خطوة واحدة تنقية البروتينات التوأم بكتيريا الموسومة ومجمعات منها على بكتيريا-Tactin الراتنج عبر ربط مع مكرر (sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

مرحبًا، أنا كريستينا ماكينان من جامعة هلسنكي، فنلندا. يتمثل أحد التحديات في توصيف معقد بروتيني معين في تحديد تركيبته الجزيئية. وهذا يتطلب تطوير طرق لعزل وتنقية هذا المعقد من بيئته الخلوية.

يتمثل مجال البحث في الميكروبات في دراسة التفاعلات بين الفيروسات النباتية والعائل، ولذلك نحن مهتمون بمختلف معقدات البروتينات النووية الريبونوكليوزية الفيروسية التي تتشكل أثناء العدوى. وفي السابق، نجحنا في دراسة هذه المعقدات باستخدام التنقية القائمة على علامات الألفة في مختبرنا، وقد ثبت أن علامة Twin-strep هي واحدة من أفضل هذه العلامات.

ومع ذلك، فقد لاحظنا بعض القيود في استخدامه، ومن بينها انخفاض الحصيلة، ولذلك أردنا تحسين هذه الطريقة. مرحباً، اسمي ماتا وسأقوم بإرشادكم خلال البروتوكول التجريبي. ولكن أولاً، اسمحوا لي أن أعطيكم نظرة عامة على الطريقة.

نستخدم حبيبات strep tachin macro prep لتنقية معقدات محددة بين بروتينات مزدوجة الوسم بـ strept tagged وشركاء ارتباطها الفسيولوجيين. يظهر البروتين رباعي القسيمات مزدوج الوسم بـ strep strept tagged باللون الأخضر، وشريك ارتباطه باللون الأزرق، ونسختان من وسم strep tag باللون البرتقالي والأحمر.

يتمت إزالة البروتينات غير المرتبطة، والموضحة ككرات رمادية، عن طريق الغسيل وفقاً للمنهجية التقليدية. ثم يتم استرداد المعقدات المرتبطة تنافسياً باستخدام البيوتين الموضح باللون الوردي. ومع ذلك، فقد لاحظنا عند استخدام هذا النهج حدوث استرداد غير مكتمل للمعقدات المرتبطة، حيث انفصل جزء بسيط منها فقط بنجاح عن حبيبات strep tachin.

يؤدي هذا إلى انخفاض في استعادة البروتين المستهدف. ومما يزيد من تعقيد أي تحليل إضافي، أنه يمكن تحسين استعادة البروتين المستهدف باستخدام الشطف المسبب للمسخ بواسطة S-D-S-S-D-S. وتتشكل مسام حول بروتين الطعم Twin-Strep-tag الممسوخ.

شريكه في الارتباط وحول المونوميرات المنفصلة من strept actin. ويعد تلوث العينة الناتج عن تحرر strept actin أمراً غير مقبول إذا كانت العينة تتطلب مزيداً من التحليل بواسطة مطياف الكتلة. وللتغلب على مشكلة تلوث العينة، قمنا بتطوير طريقة يتم من خلالها تثبيت رباعي القسيمات (tetramer) لـ strep tachin أولاً عن طريق الربط التشابكي الكيميائي.

يُستخدم الراتنج المتشابك الناتج لتنقية بروتين الطعم وعينة الشريك الرابط، حيث يضمن الشطف باستخدام SDS استرداداً عالياً للبروتين، بينما يضمن التشابك الكيميائي للراتنج شطف بروتين الطعم المسمى بـ strept وشريكه الرابط في غياب تلوث العينة بـ strept المتحرر. قم بموازنة أنبوب دقيق سعة 1.5 مل مغلق يحتوي على 2 mg من رابط التشابك BS3 مع درجة حرارة الغرفة.

قم بتحضير رأس الماصة لنقل الراتنج عن طريق قطع طرف الرأس، ثم أعد تعليق راتنج strep tact و macro prep عن طريق الرج القوي لفترة وجيزة، وانقل على الفور 600 microliters من المعلق إلى عمود ترشيح CoStar spinx، ثم استخدم جهاز الطرد المركزي بسرعة 4,000 RPM لمدة 30 ثانية. في درجة حرارة الغرفة، أضف 450 microliters من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات. الغرض من هذه الخطوة هو استبدال primary am mean triss بالفوسفات غير التفاعلي.

تخلص من السائل المار. اخلط المحتويات عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات. كرر خطوات الطرد المركزي والغسل مرتين، واترك الراتنج في 430 µL من P-B-S-P-H eight.

بعد عملية الطرد المركزي الأخيرة، قم بثقب رقاقة أنبوب المايكرو باستخدام رأس ماصة يحتوي على 100 µL من ماء Milli-Q. قم بإذابة مسحوق BS three في الماء عن طريق السحب والدفع اللطيف بالماصة. وبمجرد ذوبان BS three تماماً، أضف فوراً 20 µL من المحلول إلى عمود spin X، مع التأكد من خلط المحتويات جيداً.

قم بتدوير العمود لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع التأكد من خلط الراتنج بشكل جيد مع محلول BS three. ولإيقاف التفاعل، أضف 6 µL من محلول Tris بتركيز 3 M المعدل إلى pH 7.5 باستخدام حمض الهيدروكلوريك. قم بتدوير العمود لمدة 15 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة، ثم استخدم جهاز الطرد المركزي بسرعة 4,000 RPM لمدة 30 ثانية.

في درجة حرارة الغرفة، قم بتعليق الراتنج المتشابك في 450 µL من محلول tris buffered saline مع tween 20 وتخلص من السائل المار. كرر خطوات الطرد المركزي والغسيل مرتين إضافيتين. في الخطوة الأخيرة، أعد تعليق الراتنج في 450 µL من TBS. انقل معلق الراتنج إلى أنبوب جديد، ثم أعد تعليق الراتنج المتبقي في العمود باستخدام 450 µL أخرى من TBS وانقله إلى الأنبوب نفسه.

كرر الخطوة الأخيرة مرة أخرى لضمان أقصى قدر من نقل الراتنج من العمود إلى الأنبوب. اترك الأنبوب الذي يحتوي على معلق الراتنج لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة واضبط الحجم إلى 600 microliters. بعد إزالة فائض TBS، يصبح الراتنج جاهزاً للاستخدام الفوري أو يمكن تخزينه عند درجة حرارة أربع درجات Celsius دون تجميد.

تعد هذه الطريقة مناسبة لتنقية أي بروتين اندماجي موسوم بـ twin strep ومعقداته المرتبطة به. ويمكن أن يكون البروتين من أصل حيواني أو نباتي أو بكتيري، كما يمكن عزله إما من محلل خلوي كلي أو من جزء عضوي مخصب. وفي هذا المثال، سنقوم بعزل بروتين VPG Pro الموسوم بـ twin strep والتابع لفيروس البطاطس A من الجزء النووي للنباتات المصابة بالفيروس؛ ابدأ بطرد مركزي لـ 1 milliliter من عينة البروتين الطعم في محلول الربط عند 13,000 RPM لمدة 10 minutes عند درجة حرارة 4 °C.

انقل السائل الطافي إلى أنبوب جديد لتقليل ارتباط البروتينات البيوتينية الداخلية بـ strep tact والراتنج. أضف avadon ليصل التركيز النهائي إلى 100 µg/mL، مع التأكد من خلط المحتويات جيداً. قم بالتدوير لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C.

أعد تعليق الراتنج المتشابك عن طريق الرج الدوامي، وباستخدام رأس ماصة كأسي، أضف فوراً 50 µL من معلق الراتنج إلى الأنبوب الذي يحتوي على عينة بروتين الطعم. قم بالتدوير لمدة 30 دقيقة أخرى عند 4 °C أثناء الانتظار. اضبط جهاز الخلط الحراري على 55 °C وقم بتسخين 500 µL من محلول Elu buffer مسبقاً لاستخدامه في خطوة الاستخلاص، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 2000 RPM لمدة دقيقة واحدة عند 4 °C.

تخلص من الطافي واغسل الراتنج بـ 1 mL من محلول غسيل مُبرد مسبقاً رقم 1، مع التدوير لمدة 5 دقائق عند 4 °C. كرر خطوات الطرد المركزي والغسيل ثلاث مرات في الخطوة الأخيرة.

أعد تعليق الراتنج في 250 µL من محلول الغسيل المنظم رقم 2 وانقل معلق الراتنج إلى عمود spinx جديد. أعد تعليق الراتنج المتبقي في الأنبوب في 250 µL أخرى من محلول الغسيل المنظم رقم 2 وانقلها إلى العمود نفسه، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 2000 RPM لمدة ثلاث دقائق عند درجة حرارة 4 °C. انقل العمود إلى أنبوب dolphin nose سعة 2 mL جديد وتخلص من السائل المار.

انتقل مباشرةً إلى خطوة الاستخلاص التالية. أضف 150 µL من محلول الاستخلاص المسخن مسبقاً إلى عمود spinx. حضّن المحلول في جهاز المزج الحراري (thermo mixer) لمدة خمس دقائق عند 55 °C، مع الرج بسرعة 1400 RPM، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 4,000 RPM لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة، وتخلص من العمود.

أصبحت البروتينات المستهدفة المنقاة الآن جاهزة لمزيد من التحليل ويمكن تخزينها في درجة حرارة أقل من -20 °C. وتوضح الصورة أن شطف البروتين من راتنج strept actin macro prep باستخدام البيوتين غير مكتمل مقارنة بالشطف باستخدام SDS. وتعكس الاختلافات في شدة إشارات لطخة ويسترن (western blot) تباين إنتاجية البروتين التي تم الحصول عليها باستخدام تقنيتي الشطف. وعلى الرغم من أن الشطف باستخدام SDS أكثر كفاءة بكثير من الشطف باستخدام البيوتين، إلا أنه يؤدي إلى تلوث العينة بالـ strept actin المتحرر.

تظهر الصورة هلام تلوين الفضة لعينات SDS EITs المستخلصة من راتنج Strept actin Macro prep؛ ويلاحظ وجود البروتين Strept actin المتحرر في المسار الأيسر وغيابه في المسار الأيمن. تم استخلاص العينة الموجودة على اليسار من الراتنج غير المترابط تشابكياً، بينما استخلصت العينة الموجودة على اليمين من الراتنج المترابط تشابكياً باستخدام BS three. وبناءً على هذه النتائج، نستنتج أن الترابط التشابكي بواسطة BS three يمنع تحرر Strept actin من الراتنج أثناء عملية الشطف بـ SDS.

في هذا المثال، استخدمنا راتنج Strept actin macro prep المترابط بـ BS three لتنقية البروتين الطُعم VPG PRO والبروتينات المرتبطة به. خضعت عينة من العينة المنقاة لتحليل mass spec لتحديد هوية البروتين. ويؤكد غياب حزمة محددة في العينة الضابطة السالبة خصوصية عملية pull down.

تتوافق الحزمة السفلية مع بروتين الطُعم VPG PRO والحزمة العلوية مع شريك الارتباط NIB replicate الذي تم تحديده بواسطة مطياف الكتلة. مرحباً، لقد عرضنا لكم للتو كيف يمكن استخدام الربط التشابكي الكيميائي للتغلب على القيود المرتبطة بـ Dena والتحلل من راتنج strep tact. وبالإضافة إلى تنقية معقدات البروتين-بروتين، يمكن استخدام هذه الطريقة أيضاً لتنقية المعقدات البروتينية مع الأحماض النووية، بما في ذلك تلك التي تم ربطها تشابكياً بشكل عكسي باستخدام الفورمالديهايد.

وأخيرًا، يمكن استخدام هذه الطريقة لتنقية بروتينات الغشاء بتقنية strep tech. تُذاب هذه البروتينات باستخدام المنظفات، حيث تبرز الحاجة إلى المنظفات لإبقاء هذه البروتينات الكارهة للماء في المحلول.

ومع ذلك، قد يؤدي وجودها إلى تلوث العينة بإطلاق strep tane. وحتى عند استخدام تطور biotin خفيف، نعتقد أن الربط المتقاطع للراتنج قد يوفر حلاً لمشكلة تلوث العينة. شكراً لكم على المشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم. حسناً.