قياس النفاذية في واحدة Microvessel المعزولة الجرذ إعداد الرئة perfused الدم

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس النفاذية في الأوعية الدقيقة المنفردة للرئات المعزولة من الجرذان باستخدام طريقة تعتمد على الفلورة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل رئتي الجرذ وترويتهما بالدم الذاتي. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في إدخال قسطرة دقيقة في الأذين الأيسر إلى منطقة صغيرة من الرئة لحقن ديكسترين مُوسوم بالفلورة.

بعد ذلك، وأثناء تسريب الدكسترين المسمى، يتم جمع صور للأوعية الدموية الدقيقة في الرئة. وتتمثل الخطوة النهائية في قياس نفاذية الأوعية الدموية الدقيقة الفردية من الصور باستخدام برنامج حاسوبي. وفي النهاية، يمكن للنتائج أن توضح درجة نفاذية الأوعية الدموية الدقيقة في الرئة تحت ظروف مختلفة، كما هو الحال بعد المعالجة بـ LPS.

ستقوم الدكتورة Kava Kasami، زميلة ما بعد الدكتوراه من مختبري، باستعراض هذا الإجراء. ابدأ بإجراء عملية بضع الرغامى لجرذ ذكر في مستوى تخدير جراحي مؤكد. استخدم كانيولا رغامية من نوع PE 90 وثبتها بالخيوط الجراحية. بعد ذلك، قم بتسريب القلب بـ 100 إلى 200 وحدة من heparin باستخدام إبرة فراشة مقاس 21 gauge.

انتظر لمدة دقيقة واحدة ثم قم بعملية إفراغ الدم. اجمع الدم واحفظه جانباً مع المحلول الملحي. املأ كانيولتين مصنوعتين من أنابيب tigon بقطر ثلاثة ملليمتر وطول أربعة سنتيمترات وتكونان متسعتين من أحد الطرفين.

قم الآن بإجراء عملية بضع الصدر. اصنع شقًا بحجم يكفي فقط لإدخال القنية في البطين الأيمن، ثم مرر الطرف المتسع لإحدى القنيات باتجاه الشريان الرئوي. قم بتثبيت القنية باستخدام الغرز الجراحية.

استخدم التقنية ذاتها لإدخال القنية الأخرى في قمة البطين الأيسر باتجاه الأذين الأيسر. ثبتها باستخدام شريط سري بعرض 2 mm. الآن قم بإزالة الأنسجة الضامة المعيقة، ثم استخرج الرئة والقلب مع القنيات.

انقلها إلى طبق بتري بحيث يكون السطح الحجابي للرئة متجهًا للأعلى مع محاذاة القنيات الثلاث جميعها. انقل التحضير الذي تم تشريحه إلى منصة قابلة للتعديل مجهزة بأنابيب tigon رقم 18 متصلة بمحولات ضغط تعمل كأنابيب دخول وخروج. الآن امزج عينة الدم بحجم مساوٍ من محلول albumin بتركيز 5%.

أضف هذا الخليط إلى خزان التحميل. ابدأ بتشغيل المضخة بمعدل 14 milliliters per minute. تأكد من خلو الأنابيب من أي فقاعات هوائية.

عند التحضير، قم بتوصيل الشريان الرئوي بأنبوب مدخل الرئة، وتوصيل كانيولا الأذين الأيسر بأنبوب المخرج. تأكد مرة أخرى من عدم وجود هواء في الأنابيب، وتحقق أيضاً من أن التحويلة مفتوحة.

قم بتوصيل القنية الرغامية بمحول ضغط ثالث. قم بنفخ الرئتين عبر القنية الرغامية باستخدام أكسجين بنسبة 30%. حافظ على الرئتين عند ضغط خمسة سنتيمترات من الماء.

الآن، قم بتثبيت المشبك على التحويلة وشغّل المضخة بمعدل 14 milliliters per minute. لبدء تروية الرئة، اضبط المضخة أثناء عملية التروية للحفاظ على الضغط الرئوي عند حوالي 10 centimeters of water والحفاظ على ضغط الأذين الأيسر عند three centimeters of water. ابدأ بتحضير الرئة التي سيتم حقن الدم فيها.

أولاً، قم بتصنيع قسطرة تسريب من أنبوب PE 10 بطول 40 سنتيمتر يتم إدخاله في أنبوب PE 90 بطول 30 سنتيمتر. قم بتوصيل الطرف الآخر من أنبوب PE 10 بإبرة قياس 30 gauge متصلة بمحقنة سعة 1 cc. أحضر طرف الأنبوب المتصل بالرئة فوق العينة وقم بتوصيل قسطرة التسريب به.

قم بتوجيه قسطرة التسريب إلى الأذين الأيسر ثم إلى الرئة حتىما تواجه مقاومة. سيؤدي استخدام قوة مفرطة إلى إصابة الرئة. يعد الإدخال السليم للقسطرة الدقيقة أمراً بالغ الأهمية، حيث أن أي ضرر يلحق بالرئة بسبب القسطرة الدقيقة سيقلل من نجاح البروتوكول.

بعد ذلك، املأ المحقنة بمحلول ringers وقم بتوصيله بمضخة. ابدأ بتسريب المحلول ببطء بمعدل 10 microliters في الدقيقة. وتدريجياً، سيصبح موقع التسريب شاحباً مقارنة ببقية الرئة، وللحفاظ على رطوبة سطح الرئة، يتم غلفها بالبلاستيك باستثناء موقع التسريب.

لتصوير الرئة الآن، قم بإنشاء نافذة معاينة عن طريق تثبيت حلقة دائرية (O-ring) على شريحة غطاء مقاس 22 مليمتر. وباستخدام شحم الصنبور، قم بتثبيت الحلقة الدائرية في حامل أنابيب اختبار. ثم ضع النافذة فوق موقع التسريب.

أكمل عملية الإعداد عن طريق تدوير العدسة الشيئية 20x فوق شريحة التغطية والتركيز على الرئة. من غير المتوقع حدوث أي تشوه بصري. الآن، قم بتسريب الرئة بالمحلول المختار.

في هذا المثال، وبعد حقن المحلول الملحي، يتم ضخ ملليلتر واحد من الـ dextrin المقترن بـ ZI في الرئة عبر مضخة الحقن على مدار 60 دقيقة. باستخدام برنامج التصوير، يتم تسجيل صورة واحدة كل دقيقة طوال مدة الضخ التي تستغرق ساعة واحدة، والاستمرار في التسجيل خلال خطوة الغسل اللاحقة لمدة 10 دقائق إضافية. بعد الانتهاء من ضخ الـ dextrin، يتم غسله عن طريق ضخ محلول رينجر في الرئة لمدة 10 دقائق أخرى على الأقل وبمعدل التدفق نفسه. لاحقاً، عند تحليل الصور التي تم الحصول عليها، يتم قياس أقصى شدة فلورية في المنطقة المستهدفة خلال عملية ضخ الـ dextrin.

بعد ذلك، قم بقياس أقصى شدة فلورية للفلورة المتبقية بعد عملية الغسل التي استمرت 10 minutes. تم استقصاء التغيرات في النفاذية الوعائية باستخدام تسريب FITC-dextrin عقب المعالجة بـ lipopolysaccharide البكتيري، حيث يُعد هذا نموذجاً واسع الاستخدام لـ LI. كانت الفلورة المتبقية من FITC منخفضة في الأوعية الدقيقة المعالجة بمحلول ringers، ولكنها كانت مرتفعة في تلك المعالجة بـ LPS. علاوة على ذلك، وبالمقارنة مع تسريب ringer's، أدى تسريب LPS إلى انخفاض ملحوظ في مؤشر النفاذية، مما يشير إلى زيادة شاملة في النفاذية في جميع الأوعية ضمن مجال الصورة.

علاوة على ذلك، ومقارنةً بتسريب محلول رينجر، تسبب تسريب LPS في انخفاض ملحوظ في مؤشر النفاذية، مما يشير إلى زيادة عامة في النفاذية في جميع الأوعية الدموية ضمن مجال الصورة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يتكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير رئتي طائر معزولتين، وإدخال قسطرة مجهرية في الذيل الأيسر، وتحديد النفاذية مجهرياً.