Name: تشريح وتحليل المصب من زيبرا فينش الأجنة في المراحل الأولى من التطوير (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: تعلم تقنية تشريح أجنة عصفور زيبرا فينش في مراحلها التطويرية الأولى بأقل ضرر ممكن للأنسجة. تتيح هذه الطريقة إجراء تحاليل التعبير الجيني ودراسات السمية باستخدام Taeniopygia guttata.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

المؤلفين أشكر مصادر تمويلها، هوارد برنامج التعليم المرحلة الجامعية علوم معهد هيوز الطبي في كلية وليام وماري؛ الراعي المنحة: المعاهد الوطنية للصحة (MSS)؛ عدد المنح: R15NS067566. كما يعترفون بدعم من كلية وليام وماري، قسم الأحياء وكلية الآداب والعلوم للحصول على المساعدة مع رعاية الحيوان.

<ol><li>Eng, M. L., Elliott, J. E., MacDougall-Shackleton, S. A., Letcher, R. J., Williams, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+exposure+to+2%2C2%27%2C4%2C4%27%2C5-pentabromodiphenyl+ether+%28BDE-99%29+affects+mating+behavior+of+zebra+finches%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Early exposure to 2,2',4,4',5-pentabromodiphenyl ether (BDE-99) affects mating behavior of zebra finches.</a> Toxicol Sci. 127, 269-276 (2012).</li>
<li>Winter, V., Elliott, J. E., Letcher, R. J., Williams, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+an+egg-injection+method+for+embryotoxicity+studies+in+a+small%2C+model+songbird%2C+the+zebra+finch+%28Taeniopygia+guttata%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Validation of an egg-injection method for embryotoxicity studies in a small, model songbird, the zebra finch (Taeniopygia guttata).</a> Chemosphere. 90, 125-131 (2013).</li>
<li>Maney, D. L., Goodson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenomic+mechanisms+of+aggression+in+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Neurogenomic mechanisms of aggression in songbirds.</a> Adv Genet. 75, 83-119 (2011).</li>
<li>Kirn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+of+neurogenesis+and+growth+of+brain+regions+to+song+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+and+Language%22%5BJournal%5D)">The relationship of neurogenesis and growth of brain regions to song learning.</a> Brain and Language. 115, 29-44 (2010).</li>
<li>Fisher, S. E., Scharff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXP2+as+a+molecular+window+into+speech+and+language%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">FOXP2 as a molecular window into speech and language.</a> Trends in Genetics. 25, 166-167 (2009).</li>
<li>Tokarev, K., Tiunova, A., Scharff, C., Anokhin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+for+Song%3A+Expression+of+C-Fos+and+ZENK+in+the+Zebra+Finch+Song+Nuclei+during+Food+Aversion+Learning%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Food for Song: Expression of C-Fos and ZENK in the Zebra Finch Song Nuclei during Food Aversion Learning.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Vargha-Khadem, F., Gadian, D. G., Copp, A., Mishkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXP2+and+the+neuroanatomy+of+speech+and+language%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FOXP2 and the neuroanatomy of speech and language.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 131-138 (2005).</li>
<li>Schulz, S. B., Haesler, S., Scharff, C., Rochefort, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+FoxP2+alters+spine+density+in+Area+X+of+the+zebra+finch%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Knockdown of FoxP2 alters spine density in Area X of the zebra finch.</a> Genes, Brain and Behavior. 9, 732-740 (2010).</li>
<li>Jarvis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+brains+and+a+new+understanding+of+vertebrate+brain+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 151-159 (2005).</li>
<li>Brainard, M. S., Doupe, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+birdsong%3A+songbirds+as+a+model+for+basic+applied+medical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Translating birdsong: songbirds as a model for basic applied medical research.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 489-517 (2013).</li>
<li>Mayer, U., Watanabe, S., Bischof, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+memory+and+the+avian+hippocampus%3A+Research+in+zebra+finches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Spatial memory and the avian hippocampus: Research in zebra finches.</a> J Physiol Paris. , (2012).</li>
<li>Warren, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+a+songbird%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genome of a songbird.</a> Nature. 464, 757-762 (2010).</li>
<li>Agate, R. J., Scott, B., Haripal, B., Lois, C., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+songbirds+offer+an+opportunity+to+develop+a+genetic+model+for+vocal+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Transgenic songbirds offer an opportunity to develop a genetic model for vocal learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17963-17967 (2009).</li>
<li>Birkhead, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+incubation+and+early+hatching+in+brood+parasitic+birds%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Internal incubation and early hatching in brood parasitic birds.</a> Proceedings of the Royal Society Biological Sciences. 278, 1019-1024 (2011).</li>
<li>Haesler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP2+expression+in+avian+vocal+learners+and+non-learners%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners.</a> J Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).</li>
<li>Godsave, S. F., Lohmann, R., Vloet, R. P. M., Gahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+receptors+in+the+embryonic+zebra+finch+hindbrain+suggest+a+function+for+maternal+androgens+in+perihatchingsurvival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Androgen receptors in the embryonic zebra finch hindbrain suggest a function for maternal androgens in perihatchingsurvival.</a> Journal of Comparative Neurology. 453, 57-70 (2002).</li>
<li>Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick%3B+a+great+model+system+becomes+even+greater%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The chick; a great model system becomes even greater.</a> Dev Cell. 8, 9-17 (2005).</li>
<li>Kuenzel, W. J., Medina, L., Csillag, A., Perkel, D. J., Reiner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+avian+subpallium%3A+new+insights+into+structural+and+functional+subdivisions+occupying+the+lateral+subpallial+wall+and+their+embryological+origins%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The avian subpallium: new insights into structural and functional subdivisions occupying the lateral subpallial wall and their embryological origins.</a> Brain Research. 1424, 67-101 (2011).</li>
<li>Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+chicken+embryology+to+the+understanding+of+vertebrate+limb+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development.</a> Mech Dev. 121, 1019-1029 (2004).</li>
<li>Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rediscovering+the+chick+embryo+as+a+model+to+study+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development.</a> Neural Development. 7, (2012).</li>
<li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenet Genome Research. 117, 231-239 (2007).</li>
<li>Murray, J. R., Varian-Ramos, C. W., Welch, Z. S., Saha, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryological+staging+of+the+zebra+finch%2C+Taeniopygia+guttata%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Embryological staging of the zebra finch, Taeniopygia guttata.</a> J Morphol. , (2013).</li>
<li>Hawkins, P., Morton, D. B., Cameron, D., Cuthill, I., Francis, R., Freire, R., Gosler, A., Healy, S., Hudson, A., Inglis, I., Jones, A., Kirkwood, J., Lawton, M., Monaghan, P., Sherwin, C., Townsend, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+birds%3A+refinements+in+husbandry+and+procedures.+Fifth+report+of+BVAAWF%2FFRAME+%2FRSPCA%2FUFAW+Joint+Working+Group+on+Refinement%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Laboratory birds: refinements in husbandry and procedures. Fifth report of BVAAWF/FRAME /RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement.</a> Lab Anim. , (2001).</li>
<li>Pearse II, R. V., Esshaki, D., Tabin, C. J., Murray, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+analysis+of+intra-+and+extraarticular+connective+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression analysis of intra- and extraarticular connective tissue.</a> Journal of Orthopaedic Research. 27, 427-434 (2009).</li>
<li>Pizard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+in+situ+hybridization+and+detection+of+RNAs+in+vertebrate+embryos+and+isolated+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 66, (2004).</li>
<li>Warren, M., Puskarczyk, K., Chapman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+embryo+proliferation+studies+using+EdUlabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Chick embryo proliferation studies using EdUlabeling.</a> Developmental Dynamics. 238, 944-949 (2009).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+syntesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA syntesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 105, 2415-2420 (2008).</li>
<li>Hoogesteijn, A. L., DeVoogd, T. J., Quimby, F. W., De Caprio, T., Kollias, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+impairment+in+zebra+finches+%28Taeinopygia+guttata%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reproductive impairment in zebra finches (Taeinopygia guttata).</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 24, 219-223 (2005).</li>
<li>Winter, V., Williams, T. D., Elliott, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-generational+study+of+In+ovo+exposure+to+PBDE-99+in+the+zebra+finch%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A three-generational study of In ovo exposure to PBDE-99 in the zebra finch.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 32, 562-568 (2013).</li>
<li>Kitulagodage, M., Buttemer, W. A., Astheimer, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adverse+effects+of+fipronil+on+avian+reproduction+and+development%3A+maternal+transfer+of+fipronil+to+eggs+in+zebra+finch+Taeinopygia+guttata+and+in+ovo+exposure+in+chickens+Gallus+domesticus%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">Adverse effects of fipronil on avian reproduction and development: maternal transfer of fipronil to eggs in zebra finch Taeinopygia guttata and in ovo exposure in chickens Gallus domesticus.</a> Ecotoxicology. 20, 653-660 (2011).</li>
<li>Hallinger, K. K., Zabransky, D. J., Kazmer, K. A., Cristol, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birdsong+differs+between+mercury-polluted+and+reference+sites%5BTitle%5D)+AND+%22The+Auk%22%5BJournal%5D)">Birdsong differs between mercury-polluted and reference sites.</a> The Auk. 127, 156-161 (2010).</li>
<li>Chen, C. C., Wada, K., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioactive+in+situ+Hybridization+for+Detecting+Diverse+Gene+Expression+Patterns+in+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2012).</li>
<li>Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+Avian+Brain+Chimeras+Reveal+That+Large+Brain+Size+Differences+Are+Influenced+by+Cell%E2%80%93Interdependent+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Interspecies Avian Brain Chimeras Reveal That Large Brain Size Differences Are Influenced by Cell–Interdependent Processes.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Chen, C. C., Winkler, C. M., Pfenning, A. R., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+the+developing+avian+telencephalon%3A+Regional+timing+and+brain+subdivision+continuities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of the developing avian telencephalon: Regional timing and brain subdivision continuities.</a> The Journal of Comparative Neurology. 521, 3666-3701 (2013).</li>
</ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

التطورات الأخيرة في دليل التدريج الجنينية 22 والجينوم الشرح جعل فينش حمار وحشي كائن النموذج المرغوب فيه للدراسات التنموية. ومع ذلك، فإن صغر الحجم والهشاشة من الأجنة حمار وحشي فينش، والتي تتراوح من 3 إلى 7 ملم في مراحل 1 - 10 22، يمكن أن تجعل من الصعب تشريح 11 و 14. يمكن تحديد موقع وإزالة نظيفة الأجنة من سطح الصفار أن يكون تحديا. يوفر هذا البروتوكول تفاصيل كافية لتنفيذ الإجراء مع سهولة. هذا البروتوكول يوضح الخطوات الحاسمة التي لا تعرف عادة، ولكنها ضرورية لضمان تشريح ناجحة. على سبيل المثال، فمن الضروري أن تترك طبقة صغيرة من صفار بين الجنين ورقة من الورق تزن لمنع الالتصاق. كل من تحديد وإزالة الجنين يمكن أن يكون صعبا. لاستكشاف وتحديد الجنين على سطح الصفار، وتألق الضوء مباشرة فوق صفار البيض بعد أن لديهأزيلت من البيض، وإلقاء نظرة على صفار في زاوية 45 درجة إلى العثور على الجنين. مرة واحدة ويقع الجنين، وقطع صفار على وزن الورق مع الحرص على عدم المسيل للدموع الجنين. إذا تشمل المزيد من تطبيقات التصوير الاختلافات التشريحية، التهجين في الموقع، أو المقايسات تكاثر الخلايا، فمن المهم لإزالة الغشاء المحي في مرحلة 1-8 (22) لتصور أفضل للهياكل. إذا تواجه صعوبات عند إزالة صفار البيض أو الغشاء المحي في المراحل المبكرة، وتحديد الجنين في PFA 4٪ قبل غسله في برنامج تلفزيوني 1X للحد من هشاشة الجنينية. الأولى عن طريق إزالة الغشاء المحي أثناء تشريح كما هو موضح، وهياكل واضحة للعيان وسليمة في الأجنة فينش حمار وحشي بعد إجراء عملية التهجين في الموقع. وجود قيود على EDU هو أن إدارة كميات الجرعة أكثر من 478 NL يؤدي إلى الوفاة الجنينية. ومع ذلك، فإن مجموعة الجرعة العظمى يسمح varyinمستويات غرام من علامات الخلية التكاثري. و&quot;فوق&quot; رد فعل المستخدمة في هذه المجموعة هو النحاس (I) حفزت-آلكاين أزيد-إضافة حلقية (النحاس (I) AAC). في هذا ردة فعل معينة، يتم تضمينها جزيء ثيميدين التماثلية التي تحتوي على آلكاين (EDU) عن طريق قسمة بنشاط الخلايا. المجموعة آلكاين في EDU يبرز من بنية حلزونية من الحمض النووي، ويتم الكشف عن التعرض لجزيء أزيد مترافق إلى الأخضر، الذي يربط جزيء نيون إلى مجموعة آلكاين الحرة. مضان أخضر يدل على الخلايا المتكاثرة حديثا في الجنين. للالتعامد الحيوي من أزيد والمجموعات آلكاين يمنع تلطيخ غير محددة لأن هذه الأنواع رد الفعل ليست موجودة بشكل طبيعي في الكائنات الحية. أيضا، وذلك لأن الحمض النووي لا بد من التشويه والتحريف من أجل رد الفعل أن تحدث، ويمكن إجراء مزيد من التحليل المعتمدة على الحمض النووي يكون من السهل تنفيذها 27. بقصور هذا الأسلوب هو الحجم الصغير وفرجility من حمار وحشي فينش الأجنة. إزالة الغشاء المحي من الأجنة مراحل 1 - 15 22 يمكن أن يؤدي إلى هياكل الجنينية مدمرة إذا لم يتم تنفيذ بحذر. ومع ذلك، هذا البروتوكول يبسط طريقة تشريح، مما يسمح للمحققين لاستخدام المراحل الجنينية المبكرة لدراسة التشوهات الهيكلية والتعبير الجيني التي لم يتم دراستها سابقا في العمق. هذا البروتوكول يفتح الطريق أمام مجموعة كبيرة من المقايسات الخلوية الجزيئية التي من شأنها أن تسمح للمحققين لتحديد أصول التنموية من الظواهر الكبار. على سبيل المثال، سيكون من الممكن لدراسة التعبير الجيني المتورطين في التعلم صخبا تحت ظروف بيئية مختلفة أو بعد العلاجات الدوائية في المراحل الأولى من التطوير 28، 29،30،31. وإن لم يكن هو موضح في هذه الورقة، وهذه الطريقة يمكن أن تكون يسمح لإجراءات أخرى مثل المشعة التهجين في الموقع على حمار وحشي فينش أقسام الأنسجة و electroporation / في اوفس 32 عملية جراحية، 33،34. بالنظر إلى أن تم تأسيس فينش حمار وحشي كما كائن نموذجا هاما ضمن هيئة واسعة من المؤلفات، وتوفير مثل هذه الدراسات الفرص غير المستغلة لربط الآليات التنموية مع علم وظائف الأعضاء والسلوك الكبار، ولا سيما تطور اللغة 7 و 9.

الهدف العام من هذه التقنية هو الحصول على حمار وحشي فينش (Taeniopygia الرقشاء) الأجنة منذ المراحل الأولى من التطور الجنيني للاستخدام في مجموعة واسعة من الدراسات التنموية. أصبحت حمار وحشي فينش السائد نموذج مطربة الحي واستخدمت على نطاق واسع في مجموعة متنوعة من المجالات، بما في ذلك علم السموم 1،2، 3 السلوك والذاكرة والتعلم 4،5،6، 7،8 مقارنة التشريح العصبي، وتطوير اللغة 9،10 . كما مطربة فقط مع الجينوم التسلسل، وحمار وحشي فينش يسمح الدراسة الجزيئية والجينية من أجل Passeriformes، وهو ما يمثل أكثر من 50٪ من أنواع الطيور المعروفة 11، 12،13. على الرغم من استخدام الكبار والأحداث حمار وحشي فينش في مجموعة متنوعة من المجالات، وقد أجريت دراسات قليلة على الأجنة حمار وحشي فينش، وخصوصا خلال المراحل الأولى من التنمية. ويمكن أن يعزى ذلك إلى صغر حجم بيضها والثانية الأجنة، وضعهم أحدث كنموذج حي 14،15،16 للدراسات التي الدجاج (الداجن جالوس جالوس) كان يستخدم سابقا بمثابة نموذج 17،18،19،20،21 نظام السائد. لكن، وكما المتعلمين غير الصوتية، والدجاج ليست نظاما نموذج مناسب لدراسة الأساس الجيني للتعليم الصوتية، وتطوير التعلم الصوتية، والتوريث، والسلوك، والعقد القاعدية الدوائر-القشرية الحركية المشاركة في التعلم 10. من المهم أن نلاحظ أن الأجنة حمار وحشي فينش هي أكثر حساسية التالفة بكثير وأكثر سهولة من خلال تشريح افراخ الدجاج والإجراءات الجزيئية. على وجه الخصوص، الأمر يتطلب عناية أكبر عند تنفيذ الخطوات permeabilization على حمار وحشي فينش الأجنة. يمكن المنظفات والإنزيمات القوية التي لن تضر الجنين الفرخ يضر الأجنة فينش حمار وحشي. من حيث الرعاية العامة، فمن الضروري وضع البيض حمار وحشي فينش في أكواب صغيرة قبل وضعه في حاضنةلمنعهم من كسر عندما المتداول خلال الحضانة. حمار وحشي فينش قابلة للدراسات السلوكية، بسهولة وبغزارة تولد على مدار السنة في الأسر، ويتعلمون الصوتية. هذه الخصائص تسمح باستخدام حمار وحشي فينش لتلبية الحاجة إلى كائن النموذج الذي يجمع بين التنمية، وعلم الوراثة، والجوانب السلوكية للغة. أساليب تشريح مفصل أدناه، جنبا إلى جنب مع دليل التدريج وضعت مؤخرا محددة لحمار وحشي فينش 22، وجعل فينش حمار وحشي ومفيدة على نحو متزايد موحدة نموذج التنموية الحي. ومع ذلك، والحصول على أجنة في مراحل مبكرة يمكن ان تكون شاقة. هذا البروتوكول يسمح للمحققين بسهولة الحصول على الأجنة في مرحلة مبكرة. دراسات التحقيق في التنمية في وقت مبكر والأساس الجزيئي للالتنموية السلوكيات المعقدة في حمار وحشي فينش، أو الآثار السمية على التنمية في الأخرى الصغيرة، وسوف تجد الطيور الجواثم منهجية تشريح هذا مفيد.

<table><tbody><tr><td>حاضنة</td><td></td><td></td> بيض الدجاج <td>نستخدم حاضنة نافذة الصور Hova-Bator ، نموذج الهواء المتداول &nbsp ؛ &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10337</td><td>الكشف عن تكاثر الخلايا.</td></tr><tr><td>مجهر تشريح&nbsp;</td><td></td><td></td><td>نحن نستخدم Olympus SZ61</td></tr><tr><td>7 '' Drummond الشعرية لحاقن Nanoject II</td><td>Drummond</td><td>3-00-203-G / X</td><td></td></tr><tr><td>Drummond Nanoject II microinjector</td><td>Drummond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont Tweezers # 55</td> World <td>Precision Instruments</td><td>14099</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (EtOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>50 مل أنبوب فالكون (بولي بروبيلين)</td> <td>فيشر علمي</td><td>06-443-18&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep Lysis Matrix H tubes</td><td>MP biomedicals</td><td>6917-100</td><td>تستخدم لاستخراج الحمض النووي الريبي ، وتستخدم لتجانس الأجنة</td></tr><tr><td>مصابيح إضاءة الألياف البصرية (إضاءة عالية الكثافة)</td> <td>Dolan-Jenner Industries&nbsp;</td><td>الألياف الخفيفة MI-150 &nbsp ؛</td><td></td></tr><tr><td>قوارير زجاجية مع غطاء لولبي (معالج ب DEPC)</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>03-338A</td><td></td></tr><tr><td>أنبوب EPPE للطرد المركزي الدقيق (1.5 مل)</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>الزيوت المعدنية</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8410</td><td></td></tr><tr><td>النمذجة الطين</td><td></td><td></td><td>أي علامة تجارية</td></tr><tr><td>Narshige PB-7 مجتذب إبرة</td><td>Narshige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omni Bead الخالط Ruptor</td><td>OMNI International</td><td>19-010</td><td>يستخدم لاستخراج الحمض النووي الريبي</td></tr><tr><td>4٪ بارافورمالدهيد (4٪ PFA): 20 مل 8٪ PFA (32 جم بارافورمالدهيد ، 350 مل SDD H2O ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.6 ، 400 مل SDD H2O) ، 20 مل 2x PBS</td><td>تثبيت الأجنة. الحذر ، ضار ولا تستنشق.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>محلول ملحي مخزن بالفوسفات (1x PBS): 200 مل 10x PBS ، 1,800 مل Barnstead H2O ، اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>محلول ملحي مخزن بالفوسفات (10x PBS): 800 مل بارنستيد ، 2.013 جم KCL ، 80.063 جم كلوريد الصوديوم ، 2.722 جم كيلو هيلوسنة < >2 < / فرعي > < >4 < / فرعي > أحادي القاعدة ، 14.196 جم Na2HPO4 ثنائي القاعدة ، 200 مل Barnstead H2O ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 6.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>محلول ملحي مخزن بالفوسفات مع 0.1٪ Tween-20 (1x PTw): 1،800 مل Barnstead H2O ، 200 مل 10x PBS ، ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 ، 2 مل Tween-20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 مل طبق بتري بلاستيكي &nbsp ؛</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>غلاف</td><td></td><td></td> بلاستيكي <td>أي علامة تجارية</td></tr><tr><td>Prepease RNA Spin Kit</td><td>PrepEase ، Affymetrix</td><td>78766 1 KT</td><td>تستخدم لاستخراج الحمض النووي الريبي ، وتستخدم لتجانس الأجنة</td></tr><tr><td>مزيج التفاعل: 875 & mu ؛ ل 1xPBS ، 100 ملم 20 مو ؛ ل CuSO4 (المكون Pack E) ، 5 & mu ؛ ل أليكسا فلور 488 أزيد (مكون المجموعة ب) ، 100 مو ؛ ل مادة مضافة عازلة للتفاعل المخفف (مكون Kit F)</td> <td>Invitrogen</td><td>C10337</td><td>الكشف عن تكاثر الخلايا.</td></tr><tr><td>sdd H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>كأس البذرة&nbsp;</td><td></td><td></td><td>نستخدمه كحاوية عند احتضان البيض</td></tr><tr><td>مشرط من الفولاذ المقاوم للصدأ &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>صندوق</td><td></td><td></td> عش قياسي نستخدم عشب <td>العنق البلاستيكي Abba</td></tr><tr><td>4 مل ، غطاء مبطن بالتفلون ، قوارير زجاجية</td><td>فيشر Scientific</td><td>02-912-352</td><td></td></tr><tr><td>ماصات نقل (بولي إيثيلين) فيشر</td> <td>ساینتفيك</td><td>13-711-7M & nbsp ؛</td><td></td></tr><tr><td>4 × 4 ورق وزن</td><td>فيشر Scientific</td><td>09-898-12B</td><td></td></tr></tbody></table>

تشريح وتحليل المصب من زيبرا فينش الأجنة في المراحل الأولى من التطوير

Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development

أصبح فينش حمار وحشي (Taeniopygia الرقشاء) كائن نموذجا متزايد الأهمية في العديد من مجالات البحوث بما في ذلك علم السموم 1، 2، 3 السلوك، والذاكرة والتعلم 4،5،6. كما مطربة فقط مع الجينوم التسلسل، وفينش حمار وحشي لديها امكانات كبيرة لاستخدامها في الدراسات التنموية؛ ومع ذلك، فإن المراحل الأولى من التنمية فينش حمار وحشي لم يتم دراستها جيدا. ويمكن أن يعزى عدم وجود بحوث في مجال التنمية فينش حمار وحشي لصعوبة تشريح البيضة الصغيرة والجنين. طريقة تشريح التالية يقلل من تلف الأنسجة الجنينية، والذي يسمح للتحقيق في التشكل والتعبير الجيني في جميع مراحل التطور الجنيني. هذا يسمح كل من حقل مشرق والتصوير مضان نوعية الأجنة، استخدم في إجراءات الجزيئية مثل الموقع التهجين (ISH)، المقايسات تكاثر الخلايا، واستخراج الحمض النووي الريبي لفحوصات الكمي مثل الجرمية الكمي فيL-PCR الوقت (qtRT-PCR). يسمح هذا الأسلوب المحققين لدراسة المراحل الأولى من التنمية التي كان من الصعب الوصول إليها سابقا.

الخطوات تخطيطي في الشكل 1 تشير إلى ظهور الجنين بينما تعلق على الغشاء المحي (A) وشرح الطريقة الصحيحة لفصل الجنين من صفار البيض (B). يمكن التعرف على الجنين من منطقة مفرق، وهي أخف بكثير من الغشاء المحي. الجنين نفسه في كثير من الأحيان من الصعب التمييز حتى يتم قطع صفار بعيدا. مرة واحدة يتم تشريح الجنين من البيضة، ويمكن أن تكون ثابتة أو فلاش المجمدة لاستخدامها في المستقبل. إذا كان التهجين في الموقع ومن المخطط لتشريح الجنين، فمن الضروري إزالة الغشاء المحي التي انضمت إلى الجنين عبر منطقة مفرق الشكل 2 يوضح الرؤية المحسنة من الجنين مرة واحدة تتم إزالة هذا الغشاء (C)، والطريقة الصحيحة لقشر الغشاء المحي (A، B). بعد تشريح والتثبيت، جبل بأكمله في الموقع التهجين أجريت كما رأينا في الشكل 3 (A، A &#39;، B، B&#39;) والشكل (4) (A، A&#39;، B، B &#39;) والشكل (5) (A، B، C) للكشف عن الاختلافات في orthodenticle homeobox 2 (Otx2) التعبير في الأجنة تتعرض تنمويا لجرعات منخفضة من ميثيل الزئبق. الشكل 5 يظهر نتائج التحقيق الشعور، وعدم التظاهر من الخلفية. في الشكل 4، على الرغم من تشريح من البيضة في نقطة الوقت نفسه، فإن الجنين يتعرض تنمويا لميثيل الزئبق (ميثيل الزئبق) تقدمت إلى مرحلة 5 22 (B، B &#39;)، في حين أن الجنين السيطرة المتقدمة لاستضافة 6 22 (A، A &#39;). تم جمع مجموعة من الأجنة تشريح ويظهر في الشكل 4 من العش والتي اتخذت من حاضنة في الأوقات نفسها. على الرغم من بعض الاختلاف الطبيعي موجود في التنمية، استنادا إلى بيانات تشريح السابقة، فمن غير المرجح أن التقلبات في درجات الحرارة في الحاضنة لن تؤدي سوى إلى 2.4 جزء في المليون الأجنة ميثيل الزئبق لتكون develo<html> تأخر pmentally. الاختلافات في مراحل توضح التغييرات في تكاثر الخلايا في الأجنة تتعرض تنمويا لميثيل الزئبق. قبل التشريح، تم حقن EDU في يوم 2 بيضة وسمح لاحتضان بين عشية وضحاها. بعد تشريح وتثبيت للمرحلة 16 22 الجنين، وتصور EDU باستخدام &quot;فوق&quot; الكيمياء، مما يسمح للكشف عن الخلايا المتكاثرة كما رأينا في الشكل 6 (A، B، C). من المهم أن ترصد بدقة نقاط الوقت عند وضع البيض في الحاضنة وخلال تشريح، والتعرض لميثيل الزئبق أو أداء الفحص EDU قد يعطل التقدم التنموي. تم إجراء أقرب حقن في اليوم 0، وهو اليوم من جمع كما هو محدد في الخطوة 1.3. وكان تشريح هذا الجنين في وقت لاحق ما يقرب من 38 ساعة (المرحلة 7 22). تم العثور على معدل البقاء على قيد الحياة إلى أن ما يقرب من 90٪ (بنفس معدل الأجنة السيطرة) طالما كان المبلغ الحقن تحت 478 NL. &quot;jove_content&quot;&gt; هذه المنهجية تشريح يسمح أيضا لاستخراج الحمض النووي الريبي جودة عالية. بعد تشريح المرحلة 16 22 الأجنة، أجريت عملية استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة مع عدم وجود التحسين المطلوبة، كما رأينا في الشكل 7. كان إزالة الغشاء المحي لا لزوم لها لاستخراج الحمض النووي الريبي في وقت لاحق والتطبيقات QRT-PCR. ملاحظة: يتم توجيه جميع الأرقام الجنين بحيث المناطق الأمامية والخلفية هي في الجزء العلوي والسفلي من الصور، على التوالي. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig1highres.jpg" /> الشكل 1. إجراء تشريح لتحديد الأجنة وحمار وحشي فينش، مراحل 1-10 22. تحديد موقع الجنين قبل المتداول بلطف صفار البيض حتى القرص الأبيض خافت هو واضح (A). مرة واحدة فييقع الجنين في وسط صفار البيض، يتم تشريح صفار البيض بطريقة تدريجية (B) حيث أول خفض يخفف من الضغط من الغشاء المحي (1) وتخفيضات لاحقة (2) الحدود في منطقة (ZJ) وهو تقاطع انضمت إلى الغشاء المحي. تمثل القضبان نطاق 1 مم. <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig2highres.jpg" /> الشكل 2. إزالة الغشاء المحي وضوح الهياكل الجنينية. بعد إزالة الجنين من صفار البيض، ومكان الجنين في طبق بتري تحتوي على 4٪ PFA. إذا كان التهجين في الموقع يحتاج إلى أن يؤديها، والرؤية من الهياكل الجنينية هو أمر ضروري ويمكن تحقيقه عن طريق إزالة الغشاء المحي (A). قبضة الغشاء المحي مع غرامة اضافية يميل ملقط وقشر بلطف بعيدا من الجنين من خلال التعامل مع الجنين مباشرة على حافة الأبعد، إذا لزم الأمر(B). إزالة الغشاء المحي يزيد ضوح الهياكل الجنينية، ويسمح ليمكن تصوير الأجنة أو معالجتها مع الموقع التهجين (C) في. تمثل القضبان نطاق 1 مم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51596/51596fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 3" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig3highres.jpg" /> الرقم 3. جبل الجامع في الموقع التهجين التي تجرى على الأجنة فينش حمار وحشي يتعرض تنمويا لميثيل الزئبق. أنماط التعبير من orthodenticle homeobox 2 (Otx2) تميزت في الأجنة تتعرض ل0.0 جزء في المليون ميثيل الزئبق (A، A &#39;) و 2.4 جزء في المليون ميثيل الزئبق (B، B &#39;) عن طريق اتباع نظام غذائي الوالدين. افعلRSAL (A) وبطني (A &#39;) التعبير عن Otx2 مرئيا في جميع أنحاء الدماغ المتوسط ​​والبصرية الحويصلات خلال مرحلة 12 22. تم تشريح الأجنة مجموعة العلاج عند نقطة الوقت نفسه، لكنه تأخر في النمو كما رأينا في الظهرية (B) وبطني (B &#39;) نظرا لهياكل الرأس، والتي هي سمة من مرحلة 11 22 المختصرات:. ميغابايت، الدماغ المتوسط؛ المرجع، الحويصلة البصرية. تمثل القضبان نطاق 1 مم. <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig4highres.jpg" /> الشكل 4. جبل الجامعة &#160; في الموقع &#160; إجراء التهجين على الأجنة حمار وحشي فينش يتعرض تنمويا لميثيل الزئبق. أنماط التعبير من orthodenticle homeobox 2 (Otx2) تميزت في المرحلة 6 22 امبري<html> السراج يتعرض ل0.0 جزء في المليون ميثيل الزئبق (A، A &#39;) والمرحلة 5 22 الأجنة تتعرض إلى 2.4 جزء في المليون ميثيل الزئبق (B، B&#39;) عن طريق اتباع نظام غذائي الوالدين. الاختصارات: صباحا، الحافة الأمامية من الأديم المتوسط؛ لا، الحبل الظهري، الأديم المتوسط ​​الحبل الظهري؛ بو، مقدم السلى، مسم الأريمة الأمامي؛ ملاحظة، خط بدائية 22. تمثل القضبان نطاق 1 مم. <img alt="الرقم 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig5highres.jpg" width="600" /> جبل الرقم 5. الجامع في الموقع &#160; إجراء التهجين على حمار وحشي فينش أجنة باستخدام الحس التحقيق. (A) المرحلة 5 22 الجنين. (B) المرحلة المبكرة 6 22 الجنين. (C) المرحلة 11 22 الجنين. تمثل القضبان نطاق 1 مم. 6 &quot;سرك =&quot; / files/ftp_upload/51596/51596fig6highres.jpg &quot;/&gt; الرقم 6. EDU التأسيس وبحماية المناخ دي في فينش حمار وحشي الأجنة. EDU &quot;فوق&quot; تم استخدام الكيمياء للكشف عن الخلايا المتكاثرة في مرحلة الجنين 16 22 (A، B، C). أدرج EDU في الحمض النووي في مكان ثيميدين 26 و 27 و تم الكشف عن استخدام بنقرة الكيمياء 27. انتشار غير واضحة للعيان في الحواف الجانبية للو somites، وtailbud. لوحة ويظهر انتشار تحدث حصرا في الخلفي من الجنين ويظهر أيضا الخلايا التكاثري الفردية. لوحة B يظهر مواقع التكاثري في الجنين كله. لوحة C يظهر في المنطقة الأمامية، ويظهر لل telencephalon التكاثري للغاية (الشركة المصرية للاتصالات) بمزيد من التفصيل. المختصرات: AF، أضعاف الذي يحيط بالجنين؛ بنك الإجارة الأول، forelimb برعم؛ HLB، hindlimb برعم؛ جنيه، عدسة حويصلة؛ مللي، الدماغ المتوسط؛ طن متري، الدماغ التالي؛ بمسانده، كوب البصرية؛ سنويا، البلعوم القوس؛ كيلومتر، الأديم المتوسط ​​الجسيدة؛ السل، tailbud؛ الشركة المصرية للاتصالات، الدماغ الانتهائي. تمثل القضبان نطاق 1 مم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51596/51596fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 7" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig7highres.jpg" /> تم تشريح الرقم 7. الجودة من الحمض النووي الريبي المستخرج من تشريح الأجنة حمار وحشي فينش. التحكم (0.0 جزء في المليون) و 1.2 جزء في المليون الأجنة المجمدة ميثيل الزئبق والفلاش كما هو موضح في الخطوة 3.8. يظهر كل حارة الحمض النووي الريبي المستخرج من اثنين من الأجنة المتجانس من كل مجموعة العلاج.

عصفور الحمار الوحشي (Taeniopygiaguttata) هو كائن حي نموذجي قيم ؛ ومع ذلك ، لم تتم دراسة المراحل المبكرة من تطور عصفور الحمار الوحشي على نطاق واسع. يصف البروتوكول كيفية تشريح الأجنة المبكرة للتطبيقات التنموية والجزيئية.

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) has become an increasingly important model organism in many areas of research including toxicology1,2, behavior3, and ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخراج أجنة عصفور الزيبرا السليمة في مراحل جنينية مبكرة جداً لاستخدامها في تطبيقات نمائية وجزيئية لاحقة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق قطع قشرة البيضة طولياً وتفريغ محتويات البيضة برفق على ورق WHE. بعد ذلك، يتم تحديد منطقة الاتصال (zone of junction) وقص المحّ المحيط بها، مع ترك الجنين سليماً.بعد ذلك، يتم نقل الجنين إلى طبق بتري وغسله قبل تثبيته أو تجميده السريع من أجل التحليل اللاحق. وأخيرًا، يتم إزالة الغشاء المحي من الجنين المثبت لزيادة وضوح التراكيب الجنينية. وفي النهاية، يُظهر التهجين المزدوج ومعالجة EDU في الشكل C التعبير الجيني والخلايا المتكاثرة على التوالي في المراحل الجنينية المبكرة لطائر zebra finch استجابةً للمعالجة بـ methylmercury.تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تقلل من تلف الأنسجة الجنينية إلى أدنى حد، مما يسمح بدراسة المورفولوجيا والتعبير الجيني خلال جميع مراحل النمو. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في علم الأحياء التطوري المقارن وعلم السموم، مثل تأثيرات السموم المختلفة على المراحل المبكرة من النمو.يعد العرض المرئي لهذه التقنية أمراً بالغ الأهمية، حيث يمكن أن يكون تحديد موقع وصلة zno وإزالة غشاء vilin أثناء عملية التشريح أمراً صعباً نظراً لأن البنى الجنينية المبكرة تكون هشّة ويصعب ملاحظتها. بعد جمع بيوض طائر zebra finch وتحضينها وفقاً للبروتوكول المكتوب، قم بتجهيز المواد التالية للتشريح: مشرط نظيف، ملقط دقيق الرأس، وملقطين فائقَي الدقة. ثلاث ماصات نقل، وواحد XPBS و 4%para formaldehyde.إذا كنت ستقوم بتثبيت الأجنة، فضع قطعة من الورق المموج مقاس 10 في 10 سنتيمتر على قاعدة مجهر التشريح لتوفير سطح نظيف غير ممتص لعملية التشريح. أخرج البيضة من الحاضنة في النقطة الزمنية المطلوبة كما هو محدد في دليل طائر Finch zebra. بعد ذلك، وباستخدام مصباح إضاءة بالألياف الضوئية، قم بفحص البيضة عن طريق إمساكها على طول محورها الرأسي وتسليط الضوء من خلالها لإضاءة الجزء الداخلي.ضع طرف الضوء خلف البيضة وحدد موقع الصفار والجنين النامي. بعد ذلك، ضع المشرط على الجانب المقابل للصفار، وبضغط خفيف، اقطع على طول البيضة من الطرف إلى القاعدة. قم بإزالة محتويات البيضة باستخدام الإبهام والسبابة لتطبيق ضغط بعناية على قاعدة طرف البيضة، أو باستخدام الملقط لفصل قشرة البيضة بلطف على طول القطع.افحص المح الصفاقي للبحث عن منطقة الالتحام البيضاء، والتي تظهر كحلقة بيضاء باهتة تحيط بالجنين النامي، واستخدم ملقطاً دقيق الرأس لتوجيه المح بحيث يكون الجنين في المركز لفصله عن الأنسجة خارج الجنينية. قم بثقب حواف المح لتخفيف الضغط، وأجرِ قطوعاً مفردة على طول قطر المح بمحاذاة القرص الجنيني.استمر في رسم خطوط قطرية حتى يتم فصل جزء المحّ الذي يحتوي على الجنين بنجاح. وباستخدام ماصة نقل، قم بإزالة حواف المحّ، مع ترك كمية صغيرة لتزييت الجنين فوق الورقة لمنعه من التمزق. اغسل القرص الجنيني بوضع طرف ماصة نقل تحتوي على 1x PBS بجانبه بزاوية 45 درجة مواجهة لأسفل الجنين، ثم قم بتوزيع المحلول المنظم باستخدام كمية صغيرة من 1x PBS.انقل الجنين إلى طبق بتري بلاستيكي صغير. اغسل الجنين بإضافة المزيد من محلول PBS إلى الطبق وتقطير PBS بالقرب من الجنين. قم بتدوير الطبق لغسله وإزالة بقايا المح. ثم قم بإمالة الطبق لسحب المحلول المنظم العادم. إذا كنت ستقوم بتثبيت الجنين لإجراء تهجين في الموقع (in situ hybridization) على الفور، أضف 4% PFA لغمر الجنين، ثم ضع الـ PFA مباشرة على الجنين لتسطيحه ومنعه من الانطواء. قم بالتحضين لمدة 12 ساعة عند درجة حرارة four degrees Celsius بعد تجفيف الجنين في سلسلة من الميثانول.إذا كان الجنين في إحدى المراحل من الأولى إلى الثامنة، قم بإزالة الغشاء المحي (vitel membrane) الملتصق بالجنين باستخدام ملقط دقيق للغاية للإمساك بحواف الغشاء الممتدة خارج منطقة الاتصال. اقلب الجنين بعناية عدة مرات لغسل حبيبات المح residual yolk granules المتبقية وفصل القرص الجنيني عن الغشاء المحي. وفي حال عدم ظهور فجوة بين منطقة الاتصال والغشاء المحي، استخدم ملقطاً دقيق الرأس لخدش منطقة الاتصال برفق لفصلها عن الغشاء.بعد ذلك، أمسك بغشاء الفيل والحافة المحيطية للقرص الجنيني عند منطقة الاتصال، واسحب غشاء الفيل برفق بعيداً عن الجنين. وفي حال التجميد السريع للجنين بعد التشريح، أضف بسرعة من 2 إلى 3 mL من محلول 1X PBS إلى طبق بتري، ثم أمل طبق بتري لفصل الجنين عن حبيبات OK. بعد إزالة السائل وتكرار عملية الغسل من مرتين إلى ثلاث مرات، استخدم ملقطاً دقيق الرأس لنقل الجنين إلى أنبوب طرد مركزي دقيق مُصنف مسبقاً، ثم قم بالتجميد السريع في النيتروجين السائل قبل التخزين عند درجة حرارة -80 °C.لإجراء مقايسة تكاثر الخلايا باستخدام EDU باستخدام مصباح الإضاءة بالألياف البصرية والشمعة والبيضة. لتحديد موقع الجنين أو المح، ضع علامة على جانب البيضة المقابل للجنين أو المح لضمان عدم إتلاف الجنين أثناء الحقن المجهري. بعد ذلك، استخدم صلصال التشكيل لتبطين طبق بلاستيكي بقطر 60 مليمتر عن طريق تشكيله على هيئة وعاء لتثبيت البيضة في الاتجاه المطلوب.اضبط اتجاه البقعة المحددة للسماح بإدخال إبرة الحقن المجهري. بعد سحب إبرتين شعريتين زجاجيتين بجوانب غير حادة، إحداهما لعمل ثقب في البيضة وبالاستعانة بالزيت المعدني، قم بتعبئة الإبرة الثانية وأدخلها في جهاز الحقن المجهري. اضبط حجم المحلول لكل حقنة على 59.8 nanoliters في جهاز الحقن المجهري، ثم باستخدام محلول EDU المخزون بتركيز 10 millimolar، قم بتعبئة إبرة الحقن المجهري واستخدم الشعيرة الزجاجية غير الحادة لثقب القشرة بعناية عند البقعة المحددة، مع الحرص على عدم تهشيم القشرة أو إسقاط قطع منها داخل تجويف البيضة.وجّه البيضة بحيث تكون الفتحة بزاوية 45 درجة بما يتماشى مع إبرة الحقن المجهري المراد إدخالها. ثم باستخدام الميكرو-مانيبولاتور (micro manipulator)، أدخل الإبرة المشحونة لمسافة سنتيمتر واحد تقريباً داخل التجويف، واححقن الكمية المطلوبة من محلول EDU في المح أو الجنين. استخدم على الفور عدة طبقات من البلاستيك لتغليف البيضة وحامل الصلصال، وثبت حواف الغلاف بشريط لاصق في قاع الطبق لمنع التبخر أثناء الحضانة.قم بتحضين البيضة عند 37 درجة Celsius على سطح مستقر حتى الوصول إلى المرحلة المطلوبة، ثم قم بإزالة الغلاف البلاستيكي وتشريح الجنين وفقاً للبروتوكول المكتوب؛ يوضح هذا الشكل عملية تهجين NC اثنين على أجنة مشرحة ومثبتة عُرّضت لجرعات منخفضة من ميثيل الزئبق للكشف عن تعبير ortho identical homeo box. وكما يظهر في المنظر الظهري والبطني لهياكل الرأس، أظهرت الأجنة المعالجة تأخراً في النمو العقلي عند المرحلة 11 مقارنة بالأجنة غير المعالجة. وفي المرحلة 12، تم تحضين مجموعة الأجنة الأربعة الموضحة على اليسار لنفس الفترة الزمنية.ومع ذلك، تطور الجنينان غير المعالجين في أعلى اليسار إلى المرحلة السادسة، بينما تطور الجنينان المعالجان بالزئبق في أسفل اليسار إلى المرحلة الخامسة فقط. تمت معالجة هذه الأجنة بمسبار حس (sense probe) لإثبات غياب التلوين الخلفي؛ وتظهر هنا الخلايا المتكاثرة في جنين في اليوم الثاني تم حقنه بـ EDU ثم حضنه طوال الليل. وتوضح كيمياء النقر (Click chemistry) التكاثر في الحواف الجانبية للجسيدات (somites) وبرعم الذيل، وكذلك في الرأس (cephalon).يحتوي هذا الهلام على عينات RNA مستخلصة من أجنة طائر Finch الزيبرا في المرحلة 16 التي تم تشريحها، والتي تركت بدون معالجة أو عولجت بـ 1.2 جزء في المليون من ميثيل الزئبق، مما يشير إلى أن طريقة التشريح الموضحة في هذا الفيديو تسمح باستخلاص RNA عالي الجودة بمجرد إتقانها. ويمكن إجراء التشريح في أقل من دقيقة إذا تم تنفيذه بشكل صحيح. ومن المهم خلال هذا الإجراء فحص المحّ بزاوية محددة لتحديد موقع الجنين، حيث يمكن أن يصعب ملاحظة الأجنة المبكرة عند اتباع هذا الإجراء.يمكن إجراء طرق أخرى مثل التهجين الموضعي، ومقاييس تكاثر الخلايا، واستخلاص RNA لإجراء التحليلات النوعية، وذلك للإجابة على أسئلة إضافية في الدراسات التنموية والسمومية.

dissection-downstream-analysis-zebra-finch-embryos-at-early-stages

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

تثبيت العينة كاملة في الموضع استُخدم التهجين الموضعي في الموقف الكامل (WISH) في مقرر أحياء الفقاريات المقارنة لطلاب المرحلة الجامعية المتقدمة، بالإضافة إلى عمليات تشريح الفقاريات. وقد أتاح ذلك للطلاب فرصة دراسة أنماط التعبير الجيني إلى جانب التشريح العياني، مما ربط بين دراسة البيولوجيا الجزيئية وبيولوجيا الكائنات الحية ضمن مقرر دراسي واحد.

جبل به الجامعة في الموقع تهجين ارتباط البيولوجيا الجزيئية والعضوي

العمليات التنموية مثل الانتشار، الزخرفة، والتمايز، والتوجيه محوار يمكن أن تكون على غرار بسهولة في الحبل الشوكي الزرد. في هذه المقالة، ونحن تصف الإجراء لتصاعد الأجنة الزرد، الذي يحسن التصور لهذه الأحداث.

تشريح والتركيب الجانبي من اسماك الزرد الأجنة: تحليل التنمية الحبل الشوكي

الوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر هي تقنية قوية مفيدة لوصف التطور الجنيني. هنا، نحن تصف منهجية وتميز التشكل القحفي في البرية من نوع، وكذلك pdgfra، smad5، وSMO الأجنة متحولة.

تحليل الجمجمة التشكل في الزرد عن طريق 4D متحد البؤر المجهري

الجنين الزرد هو نموذج ممتاز للبحوث البيولوجيا التطورية. خلال مرحلة التطور الجنيني، الزرد تطوير مع كتلة البيض، الذي يعرض التحديات ثلاثي الأبعاد للمراقبة العينة والتحليل. يصف هذا البروتوكول كيفية إنشاء ثنائي الأبعاد جبل الاستعدادات شقة من جبل بأكمله في الموقع (WISH) ملطخة العينات الجنين الزرد.

إعداد جبل مسطح لمراقبة وتحليل الأجنة الزرد عينات الملون بواسطة جبل الجامعة<em&gt; في الوضع الطبيعي</em&gt; التهجين

الطريقة الموصوفة هنا يسمح تحليل الوقت الفاصل بين تطوير الجهاز في الأجنة الزرد باستخدام مضان تشريح المجهر قادرة على أداء باجتزاء البصرية واستراتيجيات بسيطة من التعديل لتصحيح الانحراف البؤري ومستو.

تحليل التنمية الكلى الزرد مع الوقت الفاصل بين التصوير باستخدام مجهر تشريح مجهزة لباجتزاء البصري

الانقسام الحي أمر بالغ الأهمية لكل كائن حي وغالبا ما تؤدي العيوب إلى السرطان واضطرابات النمو. باستخدام بروتوكول التصوير هذا وسمك الزرد كنظام نموذجي ، يمكن للباحثين تصور الانقسام في كائن فقاري حي والعديد من العيوب التي تنشأ عندما تكون العمليات الانقسامية معيبة.

مراقبة قسم الميتوزى وديناميكية في الأجنة الزرد لايف

هنا، نقدم بروتوكول لعزل الأنسجة الغدد التناسلية من الزرد اليرقات، التي من شأنها تسهيل التحقيقات في التفرقة بين جنس الزرد والصيانة.

تشريح اليرقات الزرد الغدد التناسلية الأنسجة

يوضح هذا البروتوكول طريقة القائم على مضان لتصور الأوعية الدموية وتحديد مدى تعقيدها في القيطم الاستوائية . الأوعية الدموية يمكن تصويرها بعد دقائق من حقن صبغة الفلورسنت في قلب الضرب من الجنين بعد التلاعب الجيني و / أو الدوائية لدراسة التنمية القلب والأوعية الدموية في الجسم الحي .

التصور والتحليل الكمي من الأوعية الدموية الجنينية في<em&gt; زينوبوس تروبيكاليس</em

هنا، نقدم بروتوكول زراعة الأنسجة ثلاثية الأبعاد لمحور الجسم الخلفي لسمك الحمار الوحشي، مما يتيح الدراسة الحية للتجزئة الفقارية. يوفر هذا النموذج explant السيطرة على استطالة المحور، وتغيير مصادر مورفوجين، والتصوير الحي على مستوى الأنسجة دون الخلوية.

ثقافة Explant الذيل ثلاثي الأبعاد لدراسة تجزئة الفقاريات في حمار وحشي

تم وصف استراتيجية تحضير العينة لتصوير أجنة الزرد المبكرة داخل مشيمة سليمة باستخدام مجهر صفائح ضوئي. يحلل الاتجاهات المختلفة التي تكتسبها الأجنة داخل المشيمة في مراحل 70٪ من المشيمة والبراعم ويفصل استراتيجيات التصوير للحصول على دقة على نطاق خلوي في جميع أنحاء الجنين باستخدام نظام الورقة الضوئية.

التصوير المجهري للورقة الضوئية واستراتيجيات التركيب لأجنة أسماك الزرد المبكرة

تعلم تقنية تشريح أجنة عصفور زيبرا فينش في مراحلها التطويرية الأولى بأقل ضرر ممكن للأنسجة. تتيح هذه الطريقة إجراء تحاليل التعبير الجيني ودراسات السمية باستخدام Taeniopygia guttata.

تشريح وتحليل المصب من زيبرا فينش الأجنة في المراحل الأولى من التطوير

استكشف المزيد من الفيديوهات