الكمي والحجم التنميط من خارج الخلية عن طريق الحويصلات الانضباطي مقاوم نبض الاستشعار

الهدف العام من التجربة التالية هو قياس كمية وتحديد ملف حجم الحويصلات خارج الخلوية باستخدام استشعار النبض المقاوم القابل للضبط. وتتمثل الطريقة القياسية في مقارنة قياسات حجب التيار المأخوذة من حويصلات خارج خلوية منقاة مع تلك المأخوذة من معايير خرزات البوليسترين. أما النهج الثاني لتوصيف الحويصلات خارج الخلوية فهو تدعيم العينة بخرزات البوليسترين، ويُستخدم هذا النهج عند التعامل مع عينات معقدة مثل الحويصلات خارج الخلوية غير المنقاة.

في وسط استزراع الخلايا، تعكس البيانات الناتجة حجم وعدد الحويصلات خارج الخلوية، سواء كانت منقاة أو غير منقاة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل لطخة ويسترن أو قياس التدفق الخلوي للحويصلات خارج الخلوية المرتبطة بخرزات اللاتكس، في أن هذه الطريقة توصّف الجسيمات مباشرة في السوائل البيولوجية دون الحاجة إلى عزل فيزيائي أو وسم. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص الجدد على هذه الطريقة صعوبة بسبب التباين في أحجام الحويصلات خارج الخلوية.

عند محاولة الكشف عن الحويصلات الأصغر حجماً، قد تتسبب الحويصلات الأكبر في سد الثقب النانوي. لقد أضفنا بعض النصائح والحلول العملية إلى البروتوكول للعودة سريعاً إلى ظروف عمل مناسبة. لقد حاولنا تقليل إنتاج الحويصلات خارج الخلوية وكنا بحاجة إلى طرق لقياس تركيز الحويصلات في المزرعة الخلوية.Snet.

أثناء البحث عن طرق لتوصيف الجسيمات النانوية، توصلنا إلى تقنية TRPS وقمنا بتعديل بروتوكولاتها لتصبح أكثر ملاءمة لتوصيف الـ sles ومزارع الخلايا، والسوائل الطافية، وسوائل بيولوجية أخرى. ابدأ بتوصيل جهاز TRPS بجهاز كمبيوتر مثبت عليه برنامج eyes on control suite. تأكد من تقليل التداخل الكهربائي كما هو موضح في البروتوكول النصي.

الآن، اختر حجم الثقب النانوي (Nanopore). يُعد NP 100 الخيار الأفضل للحويصلات التي يتراوح قطرها بين 70 و200 نانومتر، بينما يمكن استخدام NP 150 للحويصلات التي يتراوح حجمها بين 85 و300 نانومتر. أما NP 200 فهو الأكثر ملاءمة لقياس الحويصلات التي يتراوح قطرها بين 100 و400 نانومتر.

بعد ذلك، اختر جسيمات المعايرة البوليستيرين المكملة لـ NP 100 و NP 150، واختر جسيمات معايرة CPC 100 لـ NP 200. استخدم جسيمات معايرة CPC 200. قم برج جسيمات المعايرة باستخدام جهاز الفورتكس لمدة 30 ثانية.

إذا كانت الجسيمات لا تزال متكتلة، استخدم الموجات فوق الصوتية ثم خفف جسيمات المعايرة في PBS للوصول إلى التركيز المطلوب. وبناءً على حجم الثقب النانوي، يجب أن يكون الحجم النهائي 40 µL على الأقل. الآن، قم بترطيب الخلية السائلة السفلية للجهاز عن طريق إضافة 78 µL من PBS ثم إزالتها فوراً.

يقلل هذا من خطر تكون فقاعات تحت المسام النانوية. بعد ذلك، ضع المسام النانوية بين ذراعي الجهاز. قم بقياس المسافة بين الذراعين المتقابلين باستخدام القدمة ذات الورنية الرقمية.

أدخل هذه القيمة في البرنامج تحت الحقل المسمى stretch، وبمجرد إدخالها، انقر فوق calibrate stretch باستخدام العجلة الجانبية التي تتحكم في المسافة بين الذراعين المتقابلين. قم بتمديد nanopore إلى 47 millimeters. وبمجرد تمديده إلى الحجم المطلوب، أضف 78 µL من PBS إلى الخلية السائلة السفلية.

ابدأ عملية المعايرة بوضع خلية السوائل العلوية فوق الثقب النانوي وتثبيت قفص الحماية. بعد ذلك، أضف 40 µL من جسيمات المعايرة المخففة إلى خلية السوائل العلوية. الآن، طبق ضغطاً موجباً لا يقل عن 0.8 kPa.

باستخدام وحدة الضغط المتغير أو VPM، اختر جهداً موجباً وانقر على زر التشغيل. ثم قم بتقليل التمدد ببطء أثناء تحليل الحصر. هذه الأحداث ناتجة عن جسيمات المعايرة.

مع تناقص التمدد، سيزداد ارتفاع الحصر تدريجياً وبالتالي ستتحسن نسبة الإشارة إلى الضجيج. كما يمكن لزيادة الجهد أن تزيد من ارتفاع الحصر، ولكنها قد تولد أيضاً مزيداً من ضجيج RMS. توقف عن تقليل التمدد عندما تتجاوز عمليات الحصر المرصودة مستويات الخلفية بشكل مناسب كما هو ملاحظ في لوحة تتبع الإشارة.

ثانياً، لاحظ معدل الجسيمات. ومع ذلك، فإن هذا المعيار له حد قطع أقل صرامة؛ حيث ينبغي أن يكون معدل الجسيمات 100 في الدقيقة على الأقل من الناحية المثالية.

ومع ذلك، إذا كان معدل الجسيمات أكبر من 2000 في الدقيقة، فقم بتخفيف العينة وإعادة معايرة الجهاز. فقد يؤدي هذا المعدل المرتفع إلى قياسات غير دقيقة في هذا العرض التوضيحي. يتم توصيف حويصلات خارج خلوية تم تنقيتها مسبقاً من خط خلايا ورم دماغي.

ابدأ بتحميل جسيمات المعايرة في مكبس خلية السوائل العلوية. قم بالتشغيل ثم طبق الضغط باستخدام VPM وسجل بيانات لـ 500 جسيم على الأقل هنا. يتم تطبيق ضغط قدره 0.8 kilopascal.

اختياريًا، يمكن أيضًا إجراء قياس متعدد الضغوط لتحقيق ذلك، وذلك بزيادة الضغط المطبق وتسجيل ملف معايرة ثانٍ. يجب أن تكون زيادات الضغط بمقدار 0.2 kilopascals على الأقل الآن، ثم قم بإزالة العينة من الخلية العلوية وغسل الخلية ثلاث مرات باستخدام 100 µL من PBS في كل غسلة. بعد عمليات الغسل، امسح الخلية السائلة العلوية باستخدام ورق خالٍ من الوبر.

أضف العينة التجريبية بعد ذلك. يجب أن يكون تيار خط الأساس ضمن نطاق 3% من التيار الملحوظ عند قياس جسيمات المعايرة. وفي حال لم يكن كذلك، قم بالنقر على غطاء الحماية أو تدويره، أو اضغط بالمكبس، أو قم بإزالة النانوثقب تماماً وغسله بماء منزوع الأيونات di water.

إذا كان التيار الملحوظ جيداً، يتم تطبيق نفس الضغوط التي طُبقت على جزيئات المعايرة تماماً. بعد ذلك، يتم تسجيل 500 جزيئة على الأقل وحفظ ملف البيانات. أما إذا حدث انقطاع مفاجئ في اكتشاف الجزيئات، أو انخفاض في تيار الخط القاعدي أو زيادة مفاجئة في ضوضاء RMS، فيجب إيقاف التسجيل مؤقتاً ومحاولة تسليك الثقب النانوي.

كما سبق، قم بسحب العينة وإخراجها باستخدام الماصة ذهاباً وإياباً. قم بالنقر على غطاء الحماية أو تدويره، ثم اضغط على المكبس أو قم بإزالة المسام النانوية بالكامل وغسلها باستخدام DI water. وتتمثل استراتيجية أخرى في زيادة تمدد المسام النانوية حتى 47 millimeters وزيادة الضغط من VPM إلى الحد الأقصى لمدة خمس دقائق تقريباً.

يمكن لهذا الإجراء أيضاً إلغاء ربط الـ NPO في البرنامج. انتقل إلى علامة تبويب تحليل البيانات (analyze data) وابدأ في معالجة البيانات من خلال النقر بزر الماوس الأيمن على خيار الملفات غير المعالجة (unprocessed files) واختيار خيار معالجة الملفات (process files). ثم لربط ملفات العينات والمعايرة، انقر فوق مربع الاختيار الموجود بجوار العينة.

في عمود المعايرة، حدد الملفات المقابلة ثم انقر موافق. ستعرض البرمجية خصائص العينات المختلفة مثل الحجم، والتوزيع، ومدد الخط القاعدي، والعرض الكامل عند نصف القيمة القصوى، وتحليلات التركيز.

يُستخدم النهج التالي للعينات التي تؤدي إلى انسداد مفرط عند استخدام الطريقة القياسية في التحضير، مثل السوائل البيولوجية؛ قم بإجراء طرد مركزي لما لا يقل عن 50 µL من المزرعة الخلوية. السائل الطافي الذي يحتوي على الحويصلات خارج الخلية لمدة سبع دقائق عند 300 Gs. قم أيضاً بتحضير عينة ضابطة من الوسط الغذائي وحده بالطريقة نفسها لكل من العينة والعينة الضابطة. انقُل 20 µL من السائل الطافي إلى أنابيب جديدة وأضف 20 µL من PBS و 10 µL من مخزون حبيبات البوليسترين المخففة بحجم 335 nm بتركيز 10 million beads per mL.

قم الآن بإعداد الجهاز كما سبق، باستخدام مسام نانوية من نوع NP 200 وقم بقياس عينة الضبط التي تحتوي على حبيبات فقط في الوسط. أولاً، ولضمان الدقة، يجب تقليل الكشف الخلفي للجزيئات الصغيرة غير الحبيبية إلى أقل من 10% من عمليات الكشف عن الحبيبات. الآن، قم بقياس كل عينة مرة واحدة قبل تسجيل المكررات.

سيؤدي ذلك إلى توزيع ظروف الثقوب النانوية المتغيرة على العينات. يجب قياس كل عينة ثلاث مرات في المجمل من خلال إعادة قياس عينة حبيبات المعايرة فقط لاحقاً. وأثناء تحليل البيانات، استخدم برنامج جداول بيانات لإجراء حسابات التركيز.

يتضمن البروتوكول المكتوب مثالاً على الحسابات. تم تنقية الحويصلات خارج الخلوية من السائل الطافي لمزرعة خلايا U 87 M-G-E-G-F-R-V الثلاثية عن طريق الطرد المركزي الفائق، ثم قياسها باستخدام البروتوكول الموصوف باستخدام حبيبات معايرة بحجم 115 nanometer. وبذلك تم الحصول على توزيع الحجم للحويصلات خارج الخلوية.

تم أيضاً قياس كمية الحويصلات خارج الخلوية مباشرة من السائل الطافي لمزرعة خلايا الورم الأرومي الدبقي، باستخدام نهج بديل يعتمد على إضافة معيار قياسي إلى العينة. وقد لوحظ وجود مجموعتين من الجسيمات النانوية. وبناءً على تقدير الحجم للمجموعتين استناداً إلى المعيار القياسي المعروف، تبيّن أن الحويصلات خارج الخلوية الأصغر حجماً والمعيار القياسي الأكبر حجماً يحددان مجتمع الحويصلات بأنه أكبر من 140 nanometers.

ربما كان من الممكن اكتشاف الحويصلات خارج الخلوية الأصغر حجمًا باستخدام فتحة مسام نانوية أصغر، ولكن كان من المحتمل حدوث انسداد أكبر. بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ساعة إلى أربع ساعات اعتمادًا على عدد العينات التي يتم تحليلها. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن العينات قد تتطلب تعديلات في البروتوكول بناءً على خصائصها.

على سبيل المثال، قد تتطلب العينات التي تحتوي على حويصلات أكبر استخدام مسام نانوية أكبر عند تمدد كبير نسبيًا، كما يمكن تسهيل القياسات عن طريق ترشيح أو طرد مركزي للعينات لإزالة الحطام الخلوي، الذي قد يتسبب في انسداد المسام النانوية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توصيف الحويصلات خارج الخلوية باستخدام تقنية TRPS. وبناءً على عينة الحويصلات خارج الخلوية لديك، يمكنك تطبيق البروتوكول القياسي أو استخدام طريقة الإضافة المعدلة (spike in method).