التثقيب الكهربائي للأجنة الدجاجية In ovo

التثقيب الكهربائي هو تقنية تُستخدم لإدخال مادة وراثية غريبة إلى الخلايا. ويُعد التثقيب الكهربائي لأجنة الدجاج داخل البيضة، أو التثقيب الكهربائي in ovo، أداة قيمة لعلماء الأحياء النمائية لأن إيصال المادة الوراثية يمكن توجيهه إلى أنسجة معينة ونقاط زمنية نمائية محددة. سيقدم هذا الفيديو المبادئ الأساسية للتثقيب الكهربائي in ovo، ويشرح الخطوات الأساسية للإجراء، ويناقش كيفية استخدام هذه التقنية لدراسة العمليات البيولوجية أثناء النمو.

في البداية، دعونا نراجع المبادئ الأساسية للتثقيب الكهربائي (electroporation) لمعرفة كيفية استخدامه لإدخال الـ DNA إلى الخلية.

أولاً، يُستخدم الحقن المجهري لإيصال الـ DNA إلى منطقة قريبة جداً من الخلية المستهدفة. ومع ذلك، لا يمكن للـ DNA اختراق الغشاء البلازمي للدخول إلى الخلية.

ولحل هذه المشكلة، يتم تطبيق تيار كهربائي لزعزعة استقرار الغشاء، مما يؤدي إلى تكوين مسام. وتتمثل النتيجة الثانية لهذا المجال الكهربائي في هجرة الـ DNA المشحون سلبياً نحو القطب الموجب. ونتيجة لذلك، يتم ترانسفكشن (transfection) الخلايا الموجودة على جانب موقع الحقن الأقرب إلى القطب الموجب فقط بواسطة الـ DNA.

بعد أن تعرفت على المبادئ الأساسية، لنتحدث عن كيفية تحضير الأجنة لعملية التثقيب الكهربائي. إذا كنت بحاجة إلى استخدام أجنة تتجاوز المرحلة 20 من تصنيف Hamburger Hamilton، فمن الأفضل زراعة الكتاكيت خارج القشرة، أو ex ovo، لتحسين الوصول إلى الأنسجة. سيركز هذا الفيديو على عمليات التثقيب الكهربائي التي تُجرى على الأجنة المبكرة التي تنمو داخل القشرة، أو in ovo.

للبدء، يجب تحضين البيض في حضانة رطبة عند 37 °C حتى تصل الأجنة إلى المرحلة النمائية المطلوبة. وأثناء تحضين البيض، قم بتجهيز أدوات الحقن والتثقيب الكهربائي. أولاً، اصنع إبراً شعيرية عن طريق سحب ماصة زجاجية بقطر 0.5 mm باستخدام جهاز سحب الماصات. لفتح الماصة، ضعها تحت المجهر واكسر قطعة صغيرة من طرفها. ثم قم بتحضير محلول الحقن، والذي يجب أن يحتوي على تخفيف مناسب من البناء الجيني الخاص بك بالإضافة إلى صبغة لمساعدتك في رؤية المحلول المحقون.

للتحكم في حركة السائل داخل الإبرة، قم بتوصيلها بماصة فموية يدوية. وبدلاً من ذلك، يمكن تحميل الإبرة على حاقن مجهري، والذي يوفر نبضات ضغط هواء قابلة للتعديل. املأ الإبرة عن طريق غمر طرفها في محلول الحقن وتطبيق ضغط سلبي.

بالإضافة إلى الإبر، ستحتاج أيضاً إلى أقطاب كهربائية. وتتكون هذه الأقطاب من سلكين مكشوفين مثبتين معاً بواسطة محول. ويقوم زوج من الكابلات بتوصيل الأقطاب بمولد النبضات الكهربائية، أو جهاز التثقيب الكهربائي، الذي يتحكم في مدة النبضة وترددها وجهدها. وللتشغيل دون استخدام اليدين، يمكن تفعيل جهاز التثقيب الكهربائي بواسطة دواسة قدم.

بمجرد أن يصبح البيض جاهزاً، اصنع نافذة في القشرة، وأضف بضع قطرات من محلول ملحي فسيولوجي، مثل محلول Hanks، لمنع الجنين من الجفاف. تحت المجهر، ضع البيضة بحيث يكون النسيج المستهدف في متناول الإبرة. ثم اخترق الجنين بالإبرة الشعيرية وقدم المحلول عن طريق تطبيق ضغط خفيف.

بعد حقن البناء الجيني، حان الوقت لإجراء عملية التثقيب الكهربائي. ضع الأقطاب الكهربائية بحيث تكون مغمورة في محلول Hank’s ويكون النسيج المستهدف متمركزاً بينهما. ولتطبيق التيار الكهربائي، اضغط على دواسة القدم وراقب تكون فقاعات حول الأقطاب الكهربائية.

بمجرد اكتمال عملية التثقيب الكهربائي، قم بإزالة الأقطاب الكهربائية من الجنين وامسحها بـ 70% ethanol. أضف بضع قطرات من محلول ملحي مدعم بالمضادات الحيوية لمنع العدوى، ثم أغلق النافذة بشريط لاصق. وأخيراً، أعد البيض إلى الحاضنة لمواصلة النمو قبل إجراء التحليل المظهري.

بعد أن تعرفنا على كافة تفاصيل التثقيب الكهربائي in ovo، دعونا نلقِ نظرة على بعض الأمثلة حول كيفية تطبيق العلماء لهذه التقنية في أبحاث النمو والتطور.

بدايةً، يمكن استخدام التثقيب الكهربائي لحجب التعبير الجيني عن طريق إيصال بنيات التثبيط (knockdown constructs). في هذا المثال، تم إجراء تثقيب كهربائي لخلايا الأنبوب العصبي النامي باستخدام بنيات لإسكات الجينات. تُرِكت الأجنة لتنمو، ثم قورنت مسارات المحاور العصبية بين العينات الطبيعية وعينات التثبيط لتقييم التحكم الجيني في توجيه المحاور العصبية.

على الجانب الآخر، يمكن استخدام التثقيب الكهربائي in ovo أيضاً للتعبير عن بروتين في مجموعة فرعية من الخلايا عن طريق إدخال بلازميد يحتوي على جين مشفر للبروتين ومحفز (promoter)، وهو تسلسل يرتبط بإنزيم RNA polymerase لبدء عملية النسخ. هنا، قام العلماء بإيصال جين واحد إلى خلايا الدماغ الجنيني. ويظهر صبغ الأنسجة للكشف عن كل من المنتج البروتيني لهذا الجين وعلامات الأنواع الفرعية العصبية المحددة أن الجين الذي تم إدخاله عبر التثقيب الكهربائي يغير التطور العصبي.

كما يمكن إدخال بنيات DNA التي تشفر بروتينات فلورية عن طريق التثقيب الكهربائي لتصور الخلايا والبنى أثناء التطور. وهذا يسمح بالتصوير الحي للعمليات المعقدة، مثل تطور النخاع الشوكي، مما يعطي رؤية واضحة حول ديناميكيات تحركات الخلايا بمرور الوقت.

لقد شاهدتم للتو مقدمة JoVE حول التثقيب الكهربائي in ovo، وهي تقنية مفيدة لإدخال المادة الوراثية إلى الأفراخ. تناول هذا الفيديو المبادئ الأساسية للتثقيب الكهربائي، والخطوات المطلوبة لحقن الأفراخ وتثقيبها كهربائياً، وتطبيقات هذه التقنية في الأبحاث التنموية الحالية. شكراً للمشاهدة!