عكس النهج الوراثية عن طريق القلب البطيني Morpholino حقن لبالنقل متعددة يصعب الهدف الأنسجة في الزرد اليرقة
يونيو 17, 2014
طريقة الوراثية العكسية للتكيف الزرد لتقييم وظيفة الجين خلال مراحل لاحقة من التطور والتوازن الفسيولوجية مثل تجديد الأنسجة باستخدام الحقن داخل البطينات من morpholinos الجينات المحددة.
الهدف العام من هذا الإجراء هو توصيل قليل النوكليوتيدات عبر الحقن البطينية في اليرقات ، وزعنفة التدليل ، وهدم الجينات لتقييم وظيفتها أثناء التجديد. يتم تحقيق ذلك عن طريق تخدير اليرقة أولا ووضعها في أخدود من قالب الحوس. بعد ذلك ، يتم إدخال إبرة الحقن في بطين القلب.
ثم يتم حقن محلول مورفو من أربع إلى ست مرات في البطين مع فترات ترجيح بين النبضات للسماح بتطهير القلب. أخيرا ، يتم بتر زعنفة الكديل والسماح لها بالتجدد لمدة ثلاثة أيام. في النهاية ، يمكن بعد ذلك تقييم التأثير على تجديد الزعانف عن طريق قياس المنطقة المتجددة من الزعنفة باستخدام أداة تتبع الخط لبرنامج Fiji image J مفتوح المصدر.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التحول أو الطفرات ، هي أنها تسمح بضربة قاضية للجينات بواسطة minos في أنسجة اليرقات غير المناسبة للحقن المباشر باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية التي يبلغ قطرها 0.75 ملم ، ضع واحدة في مجتذب الإبرة واسحب الإبرة بالمعلمات التالية باستخدام ملاقط صانعي الساعات ، وتحت مجسم بعدسة ميكرومتر ، قم بكسر الشعيرات الدموية المسحوبة لإنتاج إبرة قطرها 20 ميكرومتر. ثم استخدم مخرطة بعجلة غزل مطاطية متشابكة لشحذ الإبرة وإنتاج شطبة 20 ميكرومتر. قم بإعداد مخزون مورفو عن طريق إذابة مورفو المجفف بالتجميد في XPBS واحد إلى تركيز نهائي يبلغ 7.5 ملليمولار.
امزج محلول حقن مورفو عن طريق الجمع بين 2.5 ميكرولتر من محلول مخزون مورفو مع 2.8 ميكرولتر من محلول مخزون إندو بورتر المليمولار للحصول على تركيز نهائي يبلغ 3.5 مللي مولار مورف و 0.5 ملليمولار endo porter لإجراء الحقن. استخدم ماصة صغيرة برأس 10 ميكرولتر لتحميل الإبرة الزجاجية المشطوفة بخمسة ميكرولترات من محلول مورفو. ثم أدخل الإبرة الزجاجية في حامل الإبرة للمناور الصغير المتصل بمضخة بيكو الهوائية.
اضبط زاوية الحقن على حوالي 45 درجة بحيث تحتاج الإبرة فقط إلى تحريكها في اتجاه مسوي واحد. بعد ذلك ، قم بتعيين قيم الحاقن الصغير على النحو التالي ، ضغط تعليق يبلغ 20 رطلا لكل بوصة مربعة أو PSI ، وضغط طرد يبلغ 15 PSIA 100 مللي ثانية من البوابات وقيمة الفترة 1.9 ، والتي تتوافق مع 10.9 مللي ثانية. قم بإعداد 20 مل من 1.5٪ من الأروس المذاب في XPBS واحد واسكبه في طبق بتري 10 سم.
ثم ضع قالب حقن محزز في الحمض الدافئ لتشكيل أخاديد في الجل المتصلب لتخدير اليرقات. ضعها في 100 مل من ماء الحوض مع 20 ملليغرام لكل لتر من التريكان. بعد أن يتوقفوا عن الاستجابة للمس ، استخدم ماصة بلاستيكية رعوية لنقل اليرقة بعناية إلى أخدود من قالب الأروس الرطب بحيث يكون الجانب البطني مواجها لجدار الأروس الرأسي للأخدود.
ضع صفيحة aros تحت المجهر الاستريو بحيث يكون البطين متجها بعيدا عن إبرة الحقن. بعد ذلك ، اخفض الإبرة وأدخلها حوالي ميكرومتر إلى ميكرومتر في بطين القلب. مع الحرص على عدم إدخاله بعمق.
ثم قم بحقن نبضة ثلاثة نانولتر من محلول مورفو في البطين والوزن للسماح بتطهير القلب قبل التكرار بخمس نبضات أخرى بعد الحقن ، قم بإزالة الإبرة ووضعها في طبق بتري يحتوي على XPBS لمنع الجفاف. ثم باستخدام ماصة نقل مملوءة ب E ثلاثة وسط ، انقل اليرقات بعناية مرة أخرى إلى طبق بتري يحتوي على E ثلاثة متوسطات طازجة لضمان امتصاص وصيانة المورفو في الخلايا. كرر الحقن كل 12 إلى 24 ساعة طوال مدة التجربة لتقييم الحقن.
بعد تخدير الأسماك ، ضعها على طبق مسطح مبلل مغطى ب E ثلاثة وسط قبل استخدام مجهر استريو مع مجال ساطع ومضان لتصويرها. قم بتحليل الصور للتجديد باستخدام برنامج Fiji Image J المجاني لاستخدام أداة تتبع الخط لتحديد مقدار النمو المتجدد الذي حدث. أولا ، قم بمعايرة الصور عن طريق سحب ملف وإفلاته في نافذة فيجي الرئيسية في القائمة الرئيسية.
قم بتعيين مقياس جميع الصور بالنقر فوق تحليل في القائمة المنسدلة. انقر على تعيين المقياس، ثم قم بتشغيل الخيار العام بالنقر فوق خانة الاختيار. الآن قم بسحب الصورة وإفلاتها مرة أخرى لقياس مقدار النمو المتجدد في شريط الأدوات.
اختر أداة التحديدات اليدوية وقم بتطويق المنطقة المراد قياسها. أخيرا ، اضغط على Ctrl M.سيؤدي هذا إلى فتح نافذة نتائج جديدة تعرض قيمة المنطقة المحيطة بالبكسل المربع. كما هو موضح هنا في غضون دقائق من الحقن ، يوزع محلول مورفو إندو بورتر في جميع أنحاء الأوعية الدموية في أنسجة مختلفة مثل طية الزعنفة والدماغ لمدة 12 ساعة على الأقل أو أكثر.
لتقييم تجديد هياكل زعانف اليرقات البعيدة ، تمت إزالة ما يلي ، الطرف البعيد لطية الزعنفة والحبل الشوكي ، والحبل البعيد ، وعضلة الجذع البعيدة ، والتي لا يمكن رؤيتها هنا ، والخلايا الصبغية ، التي يصعب استهدافها عن طريق الحقن المباشر ، ولكن يبدو أنها تدمج مورفو بعد الحقن البطيني التسلسلي. وبالتالي ، فإن هذه الطريقة تعزز بسهولة نسبيا توصيل المورفو إلى الأنسجة التي يصعب استهدافها بشكل فردي ، وتسمح بتقييم وظيفة الجينات في العديد من الأنسجة في الزعنفة المتجددة في وقت واحد. لتحليل أهمية جينات معينة تشارك في التجديد ، يتم بتر زعنفة اليرقات جزئيا ، ويتم استئصال جميع الأنسجة التي أدرجت المورفو.
تجدد طية زعنفة اليرقات هيكلها في غضون أيام قليلة بعد البتر كما هو موضح. هنا ، يستهدف مورفو الجينات المطلوبة للتجديد ، مما أدى إلى اضطراب استجابة التجديد مقارنة بعناصر التحكم في مورفو المحقون وعدم التطابق بعد تطويره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التجديد لاستكشاف الآليات الجزيئية التي تشارك في تجديد زعنفة أسماك الحمار الوحشي.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
تقدم هذه المقالة طريقة جينية عكسية لسميد البحر تسمح للباحثين بتقييم وظيفة الجين خلال المراحل اللاحقة من التطور والعمليات الفسيولوجية مثل تجديد الأنسجة. تتضمن الطريقة حقن مورفولينوس محددة للجينات داخل البطين لتقليل جينات الهدف.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء النمائي
- الطب التجديدي
الخلفية
- تعد أسماك الزرد كائنًا حيًا نموذجيًا قيمًا لدراسة وظيفة الجين.
- يمكن لمورفولينوس محددة للجينات أن تقلل بشكل فعال من تعبير الجين.
- تجديد الأنسجة هو مجال بحث حاسم في علم الأحياء النمائي.
- تسمح الحقن داخل البطين بتسليم مورفولينوس بدقة.
غرض الدراسة
- لتقييم دور جينات معينة في تجديد الأنسجة.
- لتطوير طريقة موثوقة لتقليل تعبير الجين في أسماك الزرد.
- لتعزيز فهم وظيفة الجين خلال المراحل اللاحقة من التطور.
الطرق المستخدمة
- تخدير يرقانات سميد البحر.
- حقن محاليل المورفولينوس في بطانة القلب.
- إجراء حقن متعددة مع فترات زمنية لتصريف القلب.
- بتر الزعنفة الخلفية ومراقبة تجديدها على مدار ثلاثة أيام.
النتائج الرئيسية
- نجحت الطريقة في تسليم المورفولينوس إلى الجينات المستهدفة.
- تم تقييم تجديد الزعنفة الخلفية باستخدام تحليل الصور في برنامج Fiji.
- تم تحديد تأثيرات تقليل تعبير الجين على تجديد الزعنفة.
- توفر الطريقة رؤى حول وظيفة الجين خلال تجديد الأنسجة.
الاستنتاجات
- تعد هذه الطريقة أداة قيمة لدراسة وظيفة الجين في سميد البحر.
- يمكن تطبيقها على مختلف الجينات المشاركة في التجديد.
- تسهم النتائج في فهم علم الأحياء النمائي.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This method addresses a critical gap in zebrafish research by enabling temporal control of gene knockdown in post-embryonic larvae, particularly in tissues refractory to direct injection such as the caudal fin. It supports mechanistic de-risking in regeneration studies by allowing rapid assessment of gene function in physiologically relevant, regenerating tissues. The approach enhances predictive confidence in target validation by linking larval finfold regeneration pathways to those active in adult vertebrate tissue repair.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in regeneration pathways by knocking down genes in multiple tissues simultaneously.
- Operational Value: Provides a dispersion-based delivery system that overcomes limitations of tissue inaccessibility in larval models.
- Predictive Value: Supports target confidence assessment by correlating morpholino-induced phenotypes with regeneration defects in distal fin structures.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable phenotypic readouts via Fiji-based area measurement of regenerating fin tissue.
- Operational Value: Establishes a standardized, reproducible workflow for serial ventricular injections and regeneration tracking over three days.
- Assay Readiness: Produces dispersed morpholino delivery detectable in vasculature and target tissues including fin fold, brain, spinal cord, trunk muscle, and pigment cells.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Leverages zebrafish larval finfold as a disease-relevant system for studying genes conserved in adult vertebrate regeneration.
- Mechanistic De-risking: Allows evaluation of gene function in tissue homeostasis and regeneration post-embryogenesis, informing preclinical target selection.
- Continuity of Evidence: Connects larval phenotypic outcomes to potential roles in human tissue repair mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology to lead identification continuum by enabling functional genomics in a regenerating, physiologically complex larval system prior to mammalian preclinical work.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target validation in regeneration-associated genes through temporal knockdown in larvae.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with standardized morpholino uptake across multiple tissue types.
- Analytics: Enables quantitative comparison of regenerative growth via image analysis, facilitating condition-to-condition comparisons.
- Translational Research: Links larval finfold regeneration to adult vertebrate tissue repair through conserved genetic pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for temporal gene interrogation in zebrafish larvae across multiple regeneration studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in gene function studies by enabling knockdown in previously inaccessible larval tissues.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized injection protocols, heart-clearing intervals, and regeneration timelines.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in target validation by providing early phenotypic data on regeneration-critical genes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on functional evidence in a physiologically relevant regeneration model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish larval handling, microinjection, and anesthesia using tricaine.
- Dependent on specialized instrumentation including pneumatic pico pumps, micro manipulators, and stereoscopes with micrometer eyepieces.
- Necessitates standardized preparation of morpholino-endo Porter solutions and agarose molds for consistent larval positioning.
- Involves adaptation considerations for different tissue targets based on morpholino dispersion kinetics and clearance intervals.
- Limited by the need for repeated injections every 12–24 hours to maintain knockdown during regeneration experiments.
![Microinjection من مرنا والعقاقير [أليغنوكليوتيد] Morpholino اسماك الزرد في الأجنة.](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F1113.jpg%3Fv%3D2026-07-07T10%253A56%253A25.171Z&w=384&q=75)
![المجهرية من التعبير الجيني في الدماغ اسماك الزرد الكبار عن طريق حقن مكروي Cerebroventricular [أليغنوكليوتيد] Morpholino](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F50415.jpg%3Fv%3D2026-07-03T02%253A35%253A06.000Z&w=384&q=75)
