ثابت التصاق الفحص لدراسة إنتغرين تنشيط الخلايا اللمفية تي في

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد الالتصاق الخلوي. يتم تحقيق ذلك عن طريق طلاء صفيحة دقيقة 96 بئر أولا بجزيئات الالتصاق في الخطوة الثانية. يتم عزل الخلايا التائية البشرية الأولية من الدم وتصنيفها ب CFSE.

بعد ذلك ، يتم تحفيز الخلايا التائية بعلاجات للتأثير على التصاقها. في الخطوة الأخيرة ، تتم إضافة الخلايا المعالجة إلى الصفيحة الدقيقة ويسمح بالالتصاق. في النهاية ، يمكن قياس كمية التألق لكل بئر لتحديد النسبة المئوية للخلايا الملتصقة لكل حالة علاج.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطريقة الحالية مثل إضافة الخلايا التائية إلى النموذج والأنتيريوم ، هي أن الزراعة المشتركة للخلية التائية والخلية erl غير مطلوبة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم المناعة، مثل كيف تؤثر أدوية معينة على التصاق الخلايا الليمفاوية؟ على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لبيولوجيا قدم الخط ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على خلايا الماي الأخرى مثل العدلات.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب إتقان الخطوات وتتطلب الدقة والمهارة لترميز صفيحة دقيقة بجزيئات الالتصاق ، ابدأ بغسل 24 بئرا من لوح 96 بئر مع 50 ميكرولترا من محلول الغسيل ، ثم احتضان كل بئر باستثناء آبار التحكم غير المطلية ب 50 ميكرولترا من محلول الطلاء لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك، قم بشفط محلول الطلاء برفق دون السماح لطرف الماصة بلمس قاع الآبار. ثم بعد غسل الآبار ب 50 ميكرولترا إضافيا من محلول الغسيل ، قم باحتضان الصفيحة الدقيقة ب 50 ميكرولترا من محلول الالتصاق لكل بئر.

مرة أخرى ، عند 37 درجة مئوية. بعد ساعة واحدة ، قم بشفط محلول الالتصاق برفق واغسل الآبار مرة أخرى باستخدام 50 ميكرولتر من محلول الغسيل لعزل الخلايا التائية أولا ، قم أولا بخلط 50 ميكرولترا من كوكتيل تخصيب الخلايا التائية البشرية لكل مليلتر من الدم الكامل ، ثم احتضان الدم المعالج لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف ستة ملليلتر من الدم المعالج وكمية متساوية من PBS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم المخصب بالغلوكوز 1٪ D إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر في درجة حرارة الغرفة واخلط المحلول برفق.

ثم أضف 15 مل من التحضير الليمفاوي إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 ملليلتر ، وقم بوضع عينة الدم المخففة بعناية على وسط عزل الخلايا الليمفاوية. افصل طبقات الخلية لمدة 20 دقيقة عند 400 مرة جم و 20 درجة مئوية مع الانفصال. ثم استخدم ماصة معجون جديدة لإزالة الطبقة العليا ، مع ترك طبقة الخلايا الليمفاوية دون إزعاج عند الواجهة.

انقل طبقة الخلايا الليمفاوية إلى أنبوب مخروطي جديد باستخدام ماصة مزعجة جديدة. أضف تسعة ملليلتر من PBS إلى الخلايا الليمفاوية ثم وزع الخلايا بالتساوي في جميع أنحاء المعلق عن طريق سحبها برفق للداخل والخارج. قم بتدوير الخلايا ثم أعد تعليق الحبيبات في الوسائط.

ثم قم بتوزيع الخلايا في قارورة ثقافة T 75. 20 مل من وسائط الثقافة لتحفيز الخلايا بعد فترة الثقافة المناسبة. أولا ، أضف وسائط خالية من المصل إلى 2.4 في 10 إلى الخلايا التائية الست ، ثم يجوع المصل الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية.

بعد ساعتين ، قم بتدوير الخلايا وإعادة تعليق الحبيبات. في مليلتر واحد من PBS ، قم بتسمية الخلايا بعلامة فلورية في الظلام لمدة ثماني دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم أوقف التفاعل بإضافة 10 ملليلتر من 37 درجة مئوية PBS. ثم بعد تدوير الخلايا ، أعد تعليق الحبيبات في 1.2 مل من محلول التصاق الدافئ.

قم بتسخين الصفيحة الدقيقة المطلية إلى 37 درجة مئوية ، ثم قسم الخلايا إلى ثمانية حصص سعة 150 ميكرولتر في 1.5. تحفز أنابيب المليلتر أنبوبا واحدا مع PMA عند 10 نانوغرام لكل مليلتر لتكون بمثابة التحكم الإيجابي. اترك ثلاثة أنابيب غير معالجة لخدمة التحكم في التحفيز ، والتحكم في التحميل غير المغسول والتحكم في طلاء ICAM واحد وتحفيز أربعة أنابيب بتركيزات مختلفة من الأجسام المضادة المضادة الثلاثة للقرص المضغوط الثلاثة.

50 ميكرولترا من واحد في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر من مخاليط الخلايا المحفزة في الآبار المناسبة في الصفيحة الدقيقة واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. لتحديد النسبة المئوية للخلايا الملتصقة أولا ، اغسل كل بئر ب 150 ميكرولتر من محلول الالتصاق الدافئ. رج الطبق برفق لبضع ثوان ثم استنشق الوسط بعناية من كل بئر دون لمس قاع الآبار بأطراف الماصة.

كرر الغسيل ثلاث مرات ، مع تغيير زاوية الماصة مع كل شفط. ثم قم بتشغيل قارئ اللوحة وافتح برنامج قراءة اللوحة ضمن قائمة المهام. انقر فوق جديد لإعداد بروتوكول جديد.

ثم ضمن قائمة الإجراءات ، حدد خيار القراءة. انقر فوق شدة الفلورسنت وانقر فوق موافق. أدخل الطول الموجي للإثارة على أنه 485 والطول الموجي للانبعاث على أنه 528.

ثم ضمن قائمة الخيارات البصرية ، حدد أسفل وانقر فوق موافق. ثم ارجع إلى قائمة الإجراءات واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية وانقر فوق موافق. أخيرا قم بتحميل اللوحة الدقيقة وانقر فوق تشغيل.

بعد تصدير النتائج إلى جدول بيانات، استخدم الصيغة لحساب النسبة المئوية لخلايا الالتصاق في هذه الصور. يظهر مثال على اختبار الالتصاق باستخدام الخلايا التائية الأولية ، المحفزة بتركيزات مختلفة من ثلاثة أجسام مضادة مضادة للقرص المضغوط . تعمل الخلايا غير المحفزة كعنصر تحكم سلبي.

الخلايا المعالجة ب PMA كعنصر تحكم إيجابي بالنسبة للأجسام المضادة الثلاثة المضادة للقرص المضغوط ، يعرض الجدول شدة التألق النسبية ل CFSE. تم تحفيز الخلايا التائية الأولية المسمى بجرعات مختلفة من ثلاثة أجسام مضادة للذوبان مضادة للقرص المضغوط ومطلية على IAM بآبار مطلية بواحد. لكل حالة ، يمكن حساب متوسط كثافة الآبار الثلاثية وتحويلها إلى النسبة النسبية من إجمالي الخلايا المحملة.

في تجربة نموذجية ، تتراوح النسبة المئوية للخلايا المعالجة ب PMA الملتصقة بين 40 إلى 50٪ بينما تتراوح النسبة المئوية للخلايا غير المحفزة بين خمسة إلى 10٪لاحظ أن النسبة المئوية لخلايا الالتصاق تزداد مع زيادة تركيز ثلاثة أجسام مضادة مضادة للقرص المضغوط تستخدم للتحفيز. بمجرد إتقان هذه التقنية ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في أقل من ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر قياس مضان بئر غير مغسول لتحديد مدخلات التألق.

قيمة حاسمة في تحليل البيانات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد الالتصاق الخلوي الثابت. لا تنس أن العمل مع عينات الدم البشري يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معطف المختبر والقفازات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.