EPR رصدت الأكسدة والاختزال المعايرة من العوامل المساعدة لل خميرة الخباز Nar1

الهدف العام من هذا الإجراء هو توصيف خصائص الأكسدة والاختزال للإنزيم أو البروتين. يتم تحقيق ذلك عن طريق إدخال قطب كهربائي عامل ومرجعي متصل بمقياس مسامير إلى وعاء معايرة الأكسدة والاختزال فوق تحريك مغناطيسي. الخطوة الثانية هي إضافة مخزن البروتين ومزيج من وسطاء الأكسدة والاختزال المختلفة إلى وعاء المعايرة بالتحليل الحجمي.

بعد ذلك ، يتم استخدام اختزال كيميائي ومؤكسد لضبط إمكانات لقيم مختلفة ويتم أخذ عينات الرنين المغناطيسي الإلكتروني أو EPR. الخطوة الأخيرة هي تسجيل أطياف EPR للعينات وإعداد منحنيات المعايرة بالتحليل الحجمي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية لأساليبنا الحالية ، مثل القياس عن بعد الكامل ، هي أنه يمكن تحليل البروتينات المعقدة ذات العوامل المساعدة المختلفة المتعددة بسهولة.

لبدء هذا الإجراء، قم بتوصيل القطب المرجعي لكلوريد الفضة وقطب سلك بلاتيني بوعاء معايرة الأكسدة والاختزال. ثم قم بتوصيل كلا القطبين بمقياس فولت يمكن قياسه من مللي فولت إلى فولت. أدخل قضيب تقليب صغير وضع وعاء المعايرة فوق الستيراه المغناطيسي.

بعد ذلك، املأ وعاء المعايرة بالتحليل الحجمي بمحلول مزيج وسيط عازل B معد مسبقا ومحلول بروتين يصل إلى ملليلترين لإعطاء تركيزات نهائية من 72 بروتين ميكرومولار و38 ميكرومولار لكل وسيط. بعد التقليب لمدة 30 دقيقة ، قم بتشغيل مقياس الفولت. أدخل 10 أنابيب EPR كوارتز نظيفة في غرفة لاهوائية.

ثم املأ فاعل النيتروجين السائل الصغير بالنيتروجين السائل. بعد الانتظار حتى تصبح إمكانات المحلول مستقرة ، لاحظ الإمكانات التي يقدمها مقياس الفولت بعد ذلك. ارسم العينة الأولى المكونة من 200 ميكرولتر وحقنها في أنبوب EPR.

قم بتغطية الأنبوب بسدادة مطاطية وقم بإزالة الأنبوب من الغرفة اللاهوائية. قم بتجميد الأنبوب عن طريق إدخال الطرف ببطء في النيتروجين السائل. بمجرد سماع صوت هسهسة ، أدخل باقي الأنبوب ببطء حتى يتم غمر جزء العينة بالكامل.

أضف لترين إلى ميكرولترين من محلول تيت الصوديوم المحضر مسبقا بمللي مولار إلى المحلول الموجود في وعاء المعايرة بالتحليل الحجمي لخفض إمكانات المحلول إلى سالب 0.6 فولت. بعد رسم عينة ، لاحظ الإمكانات الفعلية التي يقدمها مقياس الفولت لزيادة الجهد بحوالي 50 مللي فولت. أضف لترين إلى ميكرولترين من محلول سيانيد الصوديوم المحضر مسبقا.

لتسجيل أطياف EPR لعينات المعايرة بالتحليل الحجمي المختلفة، قم بإخلاء ناظم البرد الكوارتز إلى أقل من 10 إلى سالب خمسة بار. باستخدام مفتاح مضخة تفريغ عالية على جهاز تبريد المياه لمغناطيس EPR ، ثم افتح تدفق الهواء الجاف عبر تجويف EPR. بعد تشغيل مصدر الطاقة للمغناطيس وكمبيوتر EPR ، قم بتشغيل برنامج معايرة التردد.

عند الانتهاء ، اضبط معلمات قياس EPR. بعد ذلك ، قم بتوصيل عامل الهيليوم السائل بناتج البرد لتبريد التجويف إلى تسعة إلى 16 كلفن. أدخل عينة EPR في التجويف ، ثم سجل طيف EPR.

أخيرا ، ارسم سعة إشارة EPR بقيمة G المميزة للأنواع المغناطيسية ذات الأهمية مقابل إمكانات تم تحديد ثلاثة حديد ، وأربعة عنقود كبريت ، وأربعة عنقود كبريت ، وأربعة عنقود كبريت ، ومركز حديد أحادي النواة على أنها عوامل مساعدة نشطة للأكسدة والاختزال. في التقدير الكمي الأول لإشارات EPR ، أشار إلى أن الحديد الأربعة وأربعة عنقود الكبريت والحديد أحادي النواة متساوي المولار عند حوالي 60٪ من تركيز البروتين وأن محتوى عنقود الحديد الأربعة الثلاثة هو 5٪ فقط ، من المرجح أن تكون مجموعة الحديد الأربعة من الحديد ناتج تحلل ومجموعة غير مكتملة. تم تحديد إمكانات نقطة المنتصف للعوامل المساعدة المختلفة لتكون موجبة 0.003 فولت لمركز الحديد أحادي النواة.

الزوجان سالب 0.1 25 فولت للزوجين الحديديين الأربعة والحديد الأربعة وبين سالب 0.45 والنقطة السالبة 50 فولت للزوجين الأربعة من الحديد الأربعة. تشير الإمكانات المنخفضة لمجموعة الحديد الأربعة الكبريت إلى أنها لا تحتوي على لفة أكسدة واختزال في البروتين حيث سيكون من الصعب جدا تقليل العنقود. يمكن تقليل مركز الحديد أحادي النواة أو أكسدته في السيتوبلازم ، مما يجعل لفة الأكسدة والاختزال لهذا المركز ممكنة.

أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر أنه يمكن إجراء المعايرة بالتحليل الحجمي في اتجاه مؤكسد أو مختزل. يعتمد الخيار الأفضل على استقرار عامل السعال في ظل حالات الأكسدة والاختزال المختلفة.