و خارج الحي نظام الثقافة لدراسة التنمية الغدة الدرقية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تشريح ثقافة خارج الجسم الحي أو الفأر أو غرسات الغدة الدرقية الجنينية أو الفصوص للسماح بدراسة الأحداث المورفوجينية والتمايز التي تحدث أثناء تطور الغدة الدرقية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إزالة الفك العلوي والجزء السفلي من الجسم أولا في اليوم الجنيني. E 12.5 إلى E 14.5 أجنة فأر لعزل منطقة عنق الأجنة.

في الخطوة الثانية ، تتم إزالة الأنبوب العصبي والأنسجة الجانبية واللسان لفضح الجزء العلوي من القصبة الهوائية والمريء. بعد ذلك ، يتم تنظيف برعم الغدة الدرقية أو المناطق أو الفصوص من أي أنسجة غير مرغوب فيها. في الخطوة الأخيرة ، يتم طلاء غرسات الغدة الدرقية للزراعة على بئر صغير مغلف أو على مرشح.

في النهاية ، يمكن إجراء التصوير بفاصل زمني أو تلطيخ المناعة أو تحليل التعبير الجيني لدراسة تكوين الظهارة ، والتنظيم ثلاثي الأبعاد والبصيلات ، والأوعية الدموية للغرسات أو تمايز سلف الغدة الدرقية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على التطور والتمايز الرئيسي. سؤال حول تنظيم الخلايا الظهارية للغدة الدرقية في 3D ، وتكوين التجويف ، وتمايز الخلايا ، والاستقطاب ، والنمو.

سيوضح الإجراء فيدل مارسيل ، طالب دراسات عليا ، وميلا لاكورتي ، باحثة ما بعد الدكتوراه من مختبري تحت حالة معقمة في غطاء التدفق الصفحي. قبل ساعتين من عزل أنسجة الغدة الدرقية ، قم بتخفيف الكولاجين المعقم من النوع الأول إلى 50 ميكروغرام لكل مليلتر. التركيز النهائي في 10 مللي مولار كلوريد الهيدروجين ، ووضع الكولاجين على الثلج.

ثم قم بتغطية كل آبار من آبار غرفة الاستزراع البلاستيكية ب 200 ميكرولتر من الكولاجين المخفف واحتضان الغرفة في درجة حرارة الغرفة بعد ساعتين ، استنشق الكولاجين. اشطف الآبار بوسائط M1 99 وأضف حجما لا يقل عن 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع لكل منها. ضع الغرف المطلية جيدا في الحاضنة ثم تابع تشريح الغدة الدرقية.

أولا ، ضع الرحم المقطوع في صفيحة 10 سم تحتوي على HBSS. بعد ذلك ، استخدم الملقط لتثبيت أحد أطراف الرحم ثم افتح الرحم بمقص صغير لتحرير كل جنين على التوالي. استخدم المقص لفصل الأجنة عن المشيمة ، ثم انقل الأجنة داخل أغشيتها الجنينية الإضافية إلى صفيحة جديدة بحجم 10 سم تحتوي على HBSS الطازج.

بعد ذلك ، استمر في التشريح تحت مجهر ستيريو لكل جنين. أولا ، قم بإزالة كيس الصفار والسلى. ثم عقد إبر التنغستن في الشعيرات الدموية الزجاجية كسكين وشوكة.

قم بإزالة الجزء العلوي من الرأس ، بما في ذلك الفك العلوي والأذنين. امسك الجنين على ظهره. ثم قم بإزالة قطعة إضافية من الأنبوب العصبي وبعد ذلك قم بإزالة الجزء السفلي من الجنين أسفل الأطراف الأمامية وفوق القلب.

لتوجيه الأنسجة ، قم بنقل شريحة الجنين التي تحتوي على اللسان ومنطقة رقبته إلى صفيحة جديدة بطول 10 سم تحتوي على HBSS طازج وإزالة الأنبوب العصبي والأنسجة الخلفية للمريء والقصبة الهوائية. الآن قم بتقسيم شريحة الأنسجة برفق على جانبي اللسان. ثم حدد موقع المريء والقصبة الهوائية ، وقم بتشريح اللسان ، تاركا تورم الريتينويد والأنسجة على جانبي المريء والقصبة الهوائية.

بعد إزالة اللسان ، قم بتشريح المريء وضع الجانب البطني للقصبة الهوائية لأعلى. ثم قم بتشريح الأنسجة غير المرغوب فيها مثل الغدة الصعترية وجميع الأنسجة الموجودة بشكل جانبي في الشرايين القوسية البلعومية. ثم بالنسبة للأجنة E 13.5 أو E 14.5 ، تصور فصوص الغدة الدرقية على كل جانب من القصبة الهوائية وقم بتشريح الفصوص من القصبة الهوائية.

بالنسبة للأجنة E 12.5 ، يمكن إجراء التشريح كما هو موضح للتو حتى بعد استئصال اللسان والمريء. ثم بعد تحديد موقع الشرايين القوسية البلعومية ، قم بإزالة جميع الأنسجة الجانبية كما هو الحال بالنسبة ل E 13.5 إلى 14.5 الأجنة. أخيرا، باستخدام طرف مرشح مبلل مسبقا على ماصة دقيقة P 200، انقل الأنسجة المعزولة إلى صفيحة مزرعة مقاس 35 ملم تحتوي على وسط مزرعة مسبقة التدفئة.

قبل طلاء E 13.5 إلى E 14.5 الغدة الدرقية X explan. أولا ، اغسل الأنسجة عن طريق النقل المتتالي إلى ثلاثة آبار من صفيحة 24 بئرا تحتوي على ملليلتر واحد من وسط الثقافة الدافئة لطلاء الفصوص على الغرف المطلية مسبقا. أولا، استنشق وسط الاستزراع واستخدم ماصة دقيقة ذات أطراف مفلترة لوضع فص غدة درقية واحد بعناية في كل غرفة من غرف الاستزراع.

قم بإزالة أي وسيط زائد ثم ضع حجرة الثقافة في حاضنة زراعة الأنسجة للسماح للنباتات بالالتصاق بالمصفوفة. ثم بعد ساعتين ، أضف برفق 200 إلى 300 ميكرولتر من وسط الاستزراع الدافئ إلى كل بئر وضع الغرف مرة أخرى في الحاضنة لوضع منطقة القصبة الهوائية E 12.5 أو فصوص الغدة الدرقية على مرشحات شبه مسامية. أولا ، املأ آبار صفيحة 24 بئرا بمائة و 30 ميكرولتر من ثقافة Prewarm.

ضع مرشحات متوسطة على الوسط. الحرص على تجنب احتجاز فقاعات الهواء أسفل مرشح الثقافة. ثم استخدم ماصة دقيقة ذات أطراف مفلترة لنقل مخطط الغدة الدرقية أو الفصوص بعناية ، وحجم أدنى من الوسط إلى مركز كل مرشح بحد أقصى أربعة × explan لكل مرشح.

عند وضع X على الفلتر ، من المهم نقلها إلى مركز الفلتر بأقل قدر من الوسيط لتجنب ملامسة الوسط وإنشاء الغضروف المفصلي بجدار المرشح. أخيرا ، قم بإزالة أي وسيط زائد واستخدم إبرة التنغستن للتباعد. ثم ضع هذه في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة تصل إلى سبعة أيام لتغيير وسط الثقافة كل يومين تحت غطاء التدفق الرقائقي.

بعد يوم واحد في الثقافة على مرشح ، يظهر خط الوسط على laa كنسيج ممدود يمتد على الطول العلوي ويشكل فصين على كل جانب من القصبة الهوائية. مع الثقافة ، تتوسع الفصوص التي تخضع لتنظيم تكوين الخلايا الظهارية إلى هياكل جريبية مرئية مجهرية. كما هو موضح في هذه الصور ، يمكن تصور تنظيم واستقطاب الخلايا الظهارية الإيجابية المتماسكة e عن طريق وضع العلامات المناعية على ezrin.

بمرور الوقت ، اندمجت الهياكل داخل الخلايا الموجبة الإزرين مع قطب الخلية الذي سيصبح القطب القمي. خلال هذه العملية ، تتكاثر الخلايا البطانية الإيجابية أربعة PCAM وتنظم حول البصيلات النامية لتشكيل وحدات جريبية وعائية. لتحديد التمايز بين الخلايا الكريهية والخلايا C ، يمكن فحص التعبير الجيني بواسطة R-T-Q-P-C-R من الحمض النووي الريبي ، المعزول عن فصوص الغدة الدرقية المستنبتة.

في حين أن التعبير عن عامل نسخ الغدة الدرقية ، NK X 2.1 لا يتغير أثناء الثقافة ، فإن التعبير عن ثيروجلوبولين الخاص بك والكالسيتونين الخاص بالخلايا C يزداد بشكل كبير مما يشير إلى التمايز الوظيفي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشريح وزراعة الغدة الدرقية. أنت لست مستعدا لإجراء تجربة اكتساب وفقدان الوظيفة باستخدام أجنة من النوع البري أو NOCO.