عكس النهج الوراثية عن طريق القلب البطيني Morpholino حقن لبالنقل متعددة يصعب الهدف الأنسجة في الزرد اليرقة

الهدف العام من هذا الإجراء هو إيصال قليلات النوكليوتيد المورفولينو عبر الحقن البطيني في يرقات سمك القد، وتثبيط الجينات لتقييم وظيفتها أثناء التجدد. ويتم تحقيق ذلك من خلال تخدير اليرقات أولاً ووضعها في أخدود قالب التثبيت. بعد ذلك، يتم إدخال إبرة الحقن في البطين القلبي.

بعد ذلك، يتم حقن محلول morpho من أربع إلى ست مرات في البطين مع فواصل زمنية بين النبضات للسماح بتفريغ القلب. وفي النهاية، يتم بتر زعنفة الذيل وتُترك لتتجدد لمدة ثلاثة أيام. وفي الختام، يمكن تقييم التأثير على تجدد الزعنفة من خلال قياس المنطقة المتجددة من الزعنفة باستخدام أداة تتبع الخطوط في برنامج Fiji image J مفتوح المصدر.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل نقل الجينات أو الطفرات الموجهة، في أنها تسمح بتثبيط الجينات بواسطة morphinos في الأنسجة اليرقية التي لا تصلح للحقن المباشر. باستخدام شعيرات زجاجية بقطر 0.75 millimeter، ضع إحداها في سحب الإبر وقم بسحب الإبرة وفقاً للمعايير التالية؛ وباستخدام ملقط صانع الساعات، وتحت مجهر ستيريو مزود بقطعة عينية ميكرومترية، اكسر الشعيرة المسحوبة لإنتاج إبرة بقطر 20 micrometer. بعد ذلك، استخدم مخرطة ذات عجلة دوارة مطاطية مائلة لشحذ الإبرة وإنتاج شطبة بقطر 20 micrometer. قم بتحضير المخزون من الـ morpho عن طريق إذابة الـ Lyophilized Morpho في 1x PBS للوصول إلى تركيز نهائي قدره 7.5 millimolar.

قم بتحضير محلول حقن Morpho عن طريق خلط 2.5 µL من محلول Morpho المخزون مع 2.8 µL من محلول endo Porter المخزون بتركيز 1 mM، للحصول على تركيز نهائي قدره 3.5 mM من morph و0.5 mM من endo porter لإجراء عمليات الحقن. استخدم ماصة دقيقة ذات طرف سعة 10 µL لتعبئة إبرة زجاجية مشطوفة بـ 5 µL من محلول morpho. ثم أدخل الإبرة الزجاجية في حامل الإبر الخاص بالمناور الدقيق المتصل بمضخة pico الهوائية.

اضبط زاوية الحقن لتكون 45 درجة تقريبًا بحيث لا يتطلب تحريك الإبرة سوى اتجاه مستوٍ واحد. بعد ذلك، اضبط قيم الحاقن الدقيق (micro injector) على النحو التالي: ضغط تثبيت قدره 20 pounds per square inch أو PSI، وضغط قذف قدره 15 PSIA، ونطاق بوابي يبلغ 100 millisecond، وقيمة دورية تبلغ 1.9، وهو ما يعادل 10.9 milliseconds. قم بتحضير 20 milliliters من 1.5%aros المذاب في XPBS وصبّه في طبق بتري بقطر 10 centimeter.

بعد ذلك، ضع قالب حقن محززاً في الـ aros الدافئ لتشكيل أخاديد في الهلام المتصلب لتخدير اليرقات. ضعها في 100 milliliters من مياه الحوض التي تحتوي على 20 milligrams per liter من الـ trican. وبعد توقفها عن الاستجابة للمس، استخدم ماصة بلاستيكية لنقل اليرقة بعناية إلى أحد أحاديد قالب الـ aros الرطب بحيث يكون الجانب البطني مواجهاً لجدار الـ aros الرأسي للأخدود.

ضع صفيحة aros تحت المجهر الستيريو بحيث يكون البطين مواجهًا بعيدًا عن إبرة الحقن. بعد ذلك، اخفض الإبرة وأدخلها بنحو 1 إلى 2 ميكرومتر في بطين القلب، مع الحرص على عدم إدخالها بعمق زائد.

ثم يتم حقن نبضة بحجم 3 nanoliter من محلول Morpho في البطين والانتظار حتى تصفية القلب قبل تكرار العملية بخمس نبضات إضافية بعد الحقن، ثم تُسحب الإبرة وتوضع في طبق بتري يحتوي على XPBS لمنع جفافها. بعد ذلك، وباستخدام ماصة نقل مملوءة بوسط E three، تُنقل اليرقات بعناية مرة أخرى إلى طبق بتري يحتوي على وسط E three طازج لضمان امتصاص الـ morpho وبقائه داخل الخلايا. تُكرر عمليات الحقن كل 12 إلى 24 ساعة طوال فترة التجربة لتقييم الحقن.

بعد تخدير الأسماك، ضعها على طبق "أروس" مسطح ورطب مغطى بوسط E three قبل تصويرها باستخدام مجهر ستيريو بنظام المجال المضيء والفلورة. قم بتحليل الصور لتقييم التجدد باستخدام برنامج Fiji Image J المجاني، مع استخدام أداة تتبع الخطوط لتحديد مقدار النمو التجديدي الذي حدث. أولاً، قم بمعايرة الصور عن طريق سحب وإفلات ملف في نافذة Fiji الرئيسية في القائمة الرئيسية.

قم بتعيين المقياس لجميع الصور من خلال النقر على analyze في القائمة المنسدلة. انقر على set scale، ثم قم بتفعيل الخيار global بالنقر على مربع الاختيار. الآن، قم بسحب الصورة وإفلاتها مرة أخرى لقياس مقدار النمو التجددي في شريط الأدوات.

اختر أداة التحديد الحر (freehand selections tool) وقم برسم دائرة حول المنطقة المراد قياسها. أخيراً، اضغط على Ctrl M. سيؤدي ذلك إلى فتح نافذة نتائج جديدة تعرض قيمة المنطقة المحددة بالبكسل المربع. كما يظهر هنا خلال دقائق من الحقن، يتوزع محلول morpho endo porter عبر الأوعية الدموية في أنسجة مختلفة مثل طية الزعنفة والدماغ لمدة 12 ساعة أو أكثر على الأقل.

لتقييم تجدد هياكل الزعنفة اليرقية القاصية، تمت إزالة كل مما يلي: الطرف القاصي لثنية الزعنفة والحبل الشوكي، والحبل القاصي، وعضلة الجذع القاصية (والتي لا تظهر هنا)، والخلايا الصبغية التي يصعب استهدافها عن طريق الحقن المباشر، ولكن يبدو أنها تدمج الـ morpho بعد عمليات الحقن البطيني المتتالية. وبذلك، تسهل هذه الطريقة نسبياً توصيل الـ morpho إلى الأنسجة التي يصعب استهدافها بشكل فردي، كما تسمح بتقييم وظيفة الجينات في عدة أنسجة في الزعنفة المتجددة في آن واحد. ولتحليل أهمية جينات معينة تشارك في عملية التجدد، يتم بتر زعنفة اليرقة جزئياً، ثم يتم استئصال جميع الأنسجة التي دمجت الـ morpho.

تتجدد بنية طية الزعانف اليرقية خلال أيام قليلة بعد البتر كما تم توضيحه. وهنا، استهدف الـ morpho الجينات المطلوبة للتجدد، مما أدى إلى اضطراب استجابة التجدد مقارنة بمجموعات التحكم التي لم تُحقن أو التي حُقنت بـ mismatch morpho بعد نموها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التجدد لاستكشاف الآليات الجزيئية المشاركة في تجدد زعانف zebra fish.