قياس النفاذية في واحدة Microvessel المعزولة الجرذ إعداد الرئة perfused الدم
يونيو 30, 2014
ومعزولة إعداد الرئة perfused الدم يجعل من الممكن تصور شبكات microvessel على سطح الرئة. نحن هنا وصف نهج لقياس نفاذية microvessels واحد في الرئتين معزولة في الوقت الحقيقي باستخدام التصوير مضان.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد النفاذية في الأوعية الدقيقة المفردة لرئتي الفئران المعزولة باستخدام طريقة قائمة على التألق. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل رئتي الفئران أولا وتزيينها بالدم الذاتي. تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في إدخال قسطرة دقيقة أذينية يسرى في منطقة صغيرة من الرئة لضخ النباتات ذات العلامات الأربعة الدكسترين.
ثم أثناء غرس الدكسترين الموسوم ، يتم جمع صور الأوعية الدقيقة للرئة. تتمثل الخطوة الأخيرة في تحديد نفاذية الأوعية الدقيقة المفردة من الصور باستخدام البرنامج. في النهاية ، يمكن أن تظهر النتائج درجة نفاذية الأوعية الدقيقة للرئة في ظل ظروف مختلفة ، مثل بعد علاج LPS.
سيوضح هذا الإجراء الدكتور كافا كاسامي ، زميل ما بعد الدكتوراه من مختبري بيغن عن طريق إجراء بضع القصبة الهوائية على فأر ذكر في طائرة جراحية مؤكدة للتخدير. استخدم قنية القصبة الهوائية PE 90 وثبتها بالغرز. بعد ذلك ، قم بنقع القلب ب 100 إلى 200 وحدة من الهيبارين باستخدام إبرة فراشة قياس 21.
انتظر دقيقة واحدة ثم استخرج الدم. اجمع الدم واتركه جانبا بالمحلول الملحي. املأ قنيتين مصنوعتين من أنابيب تيجون بطول ثلاثة ملليمترات بطول أربعة سنتيمترات ومتوهجة من طرف واحد.
الآن قم بإجراء بضع الصدر. قم بعمل شق كبير بما يكفي للقنية في البطين الأيمن وانزلق في العرين المتوهج لقنية واحدة باتجاه الشريان الرئوي. قم بتأمين القنية بالخيوط.
استخدم نفس الأسلوب لإدخال القنية الأخرى في قمة البطين الأيسر باتجاه الأذين الأيسر. قم بتثبيته بشريط سري بعرض ملليمترين. الآن قم بإزالة الأنسجة الضامة المعوقة وإزالة الأنسجة الطويلة والقلب مع القنيات.
انقلها إلى طبق بتري مع السطح الحجابي للرئة لأعلى ومحاذاة جميع القنيات الثلاثة. انقل المستحضر المفصل إلى مرحلة قابلة للتعديل مزودة بأنبوب tigon رقم 18 متصل بمحولات الضغط التي تعمل كأنابيب مدخل ومخرج. الآن امزج جمع الدم بحجم متساو من محلول الألبومين 5٪.
أضف هذا الخليط إلى خزان التحميل. ابدأ المضخة بمعدل 14 مل في الدقيقة. تأكد من أن الأنبوب لا يحتوي على فقاعات هواء.
في التحضير. اربط الشريان الرئوي بأنبوب مدخل الرئة والقنية الأذينية اليسرى بأنبوب المخرج. تحقق جيدا من عدم وجود هواء في الأنبوب ، وتحقق أيضا من أن التحويلة مفتوحة.
قم بتوصيل قنية القصبة الهوائية بمحول ضغط ثالث. نفخ الرئتين عبر قنية القصبة الهوائية بنسبة 30٪ من الأكسجين. حافظ على الرئتين عند خمسة سنتيمترات من ضغط الماء.
الآن قم بتثبيت التحويلة وابدأ تشغيل المضخة بمعدل 14 مل في الدقيقة. لبدء تروية الرئة أثناء التروية ، اضبط المضخة للحفاظ على الضغط الرئوي عند حوالي 10 سنتيمترات من الماء والحفاظ على الضغط الأذيني الأيسر عند ثلاثة سنتيمترات من الماء. ابدأ بتحضير الرئة المنقعة بالدم.
أولا ، قم ببناء قسطرة تسريب من طول 40 سم من أنابيب PE 10 يتم إدخالها في طول 30 سم من أنابيب PE 90. قم بتوصيل الطرف الآخر من أنبوب PE 10 بإبرة قياس 30 متصلة بحقنة سم مكعب واحدة. أحضر نهاية الأنبوب المتصل بالرئة فوق المستحضر وقم بتوصيل قسطرة التسريب به.
قم بتوجيه قسطرة التسريب إلى الأذين الأيسر ثم إلى الرئة حتى تواجه المقاومة. القوة المفرطة ستؤذي الرئة. يعد الشق الصحيح للقسطرة الدقيقة أمرا بالغ الأهمية لأن أي ضرر يلحق بالرئة بواسطة القسطرة الدقيقة سيقلل من نجاح البروتوكول.
بعد ذلك ، املأ المحقنة بالرنين وقم بتوصيلها بمضخة. نقع المحلول ببطء بمعدل 10 ميكرولتر في الدقيقة. تدريجيا ، سيصبح موقع التسريب شاحبا مقارنة ببقية الرئة للحفاظ على سطح الرئة رطبا سريعا في البلاستيك باستثناء موقع التسريب.
الآن لتصور الرئة ، قم بإنشاء نافذة عرض عن طريق إرفاق حلقة O بزلة غطاء 22 ملم. باستخدام شحم محبس التثبيت ، قم بتثبيت الحلقة O بحامل أنبوب الاختبار. ثم ضع النافذة فوق موقع التسريب.
أكمل الإعداد عن طريق تأرجح هدف 20 × فوق زلة الغطاء والتركيز على الرئة. لا يتوقع حدوث تشويه بصري. الآن غرس الرئة بحل من اختيارك.
في هذا المثال ، بعد المحلول الملحي ، يتم حقن مليلتر واحد من الدكسترين المترافق ZI في الرئة عبر مضخة الحقنة على مدار 60 دقيقة. باستخدام برنامج التصوير ، قم بتسجيل صورة واحدة في الدقيقة على مدار ساعة واحدة ومواصلة التسجيل أثناء خطوة الغسيل اللاحقة لمدة 10 دقائق أخرى بعد حقن دكسترين فيتز ، اغسله عن طريق حقن محلول رنين الرئة لمدة 10 دقائق أخرى على الأقل بنفس معدل التدفق. فيما بعد. عند تحليل الصور المكتسبة ، سجل أقصى كثافة مضان في المنطقة ذات الاهتمام أثناء التسريب مناسب.
ثم سجل الحد الأقصى لشدة التألق المتبقي بعد الغسيل لمدة 10 دقائق. تم التحقيق في التغيرات في نفاذية الأوعية الدموية باستخدام تسريب دكسترين فيتزي بعد العلاج بعديد السكاريد الدهني البكتيري لأن هذا نموذج مستخدم على نطاق واسع ل LI.كان مضان الملاءمة المتبقية منخفضا في الأوعية الدقيقة المعالجة بالرنين ، ولكنه مرتفع في تلك التي عولجت ب LPS. علاوة على ذلك ، بالمقارنة مع ضخ الجرس ، تسبب تسريب LPS في انخفاض كبير في مؤشر النفاذية مما يشير إلى زيادة عالمية في النفاذية في جميع الأوعية داخل مجال الصورة.
علاوة على ذلك ، بالمقارنة مع ضخ الجرس ، تسبب تسريب LPS في انخفاض كبير في مؤشر النفاذية مما يشير إلى زيادة عالمية في النفاذية في جميع الأوعية داخل مجال الصورة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديه فهم جيد لكيفية تحضير رئتي الوقاية من الطيور المعزولة ، وإدخال قسطرة صغيرة للذيل الأيسر وتحديد النفاذية في الميكرو.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه المقالة طريقة لقياس نفاذية الأوعية الدقيقة المفردة في رئتي الفئران المعزولة باستخدام تصوير الفلوريسنس في الوقت الفعلي. تسمح تحضيرات الرئة المعزولة المملوءة بالدم بتصوير شبكات الأوعية الدقيقة على سطح الرئة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الأوعية الدموية
- تصوير الفلوريسنس
الخلفية
- فهم نفاذية الأوعية الدقيقة أمر بالغ الأهمية لدراسة وظائف الرئة.
- توفر تحضيرات الرئة المعزولة بيئة خاضعة للتحكم في التجارب.
- يسمح تصوير الفلوريسنس بالمراقبة في الوقت الفعلي لديناميات الأوعية الدقيقة.
- أظهرت الدراسات السابقة تأثير العلاجات المختلفة على نفاذية الأوعية الدموية.
هدف الدراسة
- لقياس نفاذية الأوعية الدقيقة المفردة في رئتي الفئران المعزولة.
- استخدام طريقة قائمة على الفلوريسنس لقياس دقيق.
- لتقييم تأثيرات ظروف مثل العلاج بـ LPS على نفاذية الأوعية الدقيقة.
الطرق المستخدمة
- عزلة رئتي الفئران وتصريفها بالدم الذاتي.
- إدخال قسطرة دقيقة في الأذين الأيسر إلى الرئة.
- تسريب ديكسترين مرتبط بالفلوريسسين إلى الأوعية الدقيقة.
- جمع الصور أثناء عملية التسريب للتحليل.
النتائج الرئيسية
- تم تحقيق قياس نفاذية الأوعية الدقيقة المفردة.
- أظهرت النتائج درجات متفاوتة من النفاذية في ظل ظروف تجريبية مختلفة.
- قدم تصوير الفلوريسنس تصورًا واضحًا لشبكات الأوعية الدقيقة.
- تدعم البيانات مزيدًا من التحقيق في تأثيرات العلاجات على الأوعية الدقيقة في الرئة.
الخلاصات
- تقوم الطريقة بفعالية بقياس نفاذية الأوعية الدقيقة في الرئتين المعزولات.
- التصوير في الوقت الفعلي هو أداة قيمة لأبحاث الأوعية الدموية.
- تساهم النتائج في فهم استجابات الأوعية الدموية في الرئة لمختلف المحفزات.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This method enables direct quantification of permeability changes in individual pulmonary microvessels under inflammatory conditions, providing mechanistic insight into vascular leak pathways. By combining isolated lung perfusion with real-time fluorescence imaging, it supports target validation in pulmonary inflammation models and facilitates preclinical assessment of barrier-protective candidates. The approach reduces reliance on endpoint tissue processing, accelerating data acquisition for go/no-go decisions in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures real-time fluid leak across venular and capillary segments to interrogate therapeutic hypotheses in vascular inflammation.
- Operational Value: Enables side-by-side comparison of permeability responses across vascular beds within the same lung preparation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence intensity readouts to assess compound effects on microvessel permeability.
- Operational Value: Standardizes perfusion and imaging conditions for reproducible, high-content vascular screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links LPS-induced permeability changes to disease-relevant mechanisms of acute lung injury.
- Operational Value: Supports dose-response modeling and pharmacokinetic-pharmacodynamic correlation in preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical efficacy testing, particularly for pulmonary vascular modulators.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by quantifying vascular barrier function in response to inflammatory stimuli.
- Screening: Delivers assay-ready, quantifiable outputs for evaluating compound effects on single-vessel permeability.
- Analytics: Provides permeability index calculations from time-lapse imaging to enable comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects microvascular responses to preclinical models of lung injury via LPS challenge.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing vascular permeability across multiple compound classes and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in vascular leak pathways through direct, single-vessel resolution.
- Operational Value: Standardizes microcatheter infusion and imaging protocols for cross-laboratory reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative vascular safety signals.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on pulmonary vascular effects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent surgery, vascular cannulation, and fluorescence microscopy.
- Depends on pressure-regulated perfusion systems and intravital imaging infrastructure.
- Necessitates standardization of infusion rates, fluorophore concentrations, and washout protocols across teams.
- Adaptation to other species or disease models may require validation of perfusion parameters and vascular accessibility.
- Practical limitations include technical complexity of microcatheter placement and potential lung trauma from cannulation.
