عزل حيدات الإنسان من مزدوجة التدرج الطرد المركزي والتمايز لالضامة في تفلون المغلفة حقائب خلية ثقافة

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد البلاعم البشرية بكميات وجودة عالية باستخدام معدات المختبر القياسية. يتم تحقيق ذلك عن طريق الطرد المركزي الأول للدم من معاطف بافي على تدرج مكالمة FI لجمع P BMCs cs. بعد ذلك في كل تدرج للمكالمة ، يتم فصل الخلايا الوحيدة عن الخلايا الليمفاوية.

ثم يتم زرع الخلايا الوحيدة في أكياس زراعة الخلايا المطلية بالتفلون وتمايزها. بعد ستة أو سبعة أيام ، يتم حصاد البلاعم وبذرها للدراسات اللاحقة. يجب أن تعبر الخلايا التي تم الحصول عليها عن العلامات النموذجية للبلاعم الناضجة وتستجيب للمنبهات المختلفة مثل الزراعة المشتركة مع الخلايا السرطانية أو التحفيز باستخدام LPS ، والميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التدفق المعاكس أو الطرد المركزي أو فرز الخلايا المنشطة المغناطيسية ، هي أنه يمكن إنشاء البلاعم البشرية باستخدام معدات الشفاه القياسية دون الحاجة إلى كواشف أو أدوات باهظة الثمن.

في حين أن هذه الطريقة سهلة التنفيذ ، إلا أن الأفراد الجدد في هذه الطريقة قد يكافحون من أجل تصور وفصل مجموعات الخلايا المختلفة في تدرجات الكثافة. لذلك ، سيساعد العرض المرئي لهذه الخطوات في التغلب على هذه الصعوبات. يتم تنفيذ هذا البروتوكول بشكل مكرر لتسهيل موازنة الدوارات.

ابدأ بتطهير كيسين من جزء المعطف المصقول من الدم متعدد الطبقات. ثم انقل معاطف بافي إلى أنبوبين سعة 50 مليلتر لكل طبقة بافي. قم بإعداد ثلاثة أنابيب سعة 50 ملليلتر مع 15 مل من محلول استدعاء FI بدرجة حرارة الغرفة عند 1.077 جرام لكل ملليلتر.

الآن ببطء وحذر ، ضع طبقة من 30 إلى 35 مل من الطبقة المنتفخة على كل أنبوب من مكالمة FI. يجب ألا تخلط الطبقات أجهزة الطرد المركزي هذه الأنابيب دون كسر عند 400 جم لمدة نصف ساعة. في درجة حرارة الغرفة بين المرحلتين ، تتشكل حلقة بيضاء من خلايا الدم المحيطية أحادية النواة.

قم بإزالة هذه الطبقات بماصة بلاستيكية. اجمع طبقات الأنابيب الثلاثة من كل متبرع في أنبوبين سعة 50 مليلتر لكل متبرع. اغسل الخلايا المجمعة عن طريق إضافة مليمولار واحد P-B-S-E-D-T-A حتى خط 40 مليلتر ، ثم قم بطردها عند 300 جم لمدة 10 دقائق دون أن تنكسر في درجة حرارة الغرفة.

الآن استنشق وتخلص من المواد الطافية. ثم كرر الغسيل وقم بإعادة تعليق الكريات وتجميع الكريات من كل متبرع و 20 مل من RPMI بالإضافة إلى FCS بدون فينول ريد. يجب أن يكون هناك الآن أنبوب واحد من الخلايا لكل متبرع.

الآن قم بإعداد مزيج تدرج الكثافة الثاني 23.13 مل من درجة حرارة الغرفة لكل محلول مكالمة مع 1.87 مل من 10 XPBS في أنبوب 50 مل. قم بإعداد أنبوب واحد من المزيج لكل عينتين. بعد ذلك ، انقل 23 مل من المزيج إلى أنبوب جديد سعة 50 مل.

ثم أضف 27 مل من RPMI بالإضافة إلى FCS مع الفينول الأحمر. والنتيجة هي حل تناضحي ISO بنسبة 46٪ لكل مكالمة. الآن لكل نقل متبرع ، 25 مل من محلول 46٪ إلى أنبوب 50 مليلتر وطبقة بعناية على خليط الخلية.

يجب تمييز المرحلتين بألوانها دون انقطاع. الطرد المركزي للخلايا لمدة نصف ساعة في درجة حرارة الغرفة وعند 550 G.A سوف تتجمع حلقة بيضاء من الخلايا الوحيدة بين الوجهين. اجمع هذه الخلايا في أنبوب سعة 50 مليلتر بماصة بلاستيكية.

اغسل الخلايا الوحيدة بمللي مولار واحد P-B-S-E-D-T-A ، مملوءة بعلامة 50 ملليلتر. ثم قم بطردها عند 400 جم دون كسر لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا الوحيدة المحببة في 20 مل من المتوسط. ثم تابع القسم التالي.

يستخدم هذا البروتوكول أكياس الثقافة المطلية بالتفلون FEP كغرفة استزراع. ابدأ بتقدير عدد الخلايا الوحيدة التي تم جمعها. الخلايا الوحيدة كبيرة وغالبا ما تكون غير منتظمة الشكل.

لا تحسب الخلايا الليمفاوية الأصغر. إذا توفرت 100 إلى 150 مليون خلية من متبرع واحد ، قم بإعداد 180 مل من RPMI المكملة. إذا كان هناك عدد أقل من الخلايا ، فقم بإعداد 30 مليلتر من الوسط لكل 30 إلى 50 مليون خلية.

في 20 مليلتر ، امزج الخلايا بعناية في 180 مل من الوسط المحضر. ثم قم بتحميل كيس الثقافة بالخلايا بحقنة بيرفو سعة 50 مليلتر متصلة بالقابس الموجود على كيس الثقافة. قم بإزالة المحقنة ، وادفع الهواء المتبقي للخارج وقم بتغطية القابس بمخروط.

الآن احتضان الأكياس لمدة ستة إلى سبعة أيام مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ستة إلى سبعة أيام من الحضانة ، انقل أكياس المزرعة إلى الجليد لحصاد الخلايا ، واغمر الأكياس تماما في الثلج واتركها تبرد لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات لفصل الخلايا. بعد ذلك ، اسحب الأكياس برفق على الحافة حوالي 10 مرات.

ثم تطهير الأكياس من الخارج تماما. استبدل مخروط القابس بحقنة سعة 50 مل. ثم اسحب تعليق الخلية وانقله إلى أنبوب سعة 50 ملليلتر.

عندما يتم جمع جميع الأنابيب ، قم بتدويرها عند 400 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، قم الآن بشفط المادة الطافية وتجميع جميع الخلايا في 10 ملليلتر من RPMI بالإضافة إلى FCS. ثم عد الخلايا كما كان من قبل. عد البلاعم فقط حيث قد تكون الخلايا الليمفاوية المتبقية موجودة.

ثم استخدم الخلايا للتطبيق ذي الأهمية لإعادة استخدام أكياس الثقافة. اغسلها مرتين بنسبة 70٪ إيثانول. ثم املأها ب 50 مل من الإيثانول بنسبة 70٪ واحتضنها طوال الليل في درجة حرارة الغرفة في اليوم التالي ، واشطف الأكياس ثلاث مرات باستخدام PBS المعقم.

ثم لفها بورق تعقيم وقم بالتعقيم. يمكن بسهولة إعادة استخدام الكيس 10 أضعاف تدرج الكثافة. تنتج أجهزة الطرد المركزي واجهة بيضاء تحتوي على الخلايا الليمفاوية والخلايا الوحيدة.

هنا نفحص تدرج الكثافة الأول. ماي جرونوالد. يظهر تلطيخ هذه الخلايا نسبة عالية من السيتوبلازم للنواة ، نموذجية للخلايا الليمفاوية والنوى على شكل حبة الفاصوليا أو الحلقة ، وهي نموذجية للخلايا الوحيدة.

تظهر هذه البقع نتائج التدرج الثاني. تنتج كل طبقة مصفرة حوالي 150 مليون خلية وحيدة ، والتي يمكن تمييزها إلى حوالي 70 مليون ضامة. في 20 استعدادا ، أصبحت 47٪ من الخلايا الوحيدة ضامة.

يمكن إثراء البلاعم المنقاة بشكل أكبر عن طريق الالتصاق بالأسطح البلاستيكية ، وهي ميزة لا تشترك فيها الخلايا الملوثة. بمجرد طلاءها ، تظهر معظم البلاعم مورفولوجيا للبيض المقلي بينما يكون للآخرون مغزل ممتد مثل النمط الظاهري. تتميز الخلايا بالتعبير عن عدة علامات.

نموذجي للبلاعم الناضجة. يجادل التعبير عن CD 11 B ضد التمايز التغصني ، كما هو الحال مع عدم وجود تعبير CD 2 0 9. بعد التمايز ، تظل الخلايا نشطة وظيفيا وأيضيا لمدة خمسة إلى سبعة أيام.

يظهر تلطيخ الكالسيوم للخلايا القابلة للحياة قدرتها على امتصاص الحويصلات خارج الخلية ذات العلامات الحمراء المتساقطة من الخلايا السرطانية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تنشيط البلاعم ، على سبيل المثال ، يؤدي التحفيز بعديدات السكاريد الدهنية إلى التعبير عن العديد من الجينات المؤيدة للالتهابات. باتباع هذا الإجراء ، يمكن أن تخضع البلاعم المعزولة لمجموعة كبيرة من المقايسات الوظيفية من أجل الإجابة على الأسئلة الأساسية حول بيولوجيا البلاعم في الصحة والمرض.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد أعداد كبيرة من البلاعم البشرية. ومع ذلك، من المهم أن تتذكر أنك تعمل مع عينات دم بشرية، والتي قد تكون معدية.