التنميط الجيني للفئران
التنميط الجيني هو عملية الكشف عن وجود أو غياب تتابعات محددة من DNA في جينوم كائن حي معين.
ونظرًا لأن الجينات يمكن أن تؤثر على النمط الظاهري للفأر، فإن القدرة على فحص التركيبة الجينية للفأر الفردي، أو "النمط الجيني"، تعد أمرًا بالغ الأهمية لربط النمط الظاهري بجين محدد. سيتناول هذا الفيديو علم وراثة الفئران، ويستعرض الخطوات الأساسية لإجراء التنميط الجيني، ويشرح كيفية تفسير نتائج التنميط الجيني القائمة على تقنية PCR.
من أجل فهم ما يبحث عنه الباحثون عند تحديد التركيب الجيني للفئران، دعونا نراجع بعض التعديلات الشائعة في علم وراثة الفئران.
لدراسة جين معين، غالباً ما يقوم العلماء بتعطيل وظيفته عن طريق تغيير تسلسله الجيني. ومع ذلك، فإن الفئران ثنائية الصيغة الصبغية، لذا فهي تمتلك نسختين من أي جين معين. ونظراً لأن معظم الجينات تحتاج إلى نسخة طبيعية واحدة فقط لكي تعمل، يجب تربية الفئران لإنتاج حيوان يتم فيه تعطيل كلا الجينين قبل دراسة النمط الظاهري.
يُسمى هذا التركيب الجيني "تعطيل متماثل الزيجوت" (homozygous knockout)، أو بشكل أكثر شيوعاً "تعطيل" (knockout) للاختصار. وعلى العكس من ذلك، يُسمى الفأر الطبيعي الذي يمتلك نسختين وظيفيتين "نوعاً برياً متماثل الزيجوت" (homozygous wildtype)، أو مجرد "نوع بري" (wildtype). وأخيراً، يُشار إلى الفئران التي تمتلك نسخة وظيفية واحدة فقط بأنها "متباينة الزيجوت" (heterozygous)، أو "hets".
بدلاً من إزالة المادة الوراثية، تتطلب بعض التجارب إدخال تسلسلات DNA في جينوم الفأر. تُسمى قطع DNA المدرجة هذه "جينات منقولة" (transgenes)، وتُسمى الفئران التي تحملها "فئران معدلة وراثياً" (transgenic). وأكثر "جين منقول" شائع يتم إدخاله في الفئران هو الذي يحفز تعبير البروتين الفلوري الأخضر، أو GFP، المستخلص من قناديل البحر. ومن خلال استخدام محفز خاص بالأنسجة (وهو تسلسل تنظيمي "يحفز" نشاط الجين) لقيادة إنتاج GFP، يمكن التعرف بسهولة على الخلايا من نوع نسيجي معين عن طريق الفلورة الخضراء.
بما أن العديد من التغيرات الجينية لا تؤدي إلى نمط ظاهري يمكن ملاحظته بسهولة، مثل تعبير GFP، فمن الضروري إجراء تحديد نمط جيني (genotyping) للفئران لتحديد الحيوان المحدد الذي يجب استخدامه في التجارب. وقبل البدء في تحديد النمط الجيني، يجب تمييز الفئران بعناية بحيث يمكن التعرف عليها مرة أخرى لاحقاً. لا، ستحتاج إلى شيء أكثر ديمومة من ذلك؛ إحدى الطرق الشائعة هي عمل ثقوب (notches) في الأذن، بحيث يتوافق موقع وعدد هذه الثقوب مع رقم تعريفي محدد.
بمجرد تمييز الفأر، يتم جمع قطعة صغيرة من النسيج (عادةً 2 — 5 mm من الذيل، باستخدام شفرة حلاقة أو مقص) لاستخلاص DNA منها. وإذا كنت تجمع أنسجة من أكثر من فأر واحد، فقم بتحديد الأجزاء المستخدمة من الشفرة لضمان عدم استخدام نفس الجزء مع الحيوان التالي، مما قد يؤدي إلى حدوث تلوث خلطي في عيناتك.
لبدء عملية فصل المادة الوراثية عن المكونات الأخرى للنسيج، يتم هضم العينة في محلول تحلل (lysis buffer) يحتوي على إنزيم proteinase K. وبعد عملية هضم تستمر طوال الليل، يتم طرد العينة مركزياً لترسيب الشعر وأي مواد أخرى غير مهضومة. ولعزل DNA من المستخلص المهضوم، تعتبر إضافة الكحول لترسيب الأحماض النووية طريقة بسيطة وفعالة. وبعد تحضين قصير، يتم طرد العينة مركزياً مرة أخرى لجمع DNA في شكل راسب.
بعد الغسل باستخدام ethanol بتركيز 70% لإزالة الأملاح الزائدة، يتم إعادة تعليق راسب DNA في الماء أو محلول منظم (buffer)، ويصبح حينها جاهزاً لعملية تحديد النمط الجيني.
توجد استراتيجيات عديدة لتحديد ما إذا كان تسلسل DNA معين موجوداً في الفئران المستخدمة. تتطلب معظم هذه الاستراتيجيات منك أولاً تضخيم المنطقة الجينية المستهدفة باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل، أو PCR. لمزيد من المعلومات حول كيفية إعداد الـ PCR، يرجى الاطلاع على "دليل الـ PCR" من JoVE Science Education.
تتمثل إحدى طرق التمييز بين الأنماط الجينية في الكشف عن التغيرات في حجم القطعة المضخمة بواسطة الـ PCR. لنفترض أنك تقوم بفحص الفئران بحثاً عن إدراج جيني يبلغ 700 base pairs. بعد الـ PCR، ستكون نطاقات النوع البري (wildtype) بطول 200 base pairs، بينما يجب أن تكون نطاقات الجين المنقول (transgene) بطول 900 base pairs.
بعد إجراء الـ PCR، قم بفصل نواتج التفاعل على هلام أغاروز (agarose gel) بنسبة مئوية مناسبة، لكي تتمكن من تمييز أحجام القطع لديك. يجب أن يحتوي ضابط النوع البري (wildtype control) على نطاق النوع البري بطول 200 base pair فقط؛ ويجب أن يحتوي ضابط الجين المنقول (transgenic control) على نطاق الجين المنقول الواحد بطول 900 base pair فقط؛ بينما يجب أن يحتوي الضابط المتباين الزيجوت (het control) على كلا النطاقين. وأخيراً، يتم إدراج ضابط "بدون قالب" (no template control) للتأكد من أن الكواشف لا تحتوي على أي DNA ملوث، وبالتالي لا ينبغي أن ينتج عنه أي نطاقات.
الآن وبعد أن تأكدنا من أن الضوابط عملت كما هو متوقع، دعنا نفحص الفئران غير المعروفة. بما أن الفأرين 1 و 2 لديهما نطاق واحد فقط من النوع البري، فهما متماثلا الزيجوت للنوع البري (homozygous wildtype). أما الفأران 4 و 6 فلديهما نطاق واحد فقط للجين المنقول، وبالتالي فهما متماثلا الزيجوت للجين المنقول (homozygous transgenic).
أما الفأران 3 و 5 فيمتلك كل منهما نطاقين، وبالتالي فهما متباينان الزيجوت (hets).
أخيراً، عندما تعود للعثور على الفئران ذات النمط الجيني الذي تريده، ما عليك سوى مطابقة نمط ثقوب الأذن مع رقم تعريف الفأر.
بعد اكتساب فهم لماهية التنميط الجيني وكيفية إجرائه، دعونا نلقي نظرة على بعض الأمثلة التي توضح سبب أهميته.
في بعض الحالات، تتطلب عملية إنتاج النمط الظاهري المطلوب تعديلات جينية أكثر تعقيداً. على سبيل المثال، لإنشاء هذا النموذج من سرطان الجلد في الفئران، يلزم وجود جينين منقولين؛ يحمل أحدهما "جيناً ورمياً" قابلاً للتحفيز، وهو جين يمكن أن يسبب السرطان، بينما يحمل الثاني إنزيم Cre recombinase، الذي يتم التعبير عنه فقط في خلايا الجلد ويقوم باستئصال تسلسل يمنع نسخ الجين الورمي، مما يسمح بالتعبير عن الجين الورمي. ولإنتاج نسل يحمل كلا الجينين المنقولين، يتم تزويج فئران متغايرة الزيجوت لكل منهما. ثم يُستخدم التنميط الجيني لتحديد النسل المطلوب.
أحياناً قد لا يكون من الممكن إجراء التنميط الجيني للفئران قبل التجربة. على سبيل المثال، في هذه الدراسة حول معدل ضربات قلب الجنين، لا يمكن جمع أنسجة للتنميط الجيني من الأجنة دون التأثير على سلوكها. لذا، يتم أولاً تحديد مواقع الأجنة داخل الأم بعناية، ثم تُسجل قياسات الموجات فوق الصوتية. وفي النهاية، يتم جمع خزعات من الذيل لتحديد تأثير النمط الجيني على معدل ضربات القلب.
لقد استعرض هذا الفيديو طريقة واحدة لاستخلاص DNA، ولكن هناك العديد من المتغيرات. على سبيل المثال، يتطلب نظام Direct PCR أقل من خمس دقائق من هضم الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك، بعد ترسيب المواد غير المهضومة عن طريق الطرد المركزي، يكون السائل الطافي جاهزاً لعملية PCR، مما يلغي الحاجة إلى تنقية DNA.
لقد شاهدتم للتو دليل JoVE حول التنميط الجيني للفئران. استعرضنا في هذا الفيديو أساسيات علم الوراثة في الفئران، وكيفية تحضير عينات الحمض النووي للفئران وتحليلها، بالإضافة إلى بعض التطبيقات العملية لهذه التقنية. شكراً للمشاهدة!
على الرغم من رسم خريطة الجينوم البشري منذ أكثر من 10 سنوات، لا يزال العلماء بعيدين كل البعد عن فهم وظيفة كل جين بشري! وتتمثل إحدى الطرق لتقييم كيفية ع…
التنميط الجيني هو عملية الكشف عن وجود أو غياب تتابعات محددة من DNA في جينوم كائن حي معين.
ونظرًا لأن الجينات يمكن أن تؤثر على النمط الظاهري للفأر، فإن القدرة على فحص التركيبة الجينية للفأر الفردي، أو "النمط الجيني"، تعد أمرًا بالغ الأهمية لربط النمط الظاهري بجين محدد. سيتناول هذا الفيديو علم وراثة الفئران، ويستعرض الخطوات الأساسية لإجراء التنميط الجيني، ويشرح كيفية تفسير نتائج التنميط الجيني القائمة على تقنية PCR.
من أجل فهم ما يبحث عنه الباحثون عند تحديد التركيب الجيني للفئران، دعونا نراجع بعض التعديلات الشائعة في علم وراثة الفئران.
لدراسة جين معين، غالباً ما يقوم العلماء بتعطيل وظيفته عن طريق تغيير تسلسله الجيني.ومع ذلك، فإن الفئران ثنائية الصيغة الصبغية، لذا فهي تمتلك نسختين من أي جين معين. ونظراً لأن معظم الجينات تحتاج إلى نسخة طبيعية واحدة فقط لكي تعمل، يجب تربية الفئران لإنتاج حيوان يتم فيه تعطيل كلا الجينين قبل دراسة النمط الظاهري.
يُسمى هذا التركيب الجيني "تعطيل متماثل الزيجوت" (homozygous knockout)، أو بشكل أكثر شيوعاً "تعطيل" (knockout) للاختصار. وعلى العكس من ذلك، يُسمى الفأر الطبيعي الذي يمتلك نسختين وظيفيتين "نوعاً برياً متماثل الزيجوت" (homozygous wildtype)، أو مجرد "نوع بري" (wildtype). وأخيراً، يُشار إلى الفئران التي تمتلك نسخة وظيفية واحدة فقط بأنها "متباينة الزيجوت" (heterozygous)، أو "hets".
بدلاً من إزالة المادة الوراثية، تتطلب بعض التجارب إدخال تسلسلات DNA في جينوم الفأر. تُسمى قطع DNA المدرجة هذه "جينات منقولة" (transgenes)، وتُسمى الفئران التي تحملها "فئران معدلة وراثياً" (transgenic). وأكثر "جين منقول" شائع يتم إدخاله في الفئران هو الذي يحفز تعبير البروتين الفلوري الأخضر، أو GFP، المستخلص من قناديل البحر. ومن خلال استخدام محفز خاص بالأنسجة (وهو تسلسل تنظيمي "يحفز" نشاط الجين) لقيادة إنتاج GFP، يمكن التعرف بسهولة على الخلايا من نوع نسيجي معين عن طريق الفلورة الخضراء.
بما أن العديد من التغيرات الجينية لا تؤدي إلى نمط ظاهري يمكن ملاحظته بسهولة، مثل تعبير GFP، فمن الضروري إجراء تحديد نمط جيني (genotyping) للفئران لتحديد الحيوان المحدد الذي يجب استخدامه في التجارب. وقبل البدء في تحديد النمط الجيني، يجب تمييز الفئران بعناية بحيث يمكن التعرف عليها مرة أخرى لاحقاً. لا، ستحتاج إلى شيء أكثر ديمومة من ذلك؛ إحدى الطرق الشائعة هي عمل ثقوب (notches) في الأذن، بحيث يتوافق موقع وعدد هذه الثقوب مع رقم تعريفي محدد.
بمجرد تمييز الفأر، يتم جمع قطعة صغيرة من النسيج (عادةً 2 — 5 mm من الذيل، باستخدام شفرة حلاقة أو مقص) لاستخلاص DNA منها. وإذا كنت تجمع أنسجة من أكثر من فأر واحد، فقم بتحديد الأجزاء المستخدمة من الشفرة لضمان عدم استخدام نفس الجزء مع الحيوان التالي، مما قد يؤدي إلى حدوث تلوث خلطي في عيناتك.
لبدء عملية فصل المادة الوراثية عن المكونات الأخرى للنسيج، يتم هضم العينة في محلول تحلل (lysis buffer) يحتوي على إنزيم proteinase K. وبعد عملية هضم تستمر طوال الليل، يتم طرد العينة مركزياً لترسيب الشعر وأي مواد أخرى غير مهضومة. ولعزل DNA من المستخلص المهضوم، تعتبر إضافة الكحول لترسيب الأحماض النووية طريقة بسيطة وفعالة. وبعد تحضين قصير، يتم طرد العينة مركزياً مرة أخرى لجمع DNA في شكل راسب.
بعد الغسل باستخدام ethanol بتركيز 70% لإزالة الأملاح الزائدة، يتم إعادة تعليق راسب DNA في الماء أو محلول منظم (buffer)، ويصبح حينها جاهزاً لعملية تحديد النمط الجيني.
توجد استراتيجيات عديدة لتحديد ما إذا كان تسلسل DNA معين موجوداً في الفئران المستخدمة. تتطلب معظم هذه الاستراتيجيات منك أولاً تضخيم المنطقة الجينية المستهدفة باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل، أو PCR. لمزيد من المعلومات حول كيفية إعداد الـ PCR، يرجى الاطلاع على "دليل الـ PCR" من JoVE Science Education.
تتمثل إحدى طرق التمييز بين الأنماط الجينية في الكشف عن التغيرات في حجم القطعة المضخمة بواسطة الـ PCR. لنفترض أنك تقوم بفحص الفئران بحثاً عن إدراج جيني يبلغ 700 base pairs. بعد الـ PCR، ستكون نطاقات النوع البري (wildtype) بطول 200 base pairs، بينما يجب أن تكون نطاقات الجين المنقول (transgene) بطول 900 base pairs.
بعد إجراء الـ PCR، قم بفصل نواتج التفاعل على هلام أغاروز (agarose gel) بنسبة مئوية مناسبة، لكي تتمكن من تمييز أحجام القطع لديك. يجب أن يحتوي ضابط النوع البري (wildtype control) على نطاق النوع البري بطول 200 base pair فقط؛ ويجب أن يحتوي ضابط الجين المنقول (transgenic control) على نطاق الجين المنقول الواحد بطول 900 base pair فقط؛ بينما يجب أن يحتوي الضابط المتباين الزيجوت (het control) على كلا النطاقين. وأخيراً، يتم إدراج ضابط "بدون قالب" (no template control) للتأكد من أن الكواشف لا تحتوي على أي DNA ملوث، وبالتالي لا ينبغي أن ينتج عنه أي نطاقات.
الآن وبعد أن تأكدنا من أن الضوابط عملت كما هو متوقع، دعنا نفحص الفئران غير المعروفة. بما أن الفأرين 1 و 2 لديهما نطاق واحد فقط من النوع البري، فهما متماثلا الزيجوت للنوع البري (homozygous wildtype). أما الفأران 4 و 6 فلديهما نطاق واحد فقط للجين المنقول، وبالتالي فهما متماثلا الزيجوت للجين المنقول (homozygous transgenic).
أما الفأران 3 و 5 فيمتلك كل منهما نطاقين، وبالتالي فهما متباينان الزيجوت (hets).
أخيراً، عندما تعود للعثور على الفئران ذات النمط الجيني الذي تريده، ما عليك سوى مطابقة نمط ثقوب الأذن مع رقم تعريف الفأر.
بعد اكتساب فهم لماهية التنميط الجيني وكيفية إجرائه، دعونا نلقي نظرة على بعض الأمثلة التي توضح سبب أهميته.
في بعض الحالات، تتطلب عملية إنتاج النمط الظاهري المطلوب تعديلات جينية أكثر تعقيداً. على سبيل المثال، لإنشاء هذا النموذج من سرطان الجلد في الفئران، يلزم وجود جينين منقولين؛ يحمل أحدهما "جيناً ورمياً" قابلاً للتحفيز، وهو جين يمكن أن يسبب السرطان، بينما يحمل الثاني إنزيم Cre recombinase، الذي يتم التعبير عنه فقط في خلايا الجلد ويقوم باستئصال تسلسل يمنع نسخ الجين الورمي، مما يسمح بالتعبير عن الجين الورمي. ولإنتاج نسل يحمل كلا الجينين المنقولين، يتم تزويج فئران متغايرة الزيجوت لكل منهما. ثم يُستخدم التنميط الجيني لتحديد النسل المطلوب.
أحياناً قد لا يكون من الممكن إجراء التنميط الجيني للفئران قبل التجربة. على سبيل المثال، في هذه الدراسة حول معدل ضربات قلب الجنين، لا يمكن جمع أنسجة للتنميط الجيني من الأجنة دون التأثير على سلوكها. لذا، يتم أولاً تحديد مواقع الأجنة داخل الأم بعناية، ثم تُسجل قياسات الموجات فوق الصوتية. وفي النهاية، يتم جمع خزعات من الذيل لتحديد تأثير النمط الجيني على معدل ضربات القلب.
لقد استعرض هذا الفيديو طريقة واحدة لاستخلاص DNA، ولكن هناك العديد من المتغيرات. على سبيل المثال، يتطلب نظام Direct PCR أقل من خمس دقائق من هضم الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك، بعد ترسيب المواد غير المهضومة عن طريق الطرد المركزي، يكون السائل الطافي جاهزاً لعملية PCR، مما يلغي الحاجة إلى تنقية DNA.
لقد شاهدتم للتو دليل JoVE حول التنميط الجيني للفئران. استعرضنا في هذا الفيديو أساسيات علم الوراثة في الفئران، وكيفية تحضير عينات الحمض النووي للفئران وتحليلها، بالإضافة إلى بعض التطبيقات العملية لهذه التقنية. شكراً للمشاهدة!
تسجيل الدخول أو للوصول إلى المحتوى الكامل. تعرّف على المزيد حول وصول مؤسستك إلى محتوى JoVE هنا
التنميط الجيني هو عملية الكشف عن وجود أو غياب تتابعات محددة من DNA في جينوم كائن حي معين.
ونظرًا لأن الجينات يمكن أن تؤثر على النمط الظاهري للفأر، فإن القدرة على فحص التركيبة الجينية للفأر الفردي، أو "النمط الجيني"، تعد أمرًا بالغ الأهمية لربط النمط الظاهري بجين محدد. سيتناول هذا الفيديو علم وراثة الفئران، ويستعرض الخطوات الأساسية لإجراء التنميط الجيني، ويشرح كيفية تفسير نتائج التنميط الجيني القائمة على تقنية PCR.
من أجل فهم ما يبحث عنه الباحثون عند تحديد التركيب الجيني للفئران، دعونا نراجع بعض التعديلات الشائعة في علم وراثة الفئران.
لدراسة جين معين، غالباً ما يقوم العلماء بتعطيل وظيفته عن طريق تغيير تسلسله الجيني. ومع ذلك، فإن الفئران ثنائية الصيغة الصبغية، لذا فهي تمتلك نسختين من أي جين معين. ونظراً لأن معظم الجينات تحتاج إلى نسخة طبيعية واحدة فقط لكي تعمل، يجب تربية الفئران لإنتاج حيوان يتم فيه تعطيل كلا الجينين قبل دراسة النمط الظاهري.
يُسمى هذا التركيب الجيني "تعطيل متماثل الزيجوت" (homozygous knockout)، أو بشكل أكثر شيوعاً "تعطيل" (knockout) للاختصار. وعلى العكس من ذلك، يُسمى الفأر الطبيعي الذي يمتلك نسختين وظيفيتين "نوعاً برياً متماثل الزيجوت" (homozygous wildtype)، أو مجرد "نوع بري" (wildtype). وأخيراً، يُشار إلى الفئران التي تمتلك نسخة وظيفية واحدة فقط بأنها "متباينة الزيجوت" (heterozygous)، أو "hets".
بدلاً من إزالة المادة الوراثية، تتطلب بعض التجارب إدخال تسلسلات DNA في جينوم الفأر. تُسمى قطع DNA المدرجة هذه "جينات منقولة" (transgenes)، وتُسمى الفئران التي تحملها "فئران معدلة وراثياً" (transgenic). وأكثر "جين منقول" شائع يتم إدخاله في الفئران هو الذي يحفز تعبير البروتين الفلوري الأخضر، أو GFP، المستخلص من قناديل البحر. ومن خلال استخدام محفز خاص بالأنسجة (وهو تسلسل تنظيمي "يحفز" نشاط الجين) لقيادة إنتاج GFP، يمكن التعرف بسهولة على الخلايا من نوع نسيجي معين عن طريق الفلورة الخضراء.
بما أن العديد من التغيرات الجينية لا تؤدي إلى نمط ظاهري يمكن ملاحظته بسهولة، مثل تعبير GFP، فمن الضروري إجراء تحديد نمط جيني (genotyping) للفئران لتحديد الحيوان المحدد الذي يجب استخدامه في التجارب. وقبل البدء في تحديد النمط الجيني، يجب تمييز الفئران بعناية بحيث يمكن التعرف عليها مرة أخرى لاحقاً. لا، ستحتاج إلى شيء أكثر ديمومة من ذلك؛ إحدى الطرق الشائعة هي عمل ثقوب (notches) في الأذن، بحيث يتوافق موقع وعدد هذه الثقوب مع رقم تعريفي محدد.
بمجرد تمييز الفأر، يتم جمع قطعة صغيرة من النسيج (عادةً 2 — 5 mm من الذيل، باستخدام شفرة حلاقة أو مقص) لاستخلاص DNA منها. وإذا كنت تجمع أنسجة من أكثر من فأر واحد، فقم بتحديد الأجزاء المستخدمة من الشفرة لضمان عدم استخدام نفس الجزء مع الحيوان التالي، مما قد يؤدي إلى حدوث تلوث خلطي في عيناتك.
لبدء عملية فصل المادة الوراثية عن المكونات الأخرى للنسيج، يتم هضم العينة في محلول تحلل (lysis buffer) يحتوي على إنزيم proteinase K. وبعد عملية هضم تستمر طوال الليل، يتم طرد العينة مركزياً لترسيب الشعر وأي مواد أخرى غير مهضومة. ولعزل DNA من المستخلص المهضوم، تعتبر إضافة الكحول لترسيب الأحماض النووية طريقة بسيطة وفعالة. وبعد تحضين قصير، يتم طرد العينة مركزياً مرة أخرى لجمع DNA في شكل راسب.
بعد الغسل باستخدام ethanol بتركيز 70% لإزالة الأملاح الزائدة، يتم إعادة تعليق راسب DNA في الماء أو محلول منظم (buffer)، ويصبح حينها جاهزاً لعملية تحديد النمط الجيني.
توجد استراتيجيات عديدة لتحديد ما إذا كان تسلسل DNA معين موجوداً في الفئران المستخدمة. تتطلب معظم هذه الاستراتيجيات منك أولاً تضخيم المنطقة الجينية المستهدفة باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل، أو PCR. لمزيد من المعلومات حول كيفية إعداد الـ PCR، يرجى الاطلاع على "دليل الـ PCR" من JoVE Science Education.
تتمثل إحدى طرق التمييز بين الأنماط الجينية في الكشف عن التغيرات في حجم القطعة المضخمة بواسطة الـ PCR. لنفترض أنك تقوم بفحص الفئران بحثاً عن إدراج جيني يبلغ 700 base pairs. بعد الـ PCR، ستكون نطاقات النوع البري (wildtype) بطول 200 base pairs، بينما يجب أن تكون نطاقات الجين المنقول (transgene) بطول 900 base pairs.
بعد إجراء الـ PCR، قم بفصل نواتج التفاعل على هلام أغاروز (agarose gel) بنسبة مئوية مناسبة، لكي تتمكن من تمييز أحجام القطع لديك. يجب أن يحتوي ضابط النوع البري (wildtype control) على نطاق النوع البري بطول 200 base pair فقط؛ ويجب أن يحتوي ضابط الجين المنقول (transgenic control) على نطاق الجين المنقول الواحد بطول 900 base pair فقط؛ بينما يجب أن يحتوي الضابط المتباين الزيجوت (het control) على كلا النطاقين. وأخيراً، يتم إدراج ضابط "بدون قالب" (no template control) للتأكد من أن الكواشف لا تحتوي على أي DNA ملوث، وبالتالي لا ينبغي أن ينتج عنه أي نطاقات.
الآن وبعد أن تأكدنا من أن الضوابط عملت كما هو متوقع، دعنا نفحص الفئران غير المعروفة. بما أن الفأرين 1 و 2 لديهما نطاق واحد فقط من النوع البري، فهما متماثلا الزيجوت للنوع البري (homozygous wildtype). أما الفأران 4 و 6 فلديهما نطاق واحد فقط للجين المنقول، وبالتالي فهما متماثلا الزيجوت للجين المنقول (homozygous transgenic).
أما الفأران 3 و 5 فيمتلك كل منهما نطاقين، وبالتالي فهما متباينان الزيجوت (hets).
أخيراً، عندما تعود للعثور على الفئران ذات النمط الجيني الذي تريده، ما عليك سوى مطابقة نمط ثقوب الأذن مع رقم تعريف الفأر.
بعد اكتساب فهم لماهية التنميط الجيني وكيفية إجرائه، دعونا نلقي نظرة على بعض الأمثلة التي توضح سبب أهميته.
في بعض الحالات، تتطلب عملية إنتاج النمط الظاهري المطلوب تعديلات جينية أكثر تعقيداً. على سبيل المثال، لإنشاء هذا النموذج من سرطان الجلد في الفئران، يلزم وجود جينين منقولين؛ يحمل أحدهما "جيناً ورمياً" قابلاً للتحفيز، وهو جين يمكن أن يسبب السرطان، بينما يحمل الثاني إنزيم Cre recombinase، الذي يتم التعبير عنه فقط في خلايا الجلد ويقوم باستئصال تسلسل يمنع نسخ الجين الورمي، مما يسمح بالتعبير عن الجين الورمي. ولإنتاج نسل يحمل كلا الجينين المنقولين، يتم تزويج فئران متغايرة الزيجوت لكل منهما. ثم يُستخدم التنميط الجيني لتحديد النسل المطلوب.
أحياناً قد لا يكون من الممكن إجراء التنميط الجيني للفئران قبل التجربة. على سبيل المثال، في هذه الدراسة حول معدل ضربات قلب الجنين، لا يمكن جمع أنسجة للتنميط الجيني من الأجنة دون التأثير على سلوكها. لذا، يتم أولاً تحديد مواقع الأجنة داخل الأم بعناية، ثم تُسجل قياسات الموجات فوق الصوتية. وفي النهاية، يتم جمع خزعات من الذيل لتحديد تأثير النمط الجيني على معدل ضربات القلب.
لقد استعرض هذا الفيديو طريقة واحدة لاستخلاص DNA، ولكن هناك العديد من المتغيرات. على سبيل المثال، يتطلب نظام Direct PCR أقل من خمس دقائق من هضم الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك، بعد ترسيب المواد غير المهضومة عن طريق الطرد المركزي، يكون السائل الطافي جاهزاً لعملية PCR، مما يلغي الحاجة إلى تنقية DNA.
لقد شاهدتم للتو دليل JoVE حول التنميط الجيني للفئران. استعرضنا في هذا الفيديو أساسيات علم الوراثة في الفئران، وكيفية تحضير عينات الحمض النووي للفئران وتحليلها، بالإضافة إلى بعض التطبيقات العملية لهذه التقنية. شكراً للمشاهدة!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the difference between homozygous wildtype, heterozygous, and homozygous knockout mice?
Homozygous wildtype mice have two functional gene copies and normal phenotype. Heterozygous mice carry one functional and one disrupted copy. Homozygous knockout mice have both gene copies disrupted, allowing researchers to study the gene's full functional role. These genotypes are critical for understanding how specific genetic changes affect mouse biology and development and reproduction of the laboratory mouse.
Q2: How do you extract DNA from mouse tissue for genotyping?
Collect a small tissue sample (2-5 mm of tail) and digest it overnight in lysis buffer containing proteinase K enzyme. Centrifuge to pellet hair and debris, then add alcohol to precipitate nucleic acids. Centrifuge again to collect the DNA pellet, wash with 70% ethanol to remove salts, and resuspend in water or buffer for genotyping analysis.
Q3: What are transgenic mice and why are they used in research?
Transgenic mice carry inserted DNA fragments called transgenes introduced into their genome. A common transgene drives expression of green fluorescent protein (GFP) from jellyfish using tissue-specific promoters, allowing researchers to easily identify cells from specific tissues by green fluorescence. This enables tracking of gene expression patterns and cellular behavior in living organisms.
Q4: How do you interpret PCR-based genotyping results on an agarose gel?
Compare band patterns to control samples. Wildtype controls show only the wildtype band size; transgenic controls show only the transgene band size; heterozygous controls display both bands. Unknown mice with one wildtype band are homozygous wildtype, one transgene band indicates homozygous transgenic, and two bands indicate heterozygous genotype.
Q5: Why is it important to label mice before genotyping?
Labeling mice with permanent identifiers like ear notches ensures researchers can track individual animals after genotyping and match them to their genetic results. This allows scientists to identify and select mice with desired genotypes for experiments and maintain accurate records across multiple generations of breeding.
Q6: What are some practical applications of mouse genotyping in research?
Genotyping identifies offspring carrying multiple transgenes needed for complex genetic models, such as cancer studies requiring both an oncogene and Cre recombinase. It also enables retrospective analysis when direct embryo sampling is impossible, such as measuring embryonic heart rate while preserving fetal development by collecting tail biopsies after ultrasound measurements.
Q7: What precautions should you take when collecting tissue samples from multiple mice?
Mark used segments of the blade or scissors to prevent cross-contamination between samples. Using the same part of the cutting tool on multiple animals can transfer DNA from one mouse to another, compromising genotyping accuracy and leading to false or ambiguous results in your analysis.
Browse More Videos
الفصول في هذا الفيديو
0:00
Overview
0:40
Mouse Genetics
2:23
Tissue Collection and DNA Extraction
4:11
Genotyping by PCR
6:08
Applications
8:02
Summary