قناة واحدة الخلية المرفقة تسجيل التصحيح، المشبك

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس التيار الكهربائي من خلال قناة أيونية واحدة. يتم تحقيق ذلك من خلال التعبير الأول غير المتجانس عن القناة الأيونية ذات الأهمية في الخلايا التي يسهل التعامل معها والتي تساعد على الأهداف التجريبية. الخطوة الثانية هي استخدام ماصة مصقولة بالنار للحصول على ختم ثابت على غشاء الخلية.

بعد ذلك ، يجب على المجرب تحديد عدد القنوات الموجودة في التصحيح ، وإذا كان سجل قناة واحدة حاليا ، فإن الخطوة الأخيرة هي معالجة البيانات وتحليلها. في النهاية ، يتم استخدام تسجيل التيار من قنوات الأيونات المفردة للتحقيق في الخصائص الفيزيائية الحيوية التي تعمل بها هذه البروتينات الغشائية ، والتي تشكل الأساس لكيفية تواصل الخلايا العصبية والخلايا الأخرى القابلة للاستثارة. على عكس الطرق التي تسمح لك بقياس التيارات من خلال قنوات أيونية نشطة متعددة ، فإن ميزة هذا النهج هي أن قياس التيارات من خلال قناة أيونية فردية يسمح لك بتصور وفصل مجموعة واسعة من أنماط الاستجابة المتأصلة في قناة معينة.

يمكن استخدام هذه الطريقة للإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، مثل المعدلات الفسيولوجية والعلاجية التي تؤثر على التواصل بين الخلايا العصبية. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه التقنية لأنه من الصعب الحصول على تسجيلات منخفضة الضوضاء تحتوي على قناة أيونية واحدة فقط. عند تجربة هذه الطريقة لأول مرة ، من المفيد حقا رؤية شخص ما يفعل ذلك لأنه للحصول على ختم مستقر حقا ، وهو أهم شيء في هذه الطريقة ، تحتاج إلى الاقتراب من الخلية برفق بزاوية معينة ، والأهم من ذلك ، يجب أن تكون مثابرا للتحضير للتعدين.

طلاء خلايا HKE 2 93 في أطباق 35 ملم قبل يوم واحد لتصل إلى التقاء 50 إلى 60٪ في أنبوب معقم. تحضير خليط التعداد. أضف ميكروغراما واحدا من كل CDNA محل اهتمام ، و 315 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج و 350 ميكرولتر من أكوام 42 ملليمول.

أخيرا ، أضف 35 ميكرولترا من كلوريد الكالسيوم بالتنقيط لتشكيل الرواسب. قم بتدوير الأنبوب لمدة خمس ثوان وأضف 175 ميكرولترا من تعليق الإرسال إلى كل طبق من الأطباق الأربعة. مطلي في اليوم السابق.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد الحضانة ، قم بإزالة الوسائط وغسلها باستخدام PBS. بعد ذلك ، أضف ملليلترين من وسط النمو ، مكملا بكلوريد المغنيسيوم المليمولار لمنع السمية المثيرة بوساطة مستقبلات MDA.

أولا اسحب ماصتين متماثلتين للتسجيل من زجاج سيليكات الصبي باستخدام مجتذب عمودي. بعد ذلك ، يعد تلميع الحريق ضروريا للحصول على القطر والمقاومة المناسبين. بعد ذلك ، يتم إعداده للتسجيل عن طريق فتح برنامج الحصول على بيانات QUB وتحديد نافذة الاستحواذ.

تحت التخطيط. افتح ملف بيانات QUB جديدا بالنقر فوق بيانات جديدة وأدخل المعلمات التجريبية المراد استخدامها. اضبط مقياس السعة إلى 0.1 فولت لكل مكبر صوت بيكو بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق ملف البيانات وتحديد الخصائص والنقر فوق علامة تبويب البيانات.

بعد استبدال الوسائط بملليلترين من PBS التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم ، قم بتركيب طبق الخلايا على مرحلة المجهر. ركز على المجال الخلوي باستخدام المجهر المتباين الطور لتقييم أن الخلايا صحية ومرتبطة جيدا بالطبق بطريقة أحادية الطبقة. قم بالتبديل إلى الكشف عن التألق للتحقق من نجاح التعدين.

بعد ذلك ، قم بتعيين المعلمات لتسجيل قناة واحدة. اضبط الوضع على مشبك الجهد واضغط على الجهد الكهربائي إلى 100 مللي فولت باستخدام أمر تثبيت الجهد. في وضع إيقاف التشغيل ، حدد زر اختبار الختم بناء على التألق والمظهر العام.

اختر خلية لتصحيحها ، وتحقق من أن الخلية متصلة جيدا بالطبق ، وتحتوي على جزء كبير من سطح الخلية مكشوفة للترقيع ، وتبدو صحية بخلاف ذلك. املأ ماصة مصقولة حديثا بمحلول مناسب لمستقبلات NMDA والتجارب المتصلة بالخلايا وقم بالتمرير برفق لإخراج أي فقاعات هواء. قم بتثبيت ماصة التسجيل على مرحلة رأس مكبر الصوت وتأكد من غمر السلك الفضي في محلول الماصة لمنع محلول الحمام من دخول الماصة.

أثناء النهج، استخدم حقنة بلاستيكية صغيرة متصلة بحامل الماصة لتطبيق الضغط الإيجابي برفق. بعد ذلك ، استخدم المعالج الدقيق لتوجيه الماصة إلى الحمام. أغلق الدائرة الكهربائية ، ضعها مباشرة فوق الخلية المحددة للترقيع.

لاحظ راسم الذبذبات عند الدخول إلى الحمام. يجب أن تكون مقاومة الماصة ضمن النطاق الأمثل أثناء مراقبة موضع الأنبوب بصريا في المجهر ومقاومته كهربائيا على راسم الذبذبات. استمر في النهج بزيادات صغيرة حتى تصطدم الماصة برفق بالخلية.

ستنخفض إشارة الاختبار قليلا للإشارة إلى زيادة المقاومة. لتشكيل ختم ، التقط المحقنة وقم بتطبيق ضغط سلبي طفيف برفق من خلال الأنبوب الجانبي. عن طريق سحب الحقنة ، يشار إلى تشكيل ختم المكبس من خلال تسطيح كامل لشكل موجة إشارة الاختبار على راسم الذبذبات.

على مكبر الصوت. قم بتبديل الأمر الخارجي من اختبار الختم إلى إيقاف التشغيل. قم بتبديل أمر تعليق الجهد من إيقاف التشغيل إلى موجب وقم بزيادة الكسب من 10 × إلى 100 ×.

راقب راسم الذبذبات لنشاط القناة ، والذي إذا كان موجودا سيتم عرضه على شكل انحرافات مربعة لأسفل من خط الأساس المسطح سابقا. إذا تم عرض نشاط القناة على راسم الذبذبات، فابدأ في الحصول على البيانات في الملف الرقمي المفتوح مسبقا في QUB بالضغط على زر التشغيل، متبوعا بزر التسجيل. لإيقاف الحصول على البيانات ، اضغط على زر الإيقاف في QUB واحفظ ملف QDF إشارة لا تتسطح تماما ، أو قد يشير خط الأساس الذي يصبح صاخبا وغير مستقر إلى ضعف الختم.

في هذه الحالة، قم بإزالة الماصة والتخلص منها وكرر الخطوات التالية باستخدام ماصة جديدة حتى يتم الحصول على ختم مناسب. لبدء عملية تحليل البيانات، افتح ملف البيانات المسجلة في QUB وافحص التتبع الحالي في الواجهة المسبقة. تحت التخطيط.

قم بإزالة المرشح الرقمي لعرض التتبع المسجل في النطاق الترددي الكامل عن طريق إلغاء تحديد المربع المسمى fc. مسح الأثر بصريا لاكتشاف المخالفات والتحف موجز. يمكن تصحيح المسامير الحالية عن طريق تسليط الضوء على منطقة نظيفة مجاورة من نفس فئة التوصيل.

انقر بزر الماوس الأيمن وحدد تعيين المخزن المؤقت للمسح أولا ، قم بتكبير السنبلة حتى تصبح نقاط العينة الفردية مرئية. حدد المنطقة المراد استبدالها بتمييز هذه المنطقة فقط. انقر بزر الماوس الأيمن وحدد محو لتصحيح خط الأساس للسجل بأكمله.

حدد خط الأساس الحالي الصفري عن طريق تحديد جزء مبكر من السجل حيث يكون الخط الأساسي مستقرا. ظلل النقر بزر الماوس الأيمن وحدد تعيين خط الأساس. عند ظهور المبدأ التوجيهي الأساسي ، تأكد من خلال الفحص البصري أنه يمثل بدقة مستوى الخط الأساسي.

حدد النقاط في السجل حيث ينحرف خط الأساس للبيانات الأولية بشكل واضح عن خط الأساس المحدد. قم بتصحيح ذلك عن طريق تحديد قسم صغير من خط الأساس داخل المنطقة المنحرفة. انقر بزر الماوس الأيمن وحدد الأمر إضافة عقدة أساس.

عندما يحتوي السجل على فترات عرضية ذات ضوضاء أو قطع أثرية زائدة ، والتي لا يمكن تصحيحها بسهولة ، يجب حذف هذه الأجزاء ، ولكن يجب أولا تقسيمها إلى مقاطع متتالية. قم بتمييز المنطقة مباشرة قبل المنطقة المراد التخلص منها. انقر بزر الماوس الأيمن وحدد كسر المقطع.

بعد ذلك ، قم بتمييز القسم المراد تجاهله انقر بزر الماوس الأيمن ، وحدد ، واحذف ، واضغط على Enter لإضفاء الطابع المثالي على السجلات. قم بالتبديل إلى واجهة MOD ضمن التخطيط. في لوحة عرض البيانات، حدد جزءا صغيرا من السجل الذي يحتوي على كل من الأحداث المغلقة والمفتوحة.

حرك المؤشر إلى لوحة الدقة العالية أسفل التتبع المحدد وداخل التتبع المحدد ، وقم بتمييز مقطع نظيف يمثل خط الأساس. حرك المؤشر إلى لوحة النموذج أدناه ، وانقر بزر الماوس الأيمن فوق المربع الأسود ، والذي سيمثل الحالة المغلقة وحدد الاستيلاء عليها. كرر الإجراء الخاص بفتحات القنوات عن طريق إبراز جزء من السمات التي تمثل الموصلية المفتوحة.

انقر بزر الماوس الأيمن فوق المربع الأحمر في لوحة النموذج وحدد الإمساك. قم بإجراء المثالية للجزء المحدد من السجل عن طريق تحديد الزر SEL ضمن مصدر البيانات. ثم انقر بزر الماوس الأيمن على علامة التبويب المثالية أسفل قسم النمذجة في اللوحة المنبثقة.

تحقق من صحة المعلمات المطلوبة للتحليل ثم انقر فوق تشغيل. يتم تراكب نتيجة المثالية جنبا إلى جنب مع الرسم البياني للسعة للجزء المحدد مع البيانات للسماح بالفحص البصري للمثالية. إذا لزم الأمر ، اضبط معلمات المثالية للحصول على أفضل نتيجة وكرر ذلك ، وقم بإجراء المثالية للملف بأكمله عن طريق تحديد زر الملف ضمن مصدر البيانات.

ثم انقر بزر الماوس الأيمن على علامة التبويب المثالية وانقر فوق تشغيل. يتم عرض نتائج الملف بأكمله. متراكبة مع البيانات ، افحص بعناية التطابق بين التتبع المثالي والبيانات المسجلة.

في بعض الأحيان يتم تحديد الأحداث بشكل خاطئ والتي يمكن استبعادها من التتبع المثالي. حدد الحدث الخاطئ انقر بزر الماوس الأيمن وحدد الانضمام إلى IDL. تظهر هنا تيارات أيون الكالسيوم فقط من خلال مستقبل NMDA واحد في خلية HEK 2 93.

باستخدام تقنية مشبك التصحيح المرفقة بالخلية ، ينتج عن إضفاء الطابع المثالي على البيانات مخططات بيانية للسعة ، والتي تتناسب بشكل جيد مع فئتين متميزتين من الموصليات في هذه الخلية. التسجيل المرفق من HEK 2 93 خلية ، يتم تنشيط قناة واحدة حساسة لمينو بمقدار 20 ملم تحت الصفر. ضغط الزئبق من خلال ماصة التصحيح أثناء التطبيق المستمر للجهد.

يشير الخط الأحمر المنقط إلى مستوى التيار الصفر. تظهر هذه التسجيلات من القنوات الأصلية نشاطا مستمرا لمستقبلات NMDA مسجلا من سوما خلية عصبية تم فصلها عن قشرة الفص الجبهي لجنين الفئران والحفاظ عليها في الثقافة لمدة خمسة أو 27 يوما. بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذا الإجراء في 30 دقيقة إلى ساعة واحدة اعتمادا على مدة التسجيل.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التحليل الحركي ونمذجة الحالة لتحديد آلية بوابات القناة وتقدير معدلات التفاعل. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التسجيل والبدء في تحليل التيارات من خلال بروتين قناة أيونية واحدة.