استخراج السم والسم الغدة Microdissections من العناكب عن البروتين وتحليلات Transcriptomic

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخلاص السم وتشريح الغدد السمية من العناكب لإجراء دراسات ترانسكريبتومية وبروتيومية، ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير المعدات والكواشف اللازمة لجمع السم عن طريق التحفيز الكهربائي. وتتمثل الخطوة الثانية في تثبيت عنكبوت مُخدر باستخدام ملقط تحت مجهر تشريحي. بعد ذلك، يتم تعريض العنكبوت لنبضات تيار كهربائي وجمع السم المُفرز بواسطة أنبوب شعري دقيق.

تتمثل الخطوة النهائية في تشريح الغدد السمية للعنكبوت بعد يومين إلى ثلاثة أيام. وفي النهاية، يُستخدم مطياف الكتلة أو تحليلات بروتيومية أخرى للسم لإظهار تسلسلات البروتينات المكونة له. ويُعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن خطوات جمع السم يصعب تعلمها نظراً لأنها تتضمن سلسلة من الإجراءات المنسقة التي يجب تنفيذها بسرعة وبدقة في آن واحد.

للبدء، قم بتوصيل سلك الطاقة الخاص بالمحفز الكهربائي بمأخذ التيار، وقم بتوصيل دواسة القدم الخارجية بمدخل الإشارة الخارجي. بعد ذلك، تأكد من أن مفتاح القطبية في الوضع الطبيعي، وقم بتوصيل القطب الموجب بطرف المخرج الأحمر في المحفز الكهربائي، وقم بتوصيل القطب السالب بطرف المخرج الأسود. ثم اضبط المحفز وفقاً للإعدادات الأولية الموصى بها التالية.

اختبر مخرج القطب الكهربائي عن طريق توصيل مشابك التمساح بأطراف جهاز قياس الجهد الموجبة والسالبة. ثم قم بتشغيل مفتاح طاقة المحفز ومرر التيار باستخدام دواسة القدم. قم بتجهيز الملقط خفيف الوزن عن طريق طلاء أحد الشوكتين بالبلاستيك السائل والانتظار لمدة أربع ساعات حتى يجف الطلاء؛ وبعد جفاف البلاستيك، قم بلف طبقة واحدة من خيط الخياطة القطني بإحكام حول 15 millimeters من طرف الشوكة المقابلة في القطب AP، وثبت الخيط بربط الطرف في عقدة.

بعد ذلك، وباستخدام مقص حاد، يتم قطع طرف إبرة تحت الجلد غير مدببة، بحيث يكون القطع صغيراً بما يكفي لعدم إيذاء العنكبوت، وكبيراً بما يكفي لتجنب الانسداد. يتم تنعيم الفتحة باستخدام ورق صنفرة وتثبيت الإبرة في مصيدة نفايات مفرغة من الهواء. ثم يتم وضع ملقط الوزن الريشي أفقياً في وضعية إغلاق محكمة باستخدام مشبك ثنائي الشعب مغطى بالفينيل ومثبت بقاعدة مغناطيسية تحت مجال رؤية مجهر تشريحي، بحيث تكون الشعبة المغطاة بالبلاستيك في الأعلى والشعبة المغطاة بالخيط في الأسفل.

بعد ذلك، قم بتوصيل مشبك تمساح للقطب الموجب بالسن السفلي الموجود قبل الخيط، وقم بتوصيل مشبك تمساح سالب بإبرة التفريغ المعدنية غير المدببة. ثم ضع السلك الموجب على سن الملقط بين الخيط ومشبك التمساح، والسلك السالب على إبرة التفريغ غير المدببة. لاختبار تيار دائرة مقياس الجهد، اضغط على دواسة القدم للتأكد من اكتشاف تيار كافٍ، ثم قم بإزالة الأسلاك مع ارتداء نظارات واقية.

قم بتجهيز عدة أنابيب شعرية دقيقة لجمع السم. بعد ذلك، ضع شريطاً من معجون التثبيت في طبق بتري وأسند الأنابيب الشعرية الدقيقة على الشريط. باستخدام يد ترتدي قفازاً، أمسك طرفاً واحداً من أنبوب شعري دقيق وأمسك الطرف الآخر بملقط معدني معقم فوق لهب موقد بنزن، ثم اسحب الطرف بعيداً عن اللهب لإنشاء طرف مستطال بينما يظل الطرف الآخر في وضع ثابت، وافحص نهايات الأنابيب الشعرية الدقيقة تحت مجهر تشريحي، ثم اصنع فتحة مائلة صغيرة عند الطرف المسحوب باستخدام ملقط معدني معقم.

أغلق الأنابيب وضعها على الثلج. لبدء تثبيت العنكبوت، قم بتشغيل غاز غرفة CO2. ثم انقل العنكبوت باستخدام ملقط معدني طويل من وعاء الجمع البلاستيكي المغلق إلى غرفة CO2.

اترك العنكبوت في الحجرة لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق، وتحقق من توقفه عن الحركة عن طريق وخزه برفق باستخدام ملقط طويل. بعد ذلك، استخدم ماصة نقل تحتوي على محلول ملحي لترطيب طرف الملقط.

بعد ذلك، استخرج العنكبوت المخدر من غرفة CO2 عن طريق رفعه من أرجله الأمامية. وباستخدام ملقط تشريح غير مدبب ويدين ترتديان القفازات، انقل العنكبوت المخدر إلى جهاز ملقط الوزن الريشي. ثم باعد بين شوكتي ملقط الوزن الريشي المغلق وضع الصدر الرأسي للعنكبوت بين الشوكتين.

اسمح للأطراف بالإغلاق لضمان تثبيت العنكبوت بإحكام في مكانه دون سحقه. تأكد بسرعة من وضع العنكبوت بحيث يكون الجانب الظهري للدرع متجهًا للأسفل، مستندًا على الطرف المغطى بالخيط، بينما يواجه الجانب البطني للدرع الغطاء البلاستيكي، مع بقاء القطب الموجب متصلاً بالطرف السفلي. بعد ذلك، اضبط تكبير المجهر التشريحي والتركيز ومصدر الضوء حتى تصبح غدد السم وأنياب العنكبوت مرئية بوضوح. لبدء جمع السم، قم بتشغيل المكنسة الكهربائية ورش غدد السم في العنكبوت بالماء.

باستخدام إبرة محقنة ثانية ذات طرف غير مدبب، قم بشفط الماء باستخدام إبرة تفريغ لإزالة الشوائب. بعد ذلك، قم بملامسة إبرة التفريغ ذات القطب السالب إلى خرطوم العنكبوت وقم بإرسال نبضة باستخدام دواسة القدم. ستنقبض أرجل العنكبوت وسيظهر السم على شكل قطرات شفافة تخرج من الأنياب.

قم بشفط المواد المرتجعة إذا لزم الأمر. ثم اجمع قطرات السم باستخدام طرف الشعيرة المجهرية وانقل طرف الشعيرة إلى أنبوب سعة 0.5 milliliter يحتوي على ماء، والذي سيتم سحبه إلى داخل الشعيرة. تجنب وخز العنكبوت بالشعيرة أو تلوث الشعيرة بالحرير والغراء من المغازل.

بعد ذلك، قم بتوصيل محقنة النقل المزودة بمحول أنبوب بالشعيرة الدقيقة في الطرف المقابل لطرف الجمع، ثم فرغ محلول السم مرة أخرى في الأنبوب وضع الأنبوب على الثلج، واحفظ الأنابيب التي تحتوي على السم في درجة حرارة minus 80 degrees Celsius. عند الانتهاء من عملية جمع السم، ضع قارورة جمع بلاستيكية مفتوحة مع غطائها بالقرب من العنكبوت. وللنقل السريع، أمسك أرجل العنكبوت بعناية باستخدام ملقط تشريح غير مدبب في إحدى اليدين، وافتح ملقطاً خفيف الوزن بعناية باليد الأخرى.

بعد ذلك، انقل العنكبوت إلى أنبوب الجمع باستخدام ملقط غير مدبب. وأغلق الغطاء بسرعة. وبعد يومين إلى ثلاثة أيام من جمع السم، قم بتخدير العنكبوت في غرفة CO2، ثم املأ حامل النيتروجين السائل وضعه بجانب مجهر التشريح. قم بتنظيف منطقة التشريح والملقط باستخدام RNA away.

بعد ذلك، املأ طبق بتري صغير بمحلول سترات الصوديوم الملحي بتركيز 1x، وضعه تحت المجهر التشريحي. بعد ذلك، انقل العنكبوت من غرفة CO2 إلى طبق بتري، واستخدم الملقط لفصل الصدر الرأسي بسرعة عن البطن. ثم ثبت الصدر الرأسي تحت المجهر التشريحي باستخدام الملقط، ووجه الغدد الملحقة لتكون داخل مجال الرؤية.

استخدم الأطراف الحادة لزوج ثانٍ من الملاقط لقطع البشرة التي تربط القاعدة بالجوانب الجانبية للمجمع جانبياً. أمسك المجمع بالزوج الثاني من الملاقط واسحبه بلطف ذهاباً وإياباً حتى تُسحب الغدد السمية إلى الخارج. على ألا تستغرق هذه العملية أكثر من 15 minutes.

افصل الغدد عن الجسم وانقلها إلى أنبوب حفظ مبرد سعة 0.5 milliliter. ضع الأنبوب المغلق في النيتروجين السائل، مع دمج تقنيات مطيافية الكتلة مع قواعد بيانات التسلسل الناتجة من مكتبات CD NA للغدد السامة، مما أتاح تحديد بروتينات السم. كان الببتيد Laro inept أحد 36 بروتيناً تم تحديدها من سم الأرملة السوداء باستخدام مطيافية الكتلة.

لا تنسَ أن التعامل مع العناكب مثل الأرملة السوداء يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل ارتداء القفازات الواقية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.