وهناك طريقة جديدة لتوضيح تصور الصفراوية الكبد الصفراء خلال التحول في البحر الجلكى ( Petromyzon مارينوس)

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح الكبد بأكمله والوصلة مع الأمعاء لإجراء تحليلات شاملة وهيكلية وخلوية للتنكس الصفراوي في جلكي الجحور (C lamprey) في مرحلة التحول. ويتم تحقيق ذلك من خلال تثبيت الأنسجة أولاً في محلول مونومر الهيدروجيل.

بعد ذلك، يتم بلمرة الهيدروجيل مع الأنسجة المثبتة. ثم يتم إزالة الغشاء البلازمي للنسيج المثبت ليصبح النسيج شفافاً. وأخيراً، يتم إجراء صبغ مناعي فلوري، وفي النهاية يُستخدم المسح الليزري والمجهر البؤري لإظهار التغيرات الهيكلية والخلوية الشاملة أثناء التحلل الصفراوي في جرو البحر (Lamprey) خلال مرحلة التحول.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في المجال الطبي الحيوي، مثل الموصلات العصبية في الجهاز العصبي المركزي، وفي حالتنا هذه، التحلل الصفراوي أثناء التحول في نقطة المصل. وتمتد آثار هذه التقنية نحو علاج أو تشخيص القنوات الصفراوية البشرية أو الرتق، لأن هذا المرض الخلقي النادر لدى الرضع يشترك في خصائص مماثلة مع التحلل الصفراوي أثناء التحول في نقطة المصل. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما وجدنا مقالاً إخبارياً في nature وعرضنا الفيديو المتاح عبر الإنترنت خلال اجتماع المختبر، والذي يوضح الإجراء الذي ستقوم به Ann Scott، وهي طالبة دراسات عليا من مختبرنا، بعد تحضير المحلول الملحي المخفف بالفوسفات والمخفف الفوسفاتي أو pb، وفقاً للبروتوكول النصي.

داخل خزانة استخلاص الأبخرة، قم بتحضير 400 milliliters من الهيدروجيل عن طريق دمج الماء المقطر، و40%acrylamide 2%bis acrylamide 10 XPBS، و16%paraform، والألدهيد، والسابونين، وكبريتات الأمونيوم. قم بتحضير لتر واحد من محلول التصفية المكون من 4%SDS و0.2 molar من حمض البوريك، وقم بتحضير 500 milliliters من 80%glycerol لتجهيز الأنسجة داخل خزانة استخلاص الأبخرة. صب 10 milliliters من محلول مونومر الهيدروجيل في أنابيب طرد مركزي سعة 15 milliliter.

قم بتشريح عينة النسيج ووضع النسيج في كل أنبوب من مثبت الهيدروجيل عند درجة حرارة 4 °C لمدة يومين. بعد الحضانة تحت خزانة استخراج الأدخنة، قم ببلمرة النسيج المثبت عن طريق إضافة 5 µL من temid. ثم اخلط جيداً واترك العينات تحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح بين ساعتين إلى ثلاث ساعات.

بعد الانتهاء من الحضن، قم بإزالة الجل الزائد تماماً لتصفية عينات الأنسجة. ضع كل عينة في 15 milliliters من محلول التصفية واحضنها عند 50 °C وبسرعة 70 RPMs لعدة أيام حتى تصبح شفافة. قم بتغيير محلول التصفية مرة واحدة يومياً على الأقل وأزل أي جل زائد.

انقل العينات إلى 15 milliliters من PB بتركيز 0.1 molar مع 0.1% Triton X 100 عند درجة حرارة 37 degrees Celsius وبسرعة 70 RPMs طوال الليل. كرر عملية الحضن مرتين إضافيتين باستخدام محلول منظم (buffer) جديد. وبعد أن تصبح الأنسجة شفافة وخالية من أي هلام زائد، اغمر العينات في الأجسام المضادة الأولية في PB tritton X 100 واحضنها عند درجة حرارة 37 degrees Celsius وبسرعة 70 RPMs لمدة يومين. بعد الحضن، استخدم 15 milliliters من PB مع 0.1% tritton X 100 لغسل عينات الأنسجة عند درجة حرارة 37 degrees Celsius وبسرعة 70 RPMs طوال الليل.

كرر عملية الغسل ثلاث مرات بعد إزالة محلول غسل التخفيف الأخير، ثم أضف محلول الأجسام المضادة الثانوية الفلورية في محلول PB مع 0.1%Trix 100 ومصل حجب، ثم حضن العينات في الظلام عند درجة حرارة 37 degrees Celsius وبسرعة 70 RPMs لمدة يوم واحد. بعد غسل العينات ثلاث مرات في 10 milliliters من PB tritton X 100 عند درجة حرارة 37 degrees Celsius وبسرعة 70 RPMs طوال الليل، قم بإجراء ثلاث عمليات غسل طوال الليل في PBS. وأخيراً، حضن الأنسجة الموضحة في 80%glycerol مغطاة برقائق الألومنيوم طوال الليل.

يتم بعد ذلك إجراء التصوير بالمجهر البؤري في إضاءة مظلمة أو خافتة، على الرغم من تشغيل الأضواء في هذا الفيديو لأغراض التوضيح المرئي. تقع عدة أحداث نمائية مهمة في الجهاز الصفراوي الكبدي أثناء تحول سمك الجلق، فعلى سبيل المثال، وكما هو موضح هنا، يخضع القناة الصفراوية والمرارة للموت الخلوي المبرمج والتحلل. بعد استخدام طريقة التوضيح المعدلة والصبغ باستخدام واسم الخلايا الكبدية cytokeratin 19 وواسم مضاد للموت الخلوي المبرمج BCL two، استُخدم المجهر البؤري المسحي بالليزر لإجراء التقطيع البصري عبر الكبد السليم.

أظهر الصبغ أن العملية التنكسية تحدث في المراحل التحولية من الثانية إلى الرابعة. تمثل اللوحات العلوية الطرف الأمامي، بينما تمثل اللوحات السفلية الطرف الخلفي. يظهر هنا الشجرة الصفراوية، وتظهر هنا خلايا موت خلوي مبرمج ذات مظهر شجيري داكن، مع القنيات والقنوات المحيطة بها في الكبد.

يمثل هذا الشكل صوراً ثلاثية الأبعاد أعيد بناؤها من سلسلة Z المجهرية البؤرية لثلاثة أكباد بين المرحلتين التحوليتين الثانية والثالثة، تم وسمها بأجسام مضادة ضد cytokeratin 19 و BCL two؛ حيث تشير الأسهم البيضاء والسوداء على التوالي إلى الشجرة الصفراوية والخلايا المبرمج موتها ذات المظهر الشجيري الداكن والقنيات المحيطة والأنابيب القنوية. يظهر هنا مقطع بصري مجهري بؤري للقنوات الصفراوية في عينة بين المرحلتين التحوليتين الثانية والثالثة مع وجود قطيرات صفراوية في اللمعة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية ترويق النسيج بالكامل من أجل تحليلات التصوير اللاحقة.

لا تنسَ أن التعامل مع محاليل البارافورمالدهيد والبولي أكريلاميد يمكن أن يكون خطيرًا للغاية، لذا يجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل ارتداء القفازات واستخدام خزانة طرد الغازات (fume hood) أثناء تنفيذ هذا الإجراء.