عكس النهج الوراثية عن طريق القلب البطيني Morpholino حقن لبالنقل متعددة يصعب الهدف الأنسجة في الزرد اليرقة

الهدف العام من هذا الإجراء هو توصيل قليل النوكليوتيدات عبر الحقن البطينية في اليرقات ، وزعنفة التدليل ، وهدم الجينات لتقييم وظيفتها أثناء التجديد. يتم تحقيق ذلك عن طريق تخدير اليرقة أولا ووضعها في أخدود من قالب الحوس. بعد ذلك ، يتم إدخال إبرة الحقن في بطين القلب.

ثم يتم حقن محلول مورفو من أربع إلى ست مرات في البطين مع فترات ترجيح بين النبضات للسماح بتطهير القلب. أخيرا ، يتم بتر زعنفة الكديل والسماح لها بالتجدد لمدة ثلاثة أيام. في النهاية ، يمكن بعد ذلك تقييم التأثير على تجديد الزعانف عن طريق قياس المنطقة المتجددة من الزعنفة باستخدام أداة تتبع الخط لبرنامج Fiji image J مفتوح المصدر.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التحول أو الطفرات ، هي أنها تسمح بضربة قاضية للجينات بواسطة minos في أنسجة اليرقات غير المناسبة للحقن المباشر باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية التي يبلغ قطرها 0.75 ملم ، ضع واحدة في مجتذب الإبرة واسحب الإبرة بالمعلمات التالية باستخدام ملاقط صانعي الساعات ، وتحت مجسم بعدسة ميكرومتر ، قم بكسر الشعيرات الدموية المسحوبة لإنتاج إبرة قطرها 20 ميكرومتر. ثم استخدم مخرطة بعجلة غزل مطاطية متشابكة لشحذ الإبرة وإنتاج شطبة 20 ميكرومتر. قم بإعداد مخزون مورفو عن طريق إذابة مورفو المجفف بالتجميد في XPBS واحد إلى تركيز نهائي يبلغ 7.5 ملليمولار.

امزج محلول حقن مورفو عن طريق الجمع بين 2.5 ميكرولتر من محلول مخزون مورفو مع 2.8 ميكرولتر من محلول مخزون إندو بورتر المليمولار للحصول على تركيز نهائي يبلغ 3.5 مللي مولار مورف و 0.5 ملليمولار endo porter لإجراء الحقن. استخدم ماصة صغيرة برأس 10 ميكرولتر لتحميل الإبرة الزجاجية المشطوفة بخمسة ميكرولترات من محلول مورفو. ثم أدخل الإبرة الزجاجية في حامل الإبرة للمناور الصغير المتصل بمضخة بيكو الهوائية.

اضبط زاوية الحقن على حوالي 45 درجة بحيث تحتاج الإبرة فقط إلى تحريكها في اتجاه مسوي واحد. بعد ذلك ، قم بتعيين قيم الحاقن الصغير على النحو التالي ، ضغط تعليق يبلغ 20 رطلا لكل بوصة مربعة أو PSI ، وضغط طرد يبلغ 15 PSIA 100 مللي ثانية من البوابات وقيمة الفترة 1.9 ، والتي تتوافق مع 10.9 مللي ثانية. قم بإعداد 20 مل من 1.5٪ من الأروس المذاب في XPBS واحد واسكبه في طبق بتري 10 سم.

ثم ضع قالب حقن محزز في الحمض الدافئ لتشكيل أخاديد في الجل المتصلب لتخدير اليرقات. ضعها في 100 مل من ماء الحوض مع 20 ملليغرام لكل لتر من التريكان. بعد أن يتوقفوا عن الاستجابة للمس ، استخدم ماصة بلاستيكية رعوية لنقل اليرقة بعناية إلى أخدود من قالب الأروس الرطب بحيث يكون الجانب البطني مواجها لجدار الأروس الرأسي للأخدود.

ضع صفيحة aros تحت المجهر الاستريو بحيث يكون البطين متجها بعيدا عن إبرة الحقن. بعد ذلك ، اخفض الإبرة وأدخلها حوالي ميكرومتر إلى ميكرومتر في بطين القلب. مع الحرص على عدم إدخاله بعمق.

ثم قم بحقن نبضة ثلاثة نانولتر من محلول مورفو في البطين والوزن للسماح بتطهير القلب قبل التكرار بخمس نبضات أخرى بعد الحقن ، قم بإزالة الإبرة ووضعها في طبق بتري يحتوي على XPBS لمنع الجفاف. ثم باستخدام ماصة نقل مملوءة ب E ثلاثة وسط ، انقل اليرقات بعناية مرة أخرى إلى طبق بتري يحتوي على E ثلاثة متوسطات طازجة لضمان امتصاص وصيانة المورفو في الخلايا. كرر الحقن كل 12 إلى 24 ساعة طوال مدة التجربة لتقييم الحقن.

بعد تخدير الأسماك ، ضعها على طبق مسطح مبلل مغطى ب E ثلاثة وسط قبل استخدام مجهر استريو مع مجال ساطع ومضان لتصويرها. قم بتحليل الصور للتجديد باستخدام برنامج Fiji Image J المجاني لاستخدام أداة تتبع الخط لتحديد مقدار النمو المتجدد الذي حدث. أولا ، قم بمعايرة الصور عن طريق سحب ملف وإفلاته في نافذة فيجي الرئيسية في القائمة الرئيسية.

قم بتعيين مقياس جميع الصور بالنقر فوق تحليل في القائمة المنسدلة. انقر على تعيين المقياس، ثم قم بتشغيل الخيار العام بالنقر فوق خانة الاختيار. الآن قم بسحب الصورة وإفلاتها مرة أخرى لقياس مقدار النمو المتجدد في شريط الأدوات.

اختر أداة التحديدات اليدوية وقم بتطويق المنطقة المراد قياسها. أخيرا ، اضغط على Ctrl M.سيؤدي هذا إلى فتح نافذة نتائج جديدة تعرض قيمة المنطقة المحيطة بالبكسل المربع. كما هو موضح هنا في غضون دقائق من الحقن ، يوزع محلول مورفو إندو بورتر في جميع أنحاء الأوعية الدموية في أنسجة مختلفة مثل طية الزعنفة والدماغ لمدة 12 ساعة على الأقل أو أكثر.

لتقييم تجديد هياكل زعانف اليرقات البعيدة ، تمت إزالة ما يلي ، الطرف البعيد لطية الزعنفة والحبل الشوكي ، والحبل البعيد ، وعضلة الجذع البعيدة ، والتي لا يمكن رؤيتها هنا ، والخلايا الصبغية ، التي يصعب استهدافها عن طريق الحقن المباشر ، ولكن يبدو أنها تدمج مورفو بعد الحقن البطيني التسلسلي. وبالتالي ، فإن هذه الطريقة تعزز بسهولة نسبيا توصيل المورفو إلى الأنسجة التي يصعب استهدافها بشكل فردي ، وتسمح بتقييم وظيفة الجينات في العديد من الأنسجة في الزعنفة المتجددة في وقت واحد. لتحليل أهمية جينات معينة تشارك في التجديد ، يتم بتر زعنفة اليرقات جزئيا ، ويتم استئصال جميع الأنسجة التي أدرجت المورفو.

تجدد طية زعنفة اليرقات هيكلها في غضون أيام قليلة بعد البتر كما هو موضح. هنا ، يستهدف مورفو الجينات المطلوبة للتجديد ، مما أدى إلى اضطراب استجابة التجديد مقارنة بعناصر التحكم في مورفو المحقون وعدم التطابق بعد تطويره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التجديد لاستكشاف الآليات الجزيئية التي تشارك في تجديد زعنفة أسماك الحمار الوحشي.