نقل بروتون والبروتين التشكل حيوية في وقت حساس البروتينات عن طريق حل خطوة المسح الضوئي فورييه، تحويل الأشعة تحت الحمراء الطيفي

الهدف العام من هذا الإجراء هو استكشاف ديناميكيات البروتون والتغيرات التأكيدية لبروتينين غشائيين حساسين للصور باستخدام التنظير الطيفي FTIR للمسح الضوئي STEP الذي تم حله بمرور الوقت. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشكيل فيلم بروتيني رطب أولا سيتم فحص امتصاصه بالأشعة تحت الحمراء إما في تكوين انعكاس كلي موهن لبكتيريا opsin ، أو في تكوين نقل لقناة Rodin الثانية. تتمثل الخطوة الثانية في إثارة العينة بومض ليزر نانو ثانية بطول موجي مناسب لبدء تفاعل دوري ضوئي في وقت الكشف عن البروتين الذي يحل التغيرات في شدة ضوء الأشعة تحت الحمراء الذي يتفاعل مع العينة.

بعد ذلك ، يتم تكرار العملية المذكورة أعلاه في مواضع سرية للمرآة المتحركة لمقياس التداخل الذي يتحكم في فرق المسار البصري بين حزمتين منقسمتين حتى يتم تسجيل مخطط تداخل تم حله في الوقت الكامل. تتمثل الخطوة الأخيرة في تحويل مخطط التداخل الزمني الذي تم حله إلى أطياف امتصاص فرق الأشعة تحت الحمراء التي تم حلها بوقت باستخدام تحويل فورييه وقانون بيرة لامبرت. في النهاية ، يتم فحص التطور الزمني للحظر ، خاصة في MI one وفي المناطق الكربوكسيلية ذات الرابطة المزدوجة لثاني أكسيد الكربون للحصول على ديناميكيات التغيرات التأكيدية والبروتونية في البروتين.

الميزة الرئيسية لتقنية معظم الطرق التجريبية الموجودة هي أنها تحل تغيرات البروتونات العابرة في البروتينات. علاوة على ذلك ، فإنه يفعل ذلك على المقاييس الزمنية الدقيقة والمللي ثانية ، وهو النطاق الزمني الأكثر صلة لاستكشاف وظائف البروتين. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الفيزياء الحيوية الجزيئية وعلوم البروتين ، مثل بقايا البروتونات ومتى تحدث أثناء الآلية الوظيفية للبروتين أو عندما تحدث تغييرات كبيرة في البروتينات.

سيتم توضيح الإجراء بواسطة فيكتور ريا ، مشارك باحث من مختبري ، أول تركيب ، أو الانعكاس الكلي المخفف أو ملحق TR في حجرة العينة في مطياف FTIR. قم بقياس طيف طاقة واسع النطاق عند أربعة سنتيمترات عكسية. دقة سطح عنصر الانعكاس الداخلي النظيف عن طريق التحليل الطيفي للمسح السريع التقليدي FTIR تغطي سطح A TR ب 20 ميكرولترا من المخزن المؤقت عالي القوة الأيونية المستخدم لاحقا لإعادة ترطيب العينة.

ثم قم بقياس امتصاص الأشعة تحت الحمراء للمخزن المؤقت. بعد ذلك ، قم بإزالة العازلة وشطف السطح بالماء دون لمسه. إزالة السائل المتبقي بتدفق هواء مكثف ينتشر تقريبا ثلاثة ميكرولتر من ستة ملليغرام لكل مليلتر محلول بروتين من البكتيريا رودين في غشاء أرجواني على رأس السطح.

جفف معلق البروتين تحت تيار لطيف من الهواء الجاف حتى يتم الحصول على فيلم. ثم قم بقياس طيف امتصاص الفيلم الجاف. بعد ذلك ، أضف برفق 20 إلى 40 ميكرولترا من المخزن المؤقت عالي القوة الأيونية لإعادة ترطيب الفيلم الجاف.

قم بتغطية حامل A TR بغطاء لمنع قياس تبخر الماء وطيف الامتصاص. قم بتقدير النسبة المئوية للعينة المتبقية بالقرب من السطح بعد إعادة ترطيب الفيلم عن طريق طرح طيف الامتصاص للمخزن المؤقت. في هذه المرحلة ، أضف 10 ميكرولترات من قناة opsin اثنين مذابة في dec alside في مخزن مؤقت منخفض القوة الأيونية في وسط نافذة فلوريد الباريوم بقطر 20 ملم.

انشر المحلول بمساعدة طرف الماصة الدقيقة بقطر يتراوح بين ستة إلى ثمانية ملليمترات باستخدام تدفق لطيف للهواء الجاف وغشاء متجانس دافئ له قطر يطابق تقريبا حجم شعاع الأشعة تحت الحمراء في أكبر فتحة عدسة. بعد ذلك ، استخدم حلقة O مسطحة من السيليكون بسمك ملليمتر واحد. قم بترطيب الفيلم عن طريق إضافة ثلاثة إلى خمسة ميكرولترات من خليط الجلسرين والماء الموزع في ثلاث إلى خمس قطرات حول الفيلم الجاف وأغلقه بإحكام بنافذة ثانية.

أدخل النوافذ المحصورة بفلوريد الباريوم في حامل. ثم ضع الحامل في حجرة العينة. قياس طيف الامتصاص.

تأكد من أن الحد الأقصى للامتصاص في منطقة الأميد الأولى يتراوح بين 0.6 إلى 1.0 لإعداد A TR. استخدم ألياف ضوئية موضوعة أعلى غطاء A TR لربط الليزر بالعينة. اضبط كثافة طاقة الليزر في العينة إلى اثنين إلى ثلاثة مللي جول لكل سنتيمتر مربع لكل نبضة.

باستخدام عداد الطاقة أو تجارب الإرسال ، استخدم المرايا لإحضار الليزر إلى العينة ، وإذا لزم الأمر ، العدسات إما لتجميع أو تحويل شعاع الليزر إلى قطر أعلى بقليل من حجم فيلم العينة. قم بمزامنة نبضة الليزر مع تسجيل البيانات باستخدام مفتاح Q. قم بمزامنة نبضة TTL للإلكترونيات من ليزر عقيق الألومنيوم النيوديميوم المنشط لتشغيل مطياف المحول التناظري إلى الرقمي.

اضبط معدل إثارة الليزر لأداء الوقت الذي تم حله. قياسات المسح الضوئي الخطي في النطاق الطيفي العكسي من 1800 إلى 850 سنتيمترا عكسيا. ضع مرشحا بصريا منخفضا في المسار البصري غير شفاف فوق 1,950 سنتيمترا عكسيا، مع انتقال جيد أقل من 1800 سنتيمتر عكسي.

ثم قم بتغيير الكاشف من وضع التيار المتردد إلى الوضع المقترن بالتيار المستمر. في هذه المرحلة ، ارفع مستوى التيار المستمر لمخطط التداخل إلى الصفر عن طريق تطبيق انحياز حالي على الكاشف. أعد ضبط الكسب الإلكتروني للاستفادة بشكل أفضل من النطاق الديناميكي للمحول التناظري إلى الرقمي.

بعد ذلك ، ابدأ قائمة المسح الضوئي للخطوات لمطياف FTIR. اضبط عرض النطاق الترددي الطيفي المستهدف لقياس المسح الضوئي الخطوي على ثمن رقم موجة ليزر النيون الهيليوم. اضبط الاستبانة الطيفية والطورية على ثمانية سنتيمترات عكسية و64 سنتيمترا عكسيا على التوالي.

حدد دالة appe. ثم اضبط وضع اكتساب INTERFEROGRAM على جانب واحد للأمام. اضبط معدل أخذ العينات للمحول التناظري إلى الرقمي على أعلى معدل متاح في مقياس الطيف.

اضبط مشغل التجربة على خارجي. ثم قم بتعيين عدد نقاط البيانات المتباعدة خطيا المراد تسجيلها ، بما في ذلك 100 نقطة تشغيل pret. بعد ذلك ، قم بتعيين عدد الإصدارات المشتركة أو عدد متوسطات تفاعل الصورة لكل موضع مرآة وابدأ التجربة.

أخيرا ، كرر التجربة 10 مرات للبكتيريا ، و redsin ، و 35 مرة على ثلاثة أفلام عينة مختلفة للقناة redsin الثانية للحصول على ما يقرب من 200 إضافة مشتركة لكل موضع مرآة ، يمكن تمييز الحظر المميز من اهتزازات أميت رابطة الببتيد في طيف امتصاص الرغوة الجافة للبكتيريا. عند استخدام مخازن مؤقتة منخفضة القوة الأيونية ، يتمدد الفيلم بشكل مفرط مما يقلل من كمية البروتين التي يتم فحصها بواسطة المجال الزائل. يعتمد الاعتماد الدقيق بين تورم الفيلم والقوة الأيونية العازلة من بين عوامل أخرى على طبيعة الدهون.

تورم الفيلم بعد الترطيب وقتا للوصول إلى الاستقرار لبكتيريا الدوسين. في الغشاء الأرجواني ، تكون العملية أحادية الأسية مع ثابت زمني يبلغ 12 دقيقة. مؤامرة ثلاثية الأبعاد من مسح خطوة تم حلها في الوقت النموذجي ، تجربة FDIR على البكتيريا.

Redsin هنا. يمكن استخراج الأطياف في أوقات محددة. على سبيل المثال ، عندما تكون الدول الوسيطة في دورة صور البكتيريا redsin من المتوقع أن تصل إلى أعلى عدد من السكان.

في البكتيريا قضيب دوسين الصورة دورة الوقت آثار الامتصاص يتغير في 1,762 سنتيمتر عكسية. تقارير عن ديناميكيات إزالة البروتون من الأسبارتات 85 وفي 1 ، 741 سنتيمترا عكسيا عن تغيرات الترابط الهيدروجيني وديناميكيات أمة إزالة البروتون لحمض الأسبارتيك.96. يتتبع الوقت عند 1 ، 670 و 1 ، 555 سنتيمترا عكوسا.

تقرير عن التغييرات في الاهتزازات MI واحد واثنين ، وكلاهما حساس لتأكيد العمود الفقري للببتيد. باتباع هذه الطريقة ، يمكن إجراء تقنيات أخرى مثل تكوين الخلايا العصبية الموجه بالموقع أو التحليل الطيفي لإنزيم الشبكية من أجل تعيين نطاق اهتزازي لمخلفات معينة في البروتين بعد تطوره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الفيزياء الحيوية الجزيئية لاستكشاف الآلية الوظيفية للعديد من البروتينات المختلفة التي تحركها الضوء.