استخراج السم والسم الغدة Microdissections من العناكب عن البروتين وتحليلات Transcriptomic

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخراج السم وتشريح الغدد السمية من العناكب لإجراء دراسات النسخ والبروتينات ، ويتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد المعدات والكواشف اللازمة لجمع السم عن طريق التحفيز الكهربائي. الخطوة الثانية هي شل حركة عنكبوت مخدر بالملقط تحت مجهر تشريح. بعد ذلك ، ينبض العنكبوت بالتيار ويتم جمع السم المنبعث بأنبوب شعري صغير.

الخطوة الأخيرة هي تشريح الغدد السامة للعنكبوت بعد يومين إلى ثلاثة أيام. في النهاية ، يتم استخدام قياس الطيف الكتلي أو التحليلات البروتينية الأخرى للسم لإظهار تسلسل بروتينات السم المكونة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات جمع السموم لأنها تتضمن سلسلة من الإجراءات المنسقة التي يجب إجراؤها بسرعة وبعناية.

للبدء ، قم بتوصيل سلك طاقة محفز كهربائي بمأخذ وقم بتوصيل دواسة القدم الخارجية بمدخل إشارة خارجي. بعد ذلك ، تأكد من أن مفتاح القطبية في الوضع العادي وقم بتوصيل القطب الموجب بطرف الإخراج الأحمر على المحفز الكهربائي وقم بتوصيل القطب السالب بطرف الإخراج الأسود. ثم اضبط المحفز على الإعدادات الأولية الموصى بها التالية.

اختبر إخراج القطب عن طريق ربط مشابك التمساح بمقياس الفولت الموجب والسالب. ثم قم بتشغيل مفتاح طاقة المحفز وقم بتوصيل التيار باستخدام دواسة القدم. قم بإعداد ملقط وزن الريشة عن طريق طلاء شق واحد بالبلاستيك السائل وانتظر أربع ساعات حتى يجف الطلاء بعد أن يجف البلاستيك ملفوفا بإحكام 15 ملم من طرف الشق المقابل AP بطبقة واحدة من خيوط الخياطة القطنية وقم بتأمين الخيط عن طريق ربط النهاية في عقدة.

بعد ذلك ، باستخدام مقص حاد ، قم بقص طرف إبرة تحت الجلد الحادة ، صغيرة بما يكفي لعدم الإضرار بالعنكبوت ، لكنها كبيرة بما يكفي لتجنب الانسداد. قم بتنعيم الفتحة بورق الصنفرة وقم بتوصيل الإبرة بمصيدة نفايات التفريغ. ثم ضع ملقط وزن الريشة أفقيا في وضع مغلق بإحكام باستخدام مشبك ذو شقين مغطى بالفينيل مثبت بقاعدة مغناطيسية تحت مجال رؤية المجهر التشريح مع الشق المطلي بالبلاستيك في الأعلى والشق المطلي بالخيط في الأسفل.

بعد ذلك ، قم بإرفاق مشبك التمساح الكهربائي الموجب بالشق السفلي من الخيط ، وقم بإرفاق مشبك التمساح السالب بإبرة التفريغ المعدنية الحادة. ثم ضع الرصاص الموجب على شق الملقط بين الخيط ومشبك التمساح والرصاص السالب على إبرة التفريغ الحادة. لاختبار تيار دائرة مقياس الفولت ، اضغط على دواسة القدم لضمان اكتشاف تيار كاف ، وقم بإزالة الخيوط أثناء ارتداء النظارات الواقية.

قم بإعداد العديد من الأنابيب الشعرية الدقيقة لجمع السم. بعد ذلك ، ضع شريط معجون متصاعد في طبق بتري وقم بإراحة الشعيرات الدموية الدقيقة على الشريط. بيد مرتدية قفازا ، أمسك أنبوبا شعريا صغيرا واحدا في أحد طرفيه وأمسك الطرف الآخر بملقط معدني معقم فوق لهب موقد بنسن واسحب الطرف بعيدا عن اللهب لإنشاء طرف ممدود أثناء تثبيت الطرف الآخر في وضع ثابت ، وافحص النهايات الشعرية الدقيقة تحت مجهر تشريح وقم بإنشاء فتحة صغيرة مشطوفة في الطرف المسحوب باستخدام ملقط معدني معقم.

أغلق الأنابيب وضعها على الجليد. لبدء تثبيت العنكبوت ، قم بتشغيل غاز غرفة CO2. ثم انقل العنكبوت بملقط معدني طويل من قارورة التجميع البلاستيكية المغلقة إلى حجرة CO2.

احتفظ بالعنكبوت في الغرفة لمدة خمس إلى 10 دقائق وتأكد من أن العنكبوت لم يعد يتحرك. حثه برفق باستخدام ملقط طويل. ثم استخدم ماصة نقل بمحلول ملحي لترطيب الخيط على الملقط.

بعد ذلك ، استرجع العنكبوت المخدر من حجرة ثاني أكسيد الكربون عن طريق التقاطه من ساقيه الأماميتين. باستخدام ملقط تشريح حاد وأيدي مرتدية قفازات ، انقل العنكبوت المخدر إلى جهاز ملقط وزن الريشة. ثم افصل شوكات ملقط وزن الريشة المغلق وضع العناكب الرأسية بين الشوكات.

اترك الشوكات تغلق للتأكد من تثبيت العنكبوت بإحكام في مكانه ولكن لا يتم سحقه تأكد بسرعة من وضع العنكبوت على جانب الظهر الرسلي لأسفل ، ويستريح على الشق المطلي بالخيط ، وأن الجانب البطني للسيارة يواجه الطلاء البلاستيكي بينما يظل القطب الموجب متصلا بالشق السفلي. بعد ذلك ، اضبط تركيز تكبير المجهر التشريحي ومصدر الضوء حتى تظهر العناكب والأنياب بوضوح. لبدء جمع السم ، قم بتشغيل المكنسة الكهربائية ورش منجم العنكبوت بالماء.

باستخدام إبرة حقنة ثانية ذات طرف حاد ، قم بشفط الماء بإبرة مفرغة لإزالة الشوائب. بعد ذلك ، المس الإبرة المفرغة مع القطب السالب إلى منصة العنكبوت وقم بتوصيل نبضة بدواسة القدم. سوف تنقبض أرجل العنكبوت وسيكون السم مرئيا على شكل قطرات صافية تخرج من الأنياب.

قم بالمكنسة الكهربائية والقلس إذا لزم الأمر. ثم اجمع قطرات السم بالطرف الشعري الصغير وانقل الطرف الشعري إلى أنبوب 0.5 مليلتر بالماء ، والذي سيتم امتصاصه في الشعيرات الدموية. تجنب ثقب العنكبوت بالشعيرات الدموية وتلوث الشعيرات الدموية بالحرير والغراء من المغازل.

بعد ذلك ، قم بتوصيل حقنة النقل بمحول الأنبوب بالشعرية الدقيقة في النهاية المقابلة لطرف التجميع وقم بتوزيع محلول السم مرة أخرى في الأنبوب وضع الأنبوب على سم مخزن الثلج الذي يحتوي على أنابيب عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. عند الانتهاء ، عند الانتهاء من جمع السموم ، ضع قارورة تجميع بلاستيكية مفتوحة مع غطاءها بالقرب من العنكبوت. للنقل السريع ، أمسك ساقي العنكبوت بعناية باستخدام ملقط تشريح حاد ممسكا بيد واحدة وافتح ملقط وزن الريشة بعناية باليد الأخرى.

ثم حرك العنكبوت في قارورة التجميع باستخدام ملقط حاد. وأغلق الغطاء بسرعة بعد يومين إلى ثلاثة أيام من جمع السم ، وقم بتخدير العنكبوت في حجرة ثاني أكسيد الكربون ، ثم املأ حاملا للنيتروجين السائل وضعه بجوار مجهر تشريح. نظف منطقة التشريح والملقط باستخدام الحمض النووي الريبي بعيدا.

ثم املأ طبق بتري صغيرا بواحد × سترات الصوديوم المالحة ، وضعه تحت المجهر التشريح. بعد ذلك ، انقل العنكبوت من حجرة CO2 إلى طبق بتري واستخدم الملقط لفصل الثاكس الرأسي بسرعة عن البطن. ثم أمسك الثاكس الرأسي تحت مجهر التشريح بالملقط وضع الفحم في مجال الرؤية.

استخدم الأطراف الحادة لزوج ثان من الملقط لقطع البشرة التي تربط البازرة بالجوانب الجانبية لمنجم الفحم بشكل جانبي. أمسك الفحم بالزوج الثاني من الملقط واسحب برفق ذهابا وإيابا حتى يتم سحب الغدد السمية. لا يستغرق أكثر من 15 دقيقة.

افصل الغدد عن منجم الفحم وانقلها إلى أنبوب آمن بالتبريد سعة 0.5 مل. ضع الأنبوب المغلق في النيتروجين السائل ، مع دمج تقنيات قياس الطيف الكتلي مع قواعد بيانات التسلسل التي تم إنشاؤها من غدة السم CD NA. مكنت المكتبات من تحديد بروتينات السم. كان ببتيد Laro غير الكفء واحدا من 36 بروتينا تم تحديده من سم الأرملة السوداء باستخدام قياس الطيف الكتلي.

لا تنس أن العمل مع العناكب مثل الأرامل السود يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات الواقية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.