إعداد جبل مسطح لمراقبة وتحليل الأجنة الزرد عينات الملون بواسطة جبل الجامعة في الوضع الطبيعي التهجين

الجنين الزرد هو نموذج ممتاز للبحوث البيولوجيا التطورية. خلال مرحلة التطور الجنيني، الزرد تطوير مع كتلة البيض، الذي يعرض التحديات ثلاثي الأبعاد للمراقبة العينة والتحليل. يصف هذا البروتوكول كيفية إنشاء ثنائي الأبعاد جبل الاستعدادات شقة من جبل بأكمله في الموقع (WISH) ملطخة العينات الجنين الزرد.

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور أجنة أسماك الحمار الوحشي الثابتة الملطخة بشكل أفضل في النقاط الزمنية المبكرة للنمو. يتم تحقيق ذلك عن طريق تلطيخ جنين أسماك الحمار الوحشي أولا باستخدام الحامل المنزلي في تهجين C two. بعد ذلك ، يتم اختيار الجنين لتركيب مسطح ويتم إجراء شق مركزي في صفار البيض باستخدام زوج من الملقط الناعم ، ثم يتم استخدام أدوات الرموش لكشط وإزالة حبيبات الصفار المتبقية برفق.

أخيرا ، يتم تركيب الجنين في الجلسرين على شريحة لتمكين التصوير المناسب للعينة. في النهاية ، يسمح التثبيت المسطح بتصور أفضل للأجنة الملطخة من الرؤية الظهرية عن طريق إزالة صفار البيض ووضع الجنين في مستحضر ثنائي الأبعاد. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل تصوير الأجنة السليمة في مراحل النمو الأصغر هي أن التثبيت المسطح يزيل كيس الصفار مما يسمح برؤية الجنين بأكمله.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجال التنموي ، مثل توصيف مجال ما قبل الجنس الكلوي في الجنين. بشكل عام ، يكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن هذه التقنية تتطلب معالجة دقيقة للجنين ، وأيضا لأن تعلم المقدار المناسب من الضغط اللازم لإزالة كيس الصفار قد يستغرق وقتا. سأظهر هذا الإجراء أنا وزوي وأماندا ، وهم طلاب دراسات عليا في مختبر الجناح.

بعد جمع الأجنة وإصلاحها وتلطيخها ، وفقا لبروتوكول النص ، حدد جنينا للتركيب المسطح باستخدام X-P-B-S-T. انقل الجنين إلى طبق بتري بلاستيكي أو زجاجي. ثم مع وضع الطبق تحت مجهر ستيريو ، استخدم ملقطا دقيقا لدحرجة الجنين بحيث يتم الحصول على رؤية جانبية مع ظهور نهايات الرأس والذيل.

بعد ذلك ، استخدم ملقطا دقيقا لتثبيت الجنين ومجموعة ثانية لعمل شق في صفار البيض في موضع يقع في المنتصف بين رأس الجنين وذيله. ثم باستخدام ملقط ناعم ، أخرج صفار البيض من تجويف خلية البلوط. استخدم X-P-B-S-T لشطف صفار البيض الشارد من الجنين باستخدام قطرة إلى قطرتين من XPBS واحد.

انقل الجنين إلى شريحة زجاجية مسطحة. اسحب الجنين إلى حافة المخزن المؤقت بحيث يظل في وضع مسطح مقابل الشريحة الزجاجية. أثناء تثبيت الجنين ، استخدم أداة الرموش لكشط السطح البطني برفق لإزالة حبيبات الصفار.

إذا أصبح محلول PBST مزدحما بصفار البيض الزائد أو بدأ في التبخر ، أضف قطرة إلى قطرتين طازجتين واسحب الجنين إلى هذا المخزن المؤقت الجديد. بعد إزالة الصفار بشكل مرض ، انقل الجنين برفق مرة أخرى إلى طبق بتري من PBST لشطفه النهائي. ثم انقل الجنين إلى طبق بتري يحتوي على 100٪ جلسرين واحتضانه لمدة خمس دقائق.

لتركيب الجنين على شريحة زجاجية ، قم بنقله إلى زجاج نظيف. حرك قطرة إلى قطرتين من الجلسرين بنسبة 100٪ وضعها مع جانب الصفار البطني المواجه للشريحة الزجاجية. باستخدام أداة الرموش ، اسحب الجنين إلى حافة قطرة الجلسرين بحيث يظل في وضع مسطح مقابل الشريحة.

إذا كان المحور الجنيني منحنيا ، فاستخدم الملقط الدقيق لعمل شقوق صغيرة برفق في صفار البيض المتبقي لتخفيف التوتر بحيث يمكن وضعه بشكل مسطح. على الشريحة. ضع فتحات صغيرة من طين النمذجة على الزوايا الأربع لزلة غطاء زجاجي مقاس 18 × 18.

ضع زلة الغطاء ببطء على الجنين ، مع تحريك زلة الغطاء بزاوية لتقليل فقاعات الهواء في الجلسرين. أخيرا ، أضف قطرة إضافية من الجلسرين بنسبة 100٪ إلى جانب زلة الغطاء لملء الفراغ بين الزجاج وللتخلص من الانجراف ، استخدم مجهر استريو أو مركب للصورة الموضحة هنا. تم استخدام مجموعة من المجسات جنبا إلى جنب مع اثنين من الألوان التي ترغب في تسمية الأسلاف الكلوية النامية التي تؤدي إلى ظهور الكلى وكانت الأجنة مثبتة بشكل مسطح في وقت مبكر.

لذا ، في مراحل العث ، يتم ترسيم الأسلاف الكلوية بنمط على شكل حرف U من خلال تعبيرهم عن نسخ PAX اثنين A المحيطة بالأديم المتوسط الجزئي الذي يعبر بشكل متزامن عن دلتا C الموضح باللون الأحمر. عندما تم تصنيف دلتا C بالاشتراك مع C crox 20 ، تم الكشف عن مجال فرعي منقاري للأسلاف الكلوية يعبر عن دلتا C يحلل التعبير عن PAX اثنين a و SLC four A Four و SLC 12 A Three و S-M-Y-H-C واحد في 14. لذا فإن مرحلة العث تتيح رسم خرائط لمجال السلف الكلوي بأكمله باستخدام PAX two A ، وكشفت أن مجموعة فرعية من الخلايا في المجال الفرعي المنقاري عبرت عن SLC أربعة A أربعة.

لم يتداخل ذلك مع المجال الفرعي للسلاف الكلوية التي عبرت عن SLC 12 A ثلاثة. في هذا الشكل ، تم تطوير الأجنة التي تحتوي على طفرات في نازعة هيدروجين ريتينالديهايد ريتين لدهيدروجين للتخليق الحيوي لحمض الريتينويك أو الأجنة المعالجة بمثبط DEAB و ALD H الذي تم تطويره بتعبير منخفض أو ملغى على التوالي من WT واحد A ، مما يدل على أن رغبة لونين مع إعداد التثبيت المسطح ذات قيمة لدراسة المجالات الخلوية أثناء تكوين الأعضاء. في أسماك الزرد ذات الطفرات الجينية أو عند التعرض كيميائيا لجزيئات صغيرة بمجرد إتقانها ، يمكن أن تستغرق هذه التقنية من 10 إلى 15 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التصوير للإجابة على أسئلة إضافية مثل مكان حدود أجزاء الكلى. بعد مشاهدة الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تركيب جنين الزرد الملون بشكل مسطح من أجل تصور الهياكل المرغوبة بشكل أفضل عن طريق إزالة صفار البيض.