما أشكال العظام في الفك السفلي من خلال تنظيم زمنيا BMP4 التعبير 55. في الآونة الأخيرة، وتركزت التحقيقات على التفاعلات التي تحدث في الأنسجة تطوير القحفي في وقت مبكر جدا. في هذا الصدد، وقد أظهرت التجارب باستخدام الوهم السمان بطة الأجنة المضيفة تؤثر الهجرة قمة العصبية من خلال تحديد الحدود المورفولوجية. وهذا هو، في الأجنة quck خيالية السمان المانحة الخلايا العصبية قمة تهاجر إلى المضيف بطة قوس الفك السفلي في نمط مثل بطة (1D الشكل). على الرغم من هذه المساهمة المضيف لحجم السكان قمة العصبية، لا تزال قمة العصبية المانحة لإنشاء هيكل عظمي الفك السفلي الذي هو في حجم وشكل (الشكل 1E) مثل السمان. ه 1 &quot;لل: محتوى العرض =&quot; 6in &quot;FO: SRC =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1highres.jpg &quot;سرك =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1.jpg &quot;/&gt; الشكل 1. السمن بطة نظام همي. (A) السمان و (B) عرض جماجم بطة اختلافات كبيرة في الحجم والشكل، وبالتالي، هي مناسبة بشكل مثالي لاستخدام نظام خيالية لدراسة تطوير القحفي (معدلة من تقية وآخرون 56). (C) تصميم التجريبية لتوليد من جانب واحد الأجنة quck خيالية من مطابقة المرحلة HH9.5 السمان والبط الأجنة. تتم إزالة حظيرة العصبية من جانب واحد من الأجنة السمان وزرعها في أجنة البط بعد قطعة يعادل أضعاف العصبية تمت إزالة (D) الخلايا المانحة السمان (الأخضر) يمكن اتباعها في الوهم باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة السمان (Q ¢ PN) كما هو مبين في عرض بطني من HH12 الجنين خيالية. (F) في الفك السفلي quck في HH38، والسمان المانحة المستمدة ميكل7، ق الغضروف هو أقصر وأكثر استقامة من تلك التي لوحظت لبطة المستمدة من المضيفة غضروف ميكل المقابل، الذي هو أكبر والمنحنية. طبع Tokita آخرون، ديف. الحيوي. 306، 377 (2007) بإذن من السيفير.

توضح هذه المقالة طريقة لتوليد أجنة خيالية التي تم تصميمها لاختبار المساهمات أنواع محددة من قمة العصبية و / أو الأنسجة الأخرى في التنمية القحفي.

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام خيمرات القناة في السمان كوسيلة لاستقصاء الآليات التي تولد من خلالها خلايا العرف العصبي أنماطاً خاصة بالأنواع أثناء التطور القحفي الوجهي. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تشريح وإزالة شريط من الطية العصبية من منطقة الدماغ الخلفي الوسطى والأمامية لجنين سمان في المرحلة 9.5. وتتضمن الخطوة الثانية نقل الطية العصبية المتبرع بها من السمان إلى جنين البطة المضيف.تتضمن الخطوة الثالثة تشريح وإزالة المنطقة المعادلة من جنين بطة مضيف في المرحلة 9.5. والخطوة النهائية هي وضع الطية العصبية الملتفة في منطقة منتصف ومقدمة الدماغ الخلفي للبطة. وفي النهاية، يمكن للأجنة الخيمرية الناتجة تحديد التغيرات في التعبير الجيني التي تتوسطها العرف العصبي من خلال التهجين الموضعي، كما يمكنها الكشف عن التغيرات المورفولوجية من خلال التحليلات النسيجية.لقد خطرت لي الفكرة الأولى لهذه الطريقة عندما كنت أشاهد البجع البني وهو يطير فوق شاطئ أوشن بيتش في سان فرانسيسكو. وأدركت أن خلايا العرف العصبي يجب أن تكون هي مصدر النمط الخاص بالنوع، بما أنها تعطي المنشأ للعظام والغضاريف في هيكل منقارها الطويل. وبالرغم من أنني لم أتمكن من العثور على بيض البجع البني، فقد استطعت العثور على بط بكين الأبيض.بما أن مدينة سان فرانسيسكو تضم أكبر حي صيني خارج آسيا، وبمن خلال استغلال الاختلافات في معدلات النضج والمورفولوجيا بين السمان والبط، يمكن لهذه الطريقة أن تساعدنا في الإجابة على أسئلة رئيسية في علم الأحياء التنموي، مثل فهم أصول الأنماط الخاصة بالأنواع. ستقوم بإجراء الجراحة الدكتورة Jennifer Fish، وهي باحثة ما بعد الدكتوراه في مختبري، وستقوم بالمساعدة Kate Ovitz، وهي طالبة دراسات عليا. باستخدام موقد بنزن، قم بتسخين الطرف الضيق لماصة باستور حتى يبدأ الزجاج على طول المستدق في الانصهار، ثم ارفعها عن اللهب واسحب الطرف حتى تصبح الماصة محكمة الإغلاق.تأكد من أن جزءاً من الجزء المستدق له قطر خارجي يتراوح بين 0.7 و1 ملم. بعد ذلك، قم بكسر الطرف المختوم على بُعد حوالي 4 سم من الجزء المستدق. ثم، قم بتوصيل حوالي قدمين من الأنابيب المطاطية بالطرف المفتوح من الماصة مع النفخ في الطرف الآخر.يجب ألا يتسرب الهواء عبر الوصلة أو الطرف الآخر من الماصة أثناء تسليط ضغط خفيف عن طريق النفخ في الأنبوب. استخدم قلم بروبان أو مشعل لهب لتسخين منطقة بيضاوية على أحد جانبي الماصة أسفل بداية التخصر مباشرةً. وبمجرد أن يبدأ الزجاج في الانبعاج للخارج، اسحب الماصة من اللهب وانفخ بلطف عبر الأنبوب المطاطي.سيؤدي ذلك إلى تشكيل فقاعة على شكل سجق في الجزء المسخن من الزجاج. ومن الضروري تجنب تسليط ضغط زائد لأن ذلك قد يؤدي إلى انفجار الفقاعة الزجاجية. يجب أن يكون عرض النافذة الناتجة في الماصة حوالي 1 cm، وطولها من 1.5 إلى 2 cm.الآن وجه الطرف المستدق للأعلى واكشط الفقاعة في حاوية نفايات زجاجية مع النفخ بلطف عبر الأنبوب لمنع دخول شظايا الزجاج إلى الماصة. ثم باستخدام لهب البروبان، قم بحرق الحواف المتبقية من الفقاعة بعناية وقم بصقل جوانب النافذة المفتوحة حرارياً. بعد ذلك، أمسك قلم سن الماس في وضع عمودي، واستخدم قلم سن الماس لخدش الطرف المستدق للماصة على بُعد سنتيمتر واحد من بداية التدرج.باستخدام الملاقط، اكسر الماصة بلطف عند الخط المحزز. ولإزالة الطرف، افحصها تحت مجهر تشريحي للتأكد من أن الكسر نظيف وغير مسنن. أمسك الماصة كما يمسك المرء القلم، مع وضع إصبع السبابة فوق الفتحة على مسافة 9.5 millimeters تقريبًا من الطرف.قم بتليين الزجاج الموجود على الماصة عن طريق إمساكها بجوار حافة لهب موقد كحولي. اضغط على الطرف باستخدام ملقط لثني الطرف الضيق من الماصة لأسفل بزاوية 60 درجة تحت مجهر تشريحي. وبسرعة وحذر، قم بتلميع الطرف باللهب باستخدام الموقد الكحولي.يجب أن تكون الفتحة النهائية مستديرة وغير مسدودة. لاحظ أن الطرف سيصبح متضيقاً وغير قابل للاستخدام إذا تم تعريضه للهب لفترة طويلة جداً. الآن، قم بتزييت قطعة من الأنبوب المطاطي بطول 2.5 centimeter باستخدام 70% ethanol.قم بتمريره فوق ساق الماصة من الأسفل إلى الأعلى لتغطية النافذة المفتوحة. بعد ذلك، ضع بَصيلة لاتكس سعة 2 mL على الطرف المفتوح من الماصة. وللحفاظ على ضغط الهواء الداخلي، قم أولاً بتجهيز بيضة العائل.اقطع غشاء Vitale باستخدام إبرة تنجستن مسنونة باللهب، ثم اسحب الغشاء فوق الجنين. بعد ذلك، أعد إغلاق البيضة باستخدام الشريط اللاصق كما تم القيام به مع البيضة المانحة. قم بإزالة الشريط اللاصق من النافذة الموجودة في البيضة المانحة لقطع الطية العصبية من الجنين المانح.اصنع شقوقاً على كلا جانبي الأنبوب العصبي باستخدام إبرة تنجستن مدببة باللهب. بعد ذلك، اقطع عرضياً عبر الأنبوب العصبي عند المستويات الأمامية والخلفية المطلوبة للطعم، ثم افصل الطعم بعناية عن بقية الأنبوب العصبي. انتبه إلى أي تفاصيل تشريحية محددة مثل الشكل الأمامي مقابل الخلفي للطعم، وذلك لضمان توجيه النسيج المانح بشكل صحيح.عند وضعها في المضيف، تأكد من أن إبرة التنجستن حادة للغاية. استخدم ضربات سريعة ومدروسة لإزالة النسيج بالكامل وفي قطعة واحدة. قم بإزالة الطية العصبية من جنين المتبرع باستخدام ماصة شمان. اسحب أقل كمية ممكنة من السائل حتى لا يطفو النسيج بعيداً أثناء النقل.الآن، قم بإزالة الشريط اللاصق عن نافذة بيضة المضيف، واستخدم ماصة شمان لوضع الطية العصبية المانحة بجانب جنين المضيف، ومجاوراً للمنطقة من الأنبوب العصبي التي ستستقبل الطُعم. الآن، افصل الطية العصبية عن الأنبوب العصبي لجنين المضيف كما فعلت مع المانح. احرص على إزالة طُعم بحجم مساوٍ لحجم النسيج المانح.ادفع نسيج المضيف هذا برفق بعيداً عن الجنين. ثم باستخدام إبرة تنجستن غير حادة أو الطرف المستدير لماصة دقيقة، حرك الطية العصبية المانحة برفق إلى داخل الأنبوب العصبي للمضيف، مع الحفاظ على التوجهات الصحيحة للمحور الأمامي الخلفي والظهري البطني. تأكد من تثبيت الطعم بإحكام على طول الجوانب، ولكن احرص على عدم وخز أو إتلاف الأنسجة الكامنة تحتها.يجب وضع المحلول الملحي المعقم بعناية وبلطف فوق جنين المضيف. وفي حال ظهور أي علامات للجفاف، قم الآن بإعادة إغلاق البيضة بعناية ووضع الملصق عليها، ثم أعدها بلطف إلى حاضنة ذات رطوبة عالية حيث يمكن للجنين الخيمري أن يتطور إلى المرحلة المطلوبة من أجل التحليل.لأغراض التحليل، يتم جمع الأجنة الخيمرية في محلول تثبيت "سارة" البارد المُحضّر حديثاً. ثم توضع الأجنة على جهاز هزاز (rocker) عند درجة حرارة 4 °C للتثبيت طوال الليل. سيتيح ذلك كشفاً أكثر حساسية لبيض السمان باستخدام الجسم المضاد لسمان (anti quail antibody).تتمثل خطوة مهمة أخرى في تحليلات التعبير الجيني بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي في تجميد الأجنة في النيتروجين السائل قبل استخلاص الـ RNA. تُظهر الحلزونات والبط في اختلافات ملحوظة من حيث الحجم والشكل، وبالتالي فإن أجنتهما مناسبة بشكل مثالي لإنشاء نظام خيمري لدراسة التطور القحفي الوجهي في C.تحديداً، يعد هذا النظام مفيداً لاستقصاء دور خلايا العرف العصبي. ففي عملية تشكيل الهيكل العظمي للوجه في الجنين الكيميري (الخلطي) من السمان والبط، تهاجر خلايا العرف العصبي المانحة من السمان إلى القوس الفكي للمستقبل من البط. وفي نمط يشبه نمط البط، تظهر خلايا السمان المانحة باللون الأخضر عند فحصها باستخدام جسم مضاد للسمان من المنظر البطني.في جنين خيمري في المرحلة 12، تولد العرف العصبي المانحة هيكلاً فكيًا سفليًا يشبه هيكل السمان من حيث الحجم والشكل. وبمجرد إتقان العملية، يمكن إجراء كل عملية زرع في غضون خمس دقائق تقريبًا. وإذا استغرقت العملية وقتًا أطول من ذلك، فإن ذلك يعرض الجنين لخطر الجفاف ويقلل من معدل البقاء على قيد الحياة.أثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم أن تنتبه لوضعية جسدك، وتعمل على إرخاء كتفيك، والحفاظ على وضعية جيدة لليدين. كما يجب عليك وضع روتين عمل وتنسيق أدواتك الجراحية وكواشفك في المكان ذاته في كل مرة، لكي تتمكن من إبقاء عينيك على المجهر وتحريك يديك بشكل تلقائي.

assessing-species-specific-contributions-to-craniofacial-development

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

توضح هذه المقالة تقنية زرع الانسجة التي تم تصميمها لاختبار الإشارات وخصائص الزخرفة من الأديم الظاهر سطح الرأس أثناء تطوير القحفي.

تقييم خصائص اشارة من الظهارة الأدمة خلال التنمية الجمجمة

يوصف هذا النهج لتحليل الهجرة والمصير النهائي من الطيور الخلايا العصبية في قمة السمان، فرخ أجنة خيالية. هذا الأسلوب هو أسلوب بسيط ومباشر لتعقب الخلايا العصبية خلال قمة للهجرة والتمايز التي يصعب على خلاف ذلك للتمييز في جنين الفرخ unmanipulated.

تحليل للهجرة كريست العصبية والتمايز بواسطة الصليب الأنواع زرع

أصبح التصور من البيانات التجريبية عنصرا أساسيا في تقديم النتائج للمجتمع العلمي. جيل من يعيش تسجيل الوقت الفاصل بين الأجنة المتزايد يساهم في تحسين العرض وفهم العمليات التنموية المعقدة. هذا البروتوكول هو دليل خطوة بخطوة لوضع العلامات الخليوي عبر photoconversion من البروتين Kaede الذي في الزرد.

التصور التنمية الجمجمة في sox10: Kaede الذي الزرد المعدلة وراثيا عن طريق الخط الوقت الفاصل بين متحد البؤر المجهري

تقنية لزرع "المتطرفة الأمامي المجال" بين أنسجة الوجه القيطم المورق وقد تم تطوير الأجنة. يمكن نقل الأنسجة من احد خلفية التعبير الجيني إلى أخرى، والسماح للدراسة المتطلبات المحلية للتنمية والقحفي للانزعاج التفاعلات بين مناطق الوجه.

زرع الوجه في<em&gt; القيطم المورق</em&gt; الأجنة

الوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر هي تقنية قوية مفيدة لوصف التطور الجنيني. هنا، نحن تصف منهجية وتميز التشكل القحفي في البرية من نوع، وكذلك pdgfra، smad5، وSMO الأجنة متحولة.

تحليل الجمجمة التشكل في الزرد عن طريق 4D متحد البؤر المجهري

وقد تم تطوير طريقة لقياس حجم فموي وجهي وشكل الضفدع الأجنة المورق. في هذا البروتوكول، ويتم الجمع بين قياسات حجم التقليدية مع morphometrics الهندسية للسماح لتحليلات أكثر تطورا التنمية الوجهية والعيوب.

الكمي من الظواهر في الوجهية القيطم

منذ فترة طويلة افترض تنظيم خلية من خلايا العظام القحفي ولكن لم تصور مباشرة. وضع العلامات خلية متعددة الأطياف والحية على الهواء مباشرة   التصوير يسمح التصور من سلوك الخلية الحيوي في الفك السفلي الزرد. هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول للتلاعب Zebrabow الأسماك المعدلة وراثيا ومراقبة مباشرة إقحام خلية والتغيرات المورفولوجية للغضروفية في غضروف ميكل.

التصور من خلية غضروفية بيوم إضافي والاتجاه انتشار عبر Zebrabow تحليل الخلية نسيلي في الغضروف والجنينية ميكل

توفر هذه المقالة طريقة لعزل نقية الأنسجة الجنينية من أجنة السمان والدجاج التي يمكن دمجها إلى النموذج السابقين فيفو تشيميريك الأجهزة.

عزل الأنسجة الجنينية وتشكيل أجهزة تشيميريك السمان-الدجاج باستخدام المثال الغدة الصعترية

توضح هذه المقالة تقنية زرع الأنسجة التي تم تصميمها لاختبار خصائص الإشارات والأنماط للدماغ الأمامي القاعدي أثناء النمو القحفي الوجهي.

إنشاء كيميرا الدماغ الأمامي للطيور لتقييم نمو الوجه

هنا ، نصف بعمق طريقة تعتمد على التصوير المقطعي المحوسب الدقيق ، لتقسيم وقياس النماذج ثلاثية الأبعاد لعظام الوجه والفكين في الفئران ، من أجل تقييم أفضل لنمو العظام القحفية والفكينية في الفئران أكثر مما هو ممكن بالطرق الحالية.

تحليل التشوهات القحفية الوجهية والفكينية في الفئران باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق ثلاثي الأبعاد

اكتشف كيفية إنشاء أجنة كيميرية بين السمان والبط لدراسة مساهمات الخلايا العصبية الظاهرية في تطور الجمجمة والوجه. تساعد هذه الطريقة الباحثين على فهم الأنماط النوعية للأنواع.

تقييم مساهمات أنواع محددة لتنمية الجمجمة عن طريق الوهم السمان بطة

استكشف المزيد من الفيديوهات