ملامح التعبير microRNA من خلايا الجذع الإنسان، الشبكية المشتقة من الظهارة الصبغية المحفزة، والجنين الظهارة الصبغية الشبكية

الهدف العام من هذا الإجراء هو مقارنة تعبير micro RNA في الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات، وخلايا الظهارة الصباغية الشبكية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات، وخلايا الظهارة الصباغية الشبكية الجنينية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق زراعة وتوسيع الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات وخلايا RPE الجنينية.

تتمثل الخطوة الثانية في تمايز خلايا IPS إلى RPE. بعد ذلك، يتم استخلاص RNA من خلايا IPS، وخلايا I-P-S-R-P-E، وخلايا RPE الجنينية. وتتمثل الخطوة النهائية في إجراء تحليل مصفوفة ميكرو RNA (micro RNA microarray) على عينات RNA وتحليل البيانات.

وفي النهاية، يُستخدم تحليل المسارات والشبكات لتحديد جزيئات microRNAs ذات التعبير التفاضلي التي تشارك في شبكات خلوية متعددة، بما في ذلك التكاثر وتقدم الدورة الخلوية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال أبحاث الرؤية، مثل دور micro RNA في تنظيم التمايز إلى خلايا ظهارة صباغية شبكية (RPE) ناضجة، وتقدم الدورة الخلوية، والتكاثر، والشيخوخة. وتمتد تطبيقات هذه التقنية لتشمل العلاجات المستخدمة في ظهارة صباغية شبكية مشتقة من الخلايا الجذعية لاستبدال خلايا RPE المصابة بمرض أو تالفة، وذلك لأنه يمكن تحديد عدد الممرات الأمثل للخلايا المستخدمة في العلاج.

على الرغم من أن هذا الأمر يمكن أن يوفر رؤية حول العوامل التي تنظم تمايز RRP من IPS، إلا أنه يمكن تطبيقه أيضاً على أنظمة أعضاء أخرى، مثل تمايز أنواع الخلايا الأخرى المحددة لـ TC من IPS. لبدء هذا الإجراء، يتم زرع الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات بكثافة تبلغ حوالي 350 مستعمرة خلوية لكل بئر على طبق مطلي حديثاً في وسط M tester one، وتترك مستعمرات IPSL لتتوسع لمدة تتراوح من أربعة إلى خمسة أيام في المزرعة.

بعد ذلك، استبدل وسط M tesser one كل ثلاثة أيام بأربعة مليلترات من وسط التمايز، مع تغيير نصف كمية الوسط بوسط تمايز جديد. اترك البؤر المصبوغة لتنمو بحجم كافٍ يسمح بتشريحها يدويًا من المزرعة، وهو ما يستغرق من 40 إلى 50 يومًا تقريبًا. ثم استخدم رأس ماصة سعة 200 microliter للقص حول المستعمرات المصبوغة ورفعها.

اجمع المستعمرات التي تم تشريحها وادمجهـا في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter. أضف خمسة milliliters من وسط DMMF 12 إلى خلايا RPE المجمعة وقم بالطرد المركزي عند 300 GS لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، أزل الوسط وأعد تعليق كُتلة الخلايا في خمسة milliliters من الوسط وكرر عملية الطرد المركزي.

أزل الوسط من كتلة الخلايا. ثم قم بتحضير محلول خلية مفردة عن طريق تحضين I-P-S-R-P-E المجمعة مع 0.25%TRIPSIN EDTA لمدة تتراوح من خمس إلى 10 دقائق عند 37 °C حتى تتفكك تجمعات الخلايا إلى خلايا مفردة. اشطف خلايا I-P-S-R-P-E بواسطة وسط I-P-S-R-P-E، ثم ازرع الخلايا المجمعة على طبق مطلي بـ matrigel جديد في 4 mL من وسط استزراع I-P-S-R-P-E، واستزرع الخلايا لمدة ثلاثة أسابيع قبل عملية النقل، وقم بتغيير الوسط بوسط I-P-S-R-P-E جديد كل ثلاثة أيام خلال التجربة.

قم بزارعة خلايا I-P-S-R-P-E بكثافة 100,000 خلية لكل سنتيمتر مربع، ثم اجمع الخلايا بعد 17 يوماً من الزرع للحصول على خلايا IPS غير متمايزة. استمر في استنبات الخلايا حتى يلاحظ أن المستعمرات غير المتمايزة أصبحت كثيفة في المركز. وعند ملاحظة ذلك، اشطف المستعمرات باستخدام وسط D-M-E-M-F 12، ثم قم بتفكيك خلايا IPS إلى خلايا مفردة باستخدام Accutane.

اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter وقم بالطرد المركزي عند 300 Gs لمدة خمس دقائق. اسحب السائل الطافي وأعد تعليق كتلة الخلايا في 2 milliliters من وسط D-M-E-M-F 12 لجمع الظهارة الصبغية للشبكية الجنينية (fetal RPE)؛ ابدأ بشطف مستنبتات خلايا fetal RPE باستخدام D-M-E-M-F 12. ثم قم بتفكيك المستنبتات الخلوية إلى خلايا مفردة باستخدام 0.25%TRIPSIN EDTA لمدة تتراوح من خمس إلى 10 دقائق، عند 37 degrees Celsius.

اجمع خلايا الظهارة الصباغية للشبكية (RPE) الجنينية في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter وقم بالطرد المركزي عند 300 GS لمدة خمس دقائق. ثم اسحب السائل الطافي وأعد تعليق ركازة الخلايا في 2 milliliter من وسط D-M-E-M-F 12.

قم بجمع خلايا I-P-S-R-P-E في اليوم 17. بعد الممر الثالث والممر الخامس، اشطف خلايا I-P-S-R-P-E مرتين باستخدام PBS وقم بتحضير معلق خلوي أحادي عن طريق الحضن مع 1 milliliter من trypsin بتركيز 0.25% لمدة تتراوح من 5 إلى 10 minutes عند 37 °C. بعد ذلك، قم بمعادلة trypsin باستخدام 2 milliliters من وسط I-P-S-R-P-E المبرد بالثلج واجمع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter.

قم بطرد الأنبوب مركزياً لمدة خمس دقائق عند 300 Gs ثم اسحب السائل العلوي. أعد تعليق كتل الخلايا في ثلاثة ملي لترات من محلول التلوين المنظم من طقم الخرزات الدقيقة، ثم قم بطرد معلق خلايا I-P-S-R-P-E مركزياً في محلول التلوين المنظم عند 300 GS لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، اسحب السائل العلوي وأعد التعليق.

قم بتعليق كتلة الخلايا بتركيز 2 × 10⁶ خلية لكل 100 µL من محلول التلوين المنظم الموجود في مجموعة الخرزات الدقيقة. أضف 10 µL من الجسم المضاد anti TRA one 60 PE لكل 2 × 10⁶ خلية. اخلط جيداً ثم قم بالتحضين عند درجة حرارة 4 °C لمدة 10 دقائق.

اغسل الخلايا باستخدام 1 mL من محلول التلوين لكل 2 × 10⁶ من الخلايا. ثم قم بطرد معلق الخلايا مركزياً لمدة 10 دقائق عند 300 ×g. بعد ذلك، اسحب السائل وأعد تعليق كتلة الخلايا في 80 µL من محلول التلوين لكل 2 × 10⁶ من الخلايا.

ثم أضف 20 µL من الخرزات الدقيقة الموسومة بـ anti PE لكل 2×10⁶ من الخلايا. اخلط جيداً وحضن لمدة 15 دقيقة عند 4 °C. أضف 1 mL من محلول صبغ الخلايا لكل 2×10⁶ من الخلايا، ثم قم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 300 ×g واسحب الراشح.

بعد ذلك، أعد تعليق كتلة الخلايا في 500 µL من محلول التلوين، وقم بفرز الخلايا السالبة لـ TRA one 60 باستخدام فارز خلايا مغناطيسي كما هو موضح في بروتوكول النص المرفق. ثم قم بتحليل الخلايا عن طريق تمرير كل عينة عبر عمود دوران صغير (mini spin column) متجانس للطرد المركزي الدقيق متاح تجاريًا ومصمم لتحضيرات الحمض النووي الصغيرة (mini preps). ثم استخلص الحمض النووي الريبوزي الكلي (total RNA) من خلايا IPS و I-P-S-R-P-E و RPE الجنينية باستخدام طقم استخلاص RNA متاح تجاريًا ومصمم للحفاظ على جزيئات RNA الصغيرة.

استخدم مقياس الطيف الضوئي NanoDrop لتحديد تركيزات RNA الكلية، ثم قم بإنشاء ملف Excel يتضمن قائمة بـ microRNAs التي تم تحديد أن مستويات تعبيرها تختلف بمقدار ضعفين على الأقل بين مجموعات العينات. بعد ذلك، قم بتسجيل الدخول إلى برنامج تحليل مسارات RNA عبر الإنترنت وقم بتحميل ملف Excel. اختر "flexible format" لتنسيق الملف، واختر "Agilent" من القائمة المنسدلة للمعَرّف.

اكتب تحت عنوان البيانات الخام (raw data). قم بتعيين معرف المسبار (probe ID) لعمود معرف المسبار (probe ID)، وقم بتعيين الملاحظة واحد (observation one) والنسبة اللوغاريتمية (log ratio) لعمود النسبة اللوغاريتمية (log ratio). اختر "تجاهل" (ignore) لجميع الأعمدة الأخرى.

حدد معايير التحليل على النحو التالي: بالنسبة للثقة، اختر "الملاحظة تجريبيًا" فقط، وقم بتضمين العلاقات المباشرة وغير المباشرة، وتضمين المواد الكيميائية الداخلية. اختر قاعدة معرفة ingenuity كمجموعة مرجعية، ثم اختر قاعدة بيانات الجزيئات المرجعية.

يتضمن ذلك بيانات من جميع الأنواع، وجميع الخطوط الخلوية والأنسجة، وجميع الطفرات. بعد اختيار كافة المعلمات، قم بإجراء تحليل الشبكة عن طريق اختيار الشبكات. ثم اختر الشبكات المتداخلة، وبعد ذلك انقر فوق الشبكة المطلوبة لعرض النتائج.

أظهرت خلايا IPS التي تمايزت إلى خلايا I-P-S-R-P-E النمط الظاهري الكلاسيكي لخلايا RPE المتمثل في شكل خلايا صبغية سداسية، وهو ما يشبه خلايا RPE الجنينية. وكشفت مقارنة ملف تعبير micro RNA لخلايا IPS غير المتمايزة مع خلايا I-P-S-R-P-E عن زيادة في تنظيم 47 من جزيئات microRNAs وانخفاض في تنظيم 36 جزيئاً، بينما أظهرت خلايا RPE الجنينية زيادة في تنظيم 61 من جزيئات microRNAs مقارنة بخلايا I-P-S-R-P-E وانخفاض في تنظيم 49 جزيئاً. وأشار تحليل المسار باستخدام برنامج ingenuity IPA إلى أن الجينات المستهدفة من جزيئات microRNAs ذات التعبير المتباين كانت مشاركة في عمليات خلوية تشمل التطور الخلوي، والنمو، والدورة الخلوية. كما أشار هذا التحليل إلى أن جزيئات microRNAs التي يتم التعبير عنها في الأنسجة العينية داخل الجسم كانت غنية في خلايا I-P-S-R-P-E وخلايا RPE الجنينية مقارنة بخلايا IPS. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر منع تلوث وتحلل عينات RNA بعد هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل R-T-P-C-R من أجل تأكيد مستوى تعبير micro RNA في كل نوع من الخلايا بعد استزراعها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أبحاث الرؤية لاستكشاف دور micro RNA في التمايز وتقدم الدورة الخلوية في rrp. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اشتقاق RPE من IPS ومقارنة ملف تعبير microRNA لخلايا I-P-S-R-P-E مع خلايا IPS وRPE الجنينية.