نقل بروتون والبروتين التشكل حيوية في وقت حساس البروتينات عن طريق حل خطوة المسح الضوئي فورييه، تحويل الأشعة تحت الحمراء الطيفي

الهدف العام من هذا الإجراء هو استقصاء ديناميكيات البروتونية والتغيرات التشكيلية لبروتيني غشاء حساسين للضوء باستخدام مطيافية الأشعة تحت الحمراء بتحويل فورير (FTIR) بمسح STEP المعتمد على تحليل الزمن. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تكوين فيلم بروتيني رطب يتم استقصاء امتصاصه للأشعة تحت الحمراء إما في تكوين الانعكاس الكلي الموهن لبروتين البكتيريوبسين، أو في تكوين النفاذية لبروتين Channelrhodopsin-2. وتتمثل الخطوة الثانية في تحفيز العينة بومضة ليزر نانوسانية بطول موجي مناسب لبدء تفاعل دوري ضوئي في البروتين، مع رصد التغيرات المعتمدة على الزمن في شدة الأشعة تحت الحمراء المتفاعلة مع العينة.

بعد ذلك، تتكرر العملية المذكورة أعلاه عند مواضع محددة للمرآة المتحركة في مقياس التداخل الذي يتحكم في فرق المسار الضوئي بين شعاعين منفصلين حتى يتم تسجيل مخطط تداخل كامل ومحلل زمنياً. وتتمثل الخطوة النهائية في تحويل مخطط التداخل المحلل زمنياً إلى أطياف امتصاص تفاضلية بالأشعة تحت الحمراء (IR) محللة زمنياً باستخدام تحويل فوريه وقانون لامبرت-بير. وفي الختام، يتم فحص التطور الزمني للنطاقات، وخاصة في منطقة MI ومنطقة الروابط المزدوجة CO في الكربوكسيل، للحصول على ديناميكيات التغيرات التشكيلية وتغيرات البروتونية في البروتين.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بمعظم الطرق التجريبية الحالية في قدرتها على تحليل تغيرات البروتونات العابرة في البروتينات. علاوة على ذلك، فإنها تقوم بذلك على مقاييس زمنية بالميكروثانية والميلي ثانية، وهو النطاق الزمني الأكثر صلة لدراسة الوظائف البروتينية. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال الفيزياء الحيوية الجزيئية وعلوم البروتين، مثل تحديد أي الثمالات التي تتبرتن وتوقيت حدوث ذلك أثناء الآلية الوظيفية للبروتين، أو متى تحدث التغيرات الرئيسية في البروتينات.

سيقوم فيكتور ريا، الباحث المساعد من مختبري، بتوضيح الإجراء. أولاً، قم بتركيب ملحق الانعكاس الكلي الموهن (ATR) في حجرة العينات بجهاز مطياف FTIR. قم بقياس طيف طاقة واسع المدى بدقة 4 cm⁻¹ لسطح عنصر الانعكاس الداخلي النظيف باستخدام مطيافية FTIR التقليدية سريعة المسح. غطِّ سطح الـ ATR بـ 20 µL من المحلول المنظم عالي القوة الأيونية الذي سيُستخدم لاحقاً لإعادة ترطيب العينة.

بعد ذلك، قم بقياس امتصاص الأشعة تحت الحمراء (IR) للمنظم. ثم، أزل المنظم واشطف السطح بالماء مع تجنب لمسه. تخلص من السائل المتبقي عن طريق تدفق هواء قوي، ثم وزع حوالي 3 µL من محلول بروتيني بتركيز 6 mg/mL لبكتيريا Rodin في الغشاء الأرجواني فوق السطح.

جفف معلق البروتين تحت تيار خفيف من الهواء الجاف حتى تتكون طبقة رقيقة. ثم قم بقياس طيف الامتصاص للطبقة الجافة. بعد ذلك، أضف بلطف من 20 إلى 40 µL من المنظم ذو القوة الأيونية العالية لإعادة ترطيب الطبقة الجافة.

قم بتغطية حامل A TR بغطاء لمنع تبخر الماء وقياس طيف الامتصاص. قدّر النسبة المئوية للعينة المتبقية بالقرب من السطح بعد إعادة ترطيب الغشاء عن طريق طرح طيف امتصاص المنظم. في هذه المرحلة، أضف 10 µL من channel opsin two المذاب في dec alside في منظم منخفض القوة الأيونية في مركز نافذة من فلوريد الباريوم بقطر 20 mm.

قم بنشر المحلول بمساعدة طرف الماصة الدقيقة ليكون بقطر يتراوح من ستة إلى ثمانية مليمترات باستخدام تدفق لطيف من الهواء الجاف لتكوين غشاء متجانس دافئ يكون قطره مطابقاً تقريباً لحجم شعاع IR عند أكبر فتحة. بعد ذلك، استخدم حلقة دائرية مسطحة من السيليكون بسمك واحد مليمتر. قم بترطيب الغشاء بإضافة من ثلاثة إلى خمسة ميكرولتر من خليط من الجلسرول والماء موزعة على شكل ثلاث إلى خمس قطرات حول الغشاء الجاف، ثم أغلقه بإحكام باستخدام نافذة ثانية.

ضع نوافذ فلوريد الباريوم ذات التصميم الشطيري في الحامل. ثم ضع الحامل في حجرة العينات. قم بقياس طيف الامتصاص.

تأكد من أن أقصى امتصاص في منطقة الأميد الأول يقع في المدى من 0.6 إلى 1.0 لإعداد A TR. استخدم ليفاً بصرياً موضوعاً فوق غطاء A TR لربط الليزر بالعينة. اضبط كثافة طاقة الليزر عند العينة لتكون من 2 إلى 3 millijoules per square centimeter per pulse.

باستخدام مقياس القدرة أو تجارب النفاذية، استخدم المرايا لتوجيه الليزر إلى العينة، وإذا لزم الأمر، استخدم العدسات سواء لتجميع أو تحويل شعاع الليزر إلى قطر يزيد قليلاً عن حجم غشاء العينة. قم بمزامنة نبضة الليزر مع تسجيل البيانات باستخدام مفتاح Q. استخدم نبضة Sync out TTL الخاصة بإلكترونيات ليزر neodymium dope atrium aluminum garnet لتحفيز المحول التماثلي الرقمي في المطياف.

اضبط معدل استثارة الليزر لإجراء قياسات المسح التدريجي ذات الدقة الزمنية في المدى الطيفي من 1800 إلى 850 inverse centimeter. ضع مرشحاً ضوئياً منخفض التمرير في المسار الضوئي بحيث يكون عاتماً فوق 1,950 inverse centimeters، وذا نفاذية جيدة تحت 1800 inverse centimeters.

بعد ذلك، قم بتغيير وضع الكاشف من الاقتران المتردد (AC) إلى الاقتران المستمر (DC). في هذه المرحلة، اجعل مستوى التيار المستمر لمخطط التداخل (INTERFEROGRAM) صفراً عن طريق تطبيق جهد انحياز للتيار على الكاشف. أعد ضبط الكسب الإلكتروني لتحقيق استفادة أفضل من النطاق الديناميكي للمحول التناظري الرقمي.

بعد ذلك، ابدأ قائمة المسح المرحلي (step scan) في جهاز مطياف FTIR. اضبط عرض النطاق الطيفي المستهدف لقياس المسح المرحلي ليكون ثمن عدد موجة ليزر الهيليوم والنيون. واضبط الدقة الطيفية ودقة الطور على 8 cm⁻¹ و 64 cm⁻¹ على التوالي.

اختر دالة appe. ثم اضبط وضع استحصال INTERFEROGRAM على "single side forward". اضبط معدل أخذ العينات للمحول التناظري الرقمي على أعلى قيمة متاحة في جهاز المطياف.

اضبط مشغل التجربة على الوضع الخارجي. ثم حدد عدد نقاط البيانات الموزعة خطياً المراد تسجيلها، بما في ذلك 100 نقطة ما قبل التشغيل. بعد ذلك، حدد عدد مرات التكرار أو عدد متوسطات التفاعل الضوئي لكل موضع للمرآة، ثم ابدأ التجربة.

أخيرًا، كرر التجربة 10 مرات لكل من البكتيريا والريدسين (redsin)، و35 مرة على ثلاثة أغشية عينات مختلفة للقناة redsin 2 للحصول على ما يقرب من 200 إضافة مشتركة لكل موضع مرآة. يمكن تمييز النطاقات المميزة لاهتزازات أميد الرابطة الببتيدية في طيف امتصاص الرغوة الجافة للبكتيريا والريدسين. عند استخدام محاليل منظمة ذات قوة أيونية منخفضة، يتمدد الغشاء بشكل مفرط مما يقلل من كمية البروتين التي يتم فحصها بواسطة المجال المتلاشي. سيعتمد الاعتماد الدقيق بين انتفاخ الغشاء والقوة الأيونية للمحلول المنظم على طبيعة الليبيدات، من بين عوامل أخرى.

يتطلب انتفاخ الغشاء بعد الإماهة وقتاً للوصول إلى حالة الاستقرار لبكتيريا dosin. وفي الغشاء الأرجواني، تكون هذه العملية أحادية الأسية بثابت زمني قدره 12 دقيقة. يوضح المخطط ثلاثي الأبعاد تجربة FDIR نموذجية بمسح خطوي بدقة زمنية على البكتيريا.

يظهر هنا مركب Redsin. ويمكن استخلاص الأطياف في أوقات محددة، على سبيل المثال، عندما يُتوقع أن تصل الحالات الوسيطة في الدورة الضوئية لمركب redsin في البكتيريا إلى أعلى مستوى من التعداد.

في البكتيريا العصوية Dossin، تظهر آثار الزمن لدورة التصوير تغييرات في الامتصاصية عند 1,762 سم⁻¹. وتكشف التقارير عن ديناميكيات البروتونات وإزالة البروتونات لـ aspartate 85، وعند 1,741 سم⁻¹ عن تغييرات الروابط الهيدروجينية وديناميكيات إزالة البروتونات وإعادة البروتونات لـ aspartic acid.96. وتظهر آثار الزمن عند 1,670 و 1,555 سم⁻¹.

أبلغ عن التغيرات في اهتزازات MI الأولى والثانية، وكلاهما حساس للشكل التأكيدي للهيكل الببتيدي. باتباع هذه الطريقة، يمكن تنفيذ تقنيات أخرى مثل تكوين الخلايا العصبية الموجه موقعياً أو مطيافية إنزيم الشبكية من أجل تعيين النطاق الاهتزازي لبقايا محددة في البروتين بعد تطويره. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الفيزياء الحيوية الجزيئية لاستكشاف الآلية الوظيفية للعديد من البروتينات المختلفة التي تعمل بالضوء.