الصدمة الحادة الدماغ في الفئران تليها الطولية التصوير ثنائي الفوتون

الصدمة الدماغ الحاد هو إصابة الشديدة التي لا يوجد لديه العلاج المناسب حتى الآن. Multiphoton المجهري يسمح دراسة طوليا عملية التنمية الصدمة الدماغ الحادة وسبر الاستراتيجيات العلاجية في القوارض. وأظهرت نموذجين من الصدمة الدماغ الحادة درس في الجسم الحي مع اثنين من الفوتون التصوير من الدماغ في هذا البروتوكول.

مرحبا ، أنا ميشيل الرابع ، باحث ما بعد الدكتوراه في مركز علم الأعصاب بجامعة هلسنكي. مرحبا، أنا هيل شتاين، طالب دراسات عليا في جامعة هلسنكي. في هذا الفيديو، سنصف طريقة لتطبيق الصدمة الحادة الموضعية على دماغ الفأر للتصوير الفوتوغرافي اللاحق لسلوك خلايا الدماغ وحالات ما بعد الصدمة.

دع C ، إصابات الدماغ الحادة هي أمراض شديدة تؤثر على نسبة كبيرة من السكان في البلدان المتقدمة. يسمح الفحص المجهري متعدد الفوتون بدراسة الخلايا في سياق الأنسجة في دماغ القوارض الحية في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية. نصف هنا طريقة لإصابات الدماغ الحادة المطبقة على شكل وخز تجسيمي بإبرة حقنة ، متبوعا بتصوير فوتونين لسلوك خلايا الدماغ وحالات ما بعد الصدمة.

طريقة الإلحاق التجسيمي لإصابات الدماغ الموضعية هي أداة لدراسة العواقب الفيزيولوجية المرضية للصدمات الحادة. في دماغ الثدييات ، يمكن استهداف منطقة معينة من الدماغ على وجه التحديد وإصابتها بإبرة حادة لإحداث صدمة بالعرض والعمق المطلوبين في حمة الدماغ. في هذا الفيديو، سنستخدم إصابات الدماغ الحادة مع إجراءات ترقق النافذة أو الجمجمة، متبوعة بتصوير فوتونين للخلايا العصبية والخلايا الدبقية في دماغ ما بعد الصدمة.

يتم إجراء جميع التجارب المعروضة هنا وفقا للوائح جامعة هلسنكي للتجارب على ، ويتم تخدير الفأر عن طريق الحقن بين الصفاق للكيتامين والزين. تتم إزالة قطعة من الجلد لفضح الجمجمة ثم يتم تثبيت باستخدام قضبان الأذن على طاولة التسخين المرفقة بمناور التجسيم. يتم تثبيت حقنة بإبرة فولاذية بقطر 0.3 ملم على إعداد الحقن المجهري.

يسمح لنا إعداد الحقن الدقيق بتطبيق وخز مؤلم على منطقة محددة من الدماغ باستخدام مجهر مجهر ، ونقوم بتحديد نقطة الوخز على الجمجمة. نحدد منطقة الاهتمام باستخدام الإحداثيات التجسيمية. نقوم بحفر الجمجمة برفق وبعناية عند النقطة المحددة باستخدام مثقاب جراحي عالي السرعة.

نطبق الوخز على البئر المحفور ونغمر الإبرة لفترة وجيزة في الدماغ بعمق 0.5 إلى ملليمترين بدءا من مستوى قاع البئر. من المزايا الرائعة لهذه الطريقة أنه يمكننا حقن DI أو الأدوية في نفس البئر الصغير وبالتالي تقديم الحلول بدقة إلى موقع الإصابة. لتقديم الحلول إلى القشرة ، نستخدم حاقن دقيق مع وحدة تحكم إلكترونية وحقنة سعة 10 ميكرولتر متصلة بمناور تجسيم.

عندما يلامس طرف الماصة الزجاجية سطح الدماغ، نغمسها بمقدار 0.5 إلى ملليمتر واحد. ثم نستخدم وحدة التحكم في الحاقن الدقيقة لحقن 0.5 إلى ميكرولتر من D أو محلول الدواء في الدماغ بمعدل خمسة نانولترات في الثانية. ثم يتم حفر العظم برفق حول موقع الإصابة وإزالة القطعة المستديرة من الجمجمة.

يتم شطف سطح الدماغ بمخزن مؤقت للقشرة ويتم وضع زلة غطاء دائرية رفيعة أعلى فتحة الجمجمة. يتم إغلاق زلة الغطاء بغراء بولي أكريلاميد ويتم لصق حامل الفولاذ أعلى زلة الغطاء. لضمان الارتباط القوي لنافذة الجمجمة بالجمجمة ، يتم وضع الأسمنت السني في جميع أنحاء الحامل.

يتم تثبيت الفأر المخدر على مجهر الفوتون ، ويتم تصوير الخلايا في موقع الإصابة داخل الدماغ الحي. التقطت هذه الصورة بعد ثلاث ساعات من إصابة الدماغ. يظهر موقع الإصابة في دماغ فأر معدل وراثيا يعبر عن GFP تحت محفز GFAP في الخلايا النجمية.

بالإضافة إلى GFP الذي يعبر عن الخلايا النجمية الخضراء ، يتم تلطيخ العديد من الخلايا النجمية باللون الأحمر بواسطة حقن الكبريت الرم 1 0 1. تمثل الألياف البيضاء إشارة التوليد التوافقي الثانية ، ويفترض أنها تصور هياكل الألياف في المصفوفة خارج الخلية. تبين أن الجيل التوافقي الثاني هو أداة قيمة لتحديد موقع الإصابة.

تنبعث الإشارة من هياكل متماثلة غير مركزية مثل ألياف البروتين ولا تتطلب أي تلطيخ خارجي. تكون إشارة التوليد التوافقي الثانية أكثر كثافة على سطح الدماغ ولا تنتشر في عمق حمة الدماغ. في هذه الصورة ، يمكنك رؤية تراكم الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة في موقع الإصابة.

تظهر الخلايا الدبقية الصغيرة باللون الأخضر والجيل التوافقي الثاني باللون الرمادي. على مقربة من موقع الإصابة تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة تظهر مورفولوجيا مميزة مع عدد قليل من العمليات المتفرعة أثناء إعداد سطح الجمجمة. استخدم الإحداثيات التجسيمية لتحديد منطقة الدماغ المراد تصويرها وتمييزها بقلم.

تجنب مناطق الاهتمام الموجودة مباشرة فوق الباحثين في الجمجمة لأن الجمجمة أقل استقرارا في هذه المناطق ولأن الأوعية الكبيرة الأساسية في السحايا ستضر بجودة التصوير. ضع حامل الجمجمة المشفر بالغراء فوق منطقة الاهتمام على جمجمة عن طريق تطبيق الحد الأدنى من الضغط. ثم ضع أسمنت الأسنان حول الحامل ، وانتظر لمدة خمس دقائق تقريبا حتى يتم لصق حامل الجمجمة بإحكام على الجمجمة.

اغسل فتحة حامل الجمجمة عدة مرات باستخدام PBS لإزالة الغراء المتبقي غير المبلمر. تحت المجهر المجهري رقيق ، يبلغ قطر منطقة دائرية من الجمجمة عادة من 0.5 إلى 1.5 ملم فوق منطقة الاهتمام. تتكون جمجمة الفأر من طبقتين رفيعتين من العظام المضغوطة وطبقة سميكة من العظام الإسفنجية محصورة بينهما.

يحتوي العظم الإسفنجي على تجاويف صغيرة مرتبة في دوائر متحدة المركز وقنوات متعددة تحتوي على أوعية دموية أثناء ترققها ، وتزيل الطبقة الخارجية من العظام المضغوطة ومعظم العظم الإسفنجي. باستخدام مثقاب دقيق عالي السرعة ، استخدم الهواء المضغوط أثناء الحفر لتفجير العظام. يقوم الحطام بالحفر بشكل متقطع لتجنب ارتفاع درجة حرارة العظام الناجم عن الاحتكاك.

بارد ، الجزء الممل في السائل ، يحفظ في درجة حرارة الغرفة ويطبق بشكل دوري عازلة القشرة على منطقة التخفيف لمراقبة الحرارة. قد يحدث بعض النزيف من الأوعية التي تمر عبر العظم الإسفنجي أثناء عملية الترقق. عادة ما يتوقف هذا النزيف تلقائيا في غضون بضع دقائق.

استخدم التصوير التوافقي الثاني للتأكد من إزالة غالبية أنسجة العظام المنبوجة. في هذه المرحلة ، يجب ألا يقل سمك الجمجمة عن 50 ميكرومتر. اغمر الجمجمة في قطرة من عازلة القشرة واستمر في إجراء ترقق الجمجمة باستخدام شفرة جراحية مجهرية أو أزهار تشطيب دقيق للحصول على تحضير رقيق جدا وسلس يبلغ سمكه حوالي 20 ميكرومتر وقطره 700 ميكرومتر خلال المرحلة النهائية من عملية التخفيف ، قم بفحص المستحضر بشكل متكرر باستخدام تصوير الجيل التوافقي الثاني.

يمكن تصوير المنطقة المختارة قبل وبعد حدوث الإصابة. يجب تصوير عدة مناطق مختلفة من المنطقة الرقيقة للتحكم في القطع الأثرية المحتملة التي تسببها الجراحة للصدمة. الحاق. ضع الإبرة فوق المنطقة الرقيقة.

تأكد من عدم وجود أوعية كبيرة تحتها. اغمس الإبرة في الدماغ من 0.5 إلى ملليمترين لأسفل وفقا لإحداثيات موقع تطبيق الوخز. إزالة الإبرة وقمع النزيف الذي يظهر بعد إصابة الدماغ الحادة.

مع السدادة القطنية المرقئة ، انتظر حتى تتشكل الجلطات الدموية والنبض في موقع الإصابة. يمكن حقن المحاليل السفلية التي تحتوي ، على سبيل المثال ، على الكبريت رومين 1 0 1 أو أصباغ أخرى في فتحة الإصابة بنفس الطريقة الموضحة أعلاه لإعداد نافذة الجمجمة. على عكس نافذة الجمجمة في مستحضر ترقق الجمجمة ، يمكن الوصول إلى موقع الإصابة بشكل متكرر لتوصيل الأدوية والأصباغ.

الحفاظ على عقم جميع العمليات في الحفاظ على شفافية المنطقة الرقيقة عن طريق منع الالتهاب. هنا يمكنك رؤية موقع الإصابة المصور بعد ترقق الجمجمة. في الصورة على الجانب الأيسر ، يمكنك رؤية جانب الإصابة محاطا بتشعبات YFP المسماة من الخلايا العصبية القشرية بعد 20 دقيقة من الصدمة.

تمثل الصورة اليمنى نفس المنطقة من الدماغ في نفس بعد خمسة أيام من الصدمة. في هذه الصورة ، يمكنك رؤية مثال آخر على الدماغ اثنين من المجهر الفوتوني. بعد ترقق الجمجمة ، يمكن رؤية العظم من خلال إشارة التوليد التوافقي الثاني الموضحة باللون الرمادي.

في اللوحة اليسرى ، تظهر الخلايا الدبقية الصغيرة باللون الأخضر. في هذا الإعداد التجريبي ، يمكن ملاحظة الخلايا الدبقية الصغيرة تحت العظم حول موقع الإصابة كما هو موضح في اللوحة اليمنى. في هذه الدراسة ، استخدمنا كلا من نافذة الجمجمة المزمنة ومستحضرات ترقق الجمجمة لدراسة سلوك الخلية في ظل ظروف ما بعد الصدمة داخل الدماغ الحي.

كلتا الطريقتين لهما مزايا وقيود معينة. توفر نافذة الجمجمة المزمنة دقة أفضل ، وتغلغلا أعمق في أنسجة المخ ، وراحة جلسات التصوير المتعددة. من ناحية أخرى ، من غير المرجح أن يؤدي إجراء ترقق الجمجمة إلى الالتهاب في موقع التصوير ويسمح بالتطبيقات المتكررة للأدوية والأصباغ.