قياس معامل نفاذية المياه الأسموزي (P _و) من خلايا كروية: Protoplasts محطة معزولة كمثال

الهدف العام من التجربة التالية هو التعرف على وظيفة الأكوابورينات من خلال تحديد معامل نفاذية الماء التناضحي ، أو PF للبروتوبلاستات النباتية. اقطع قطعة من ورقة بدون بشرة محورية وضعها على محلول متساوي التوتر. انقل القطع إلى محلول إنزيمي واحتضانها لمدة 20 دقيقة في 28 درجة مئوية ، ثم إلى محلول متساوي التوتر الطازج.

بعد ذلك ، اجمع البروتوبلاست الذي يحتوي على محلول بطرف مقطوع. كخطوة ثانية ، قم بإعداد غرفة تجريبية. قم بتوصيل زلة غطاء في الجزء السفلي من الشريحة باستخدام شحم السيليكون.

ثم قم بتغطية قاع الغرفة بغراء محمل شحنة موجبة واملأ الغرفة بمحلول متساوي التوتر. ثم تتم إضافة البروتوبلاست المعزولة إلى الغرفة ، ويتم وضع الغرفة بدقة على مرحلة المجهر. بعد ذلك ، تتعرض البروتوبلاستات لمحلول منخفض التوتر بينما يتم تسجيل مقاطع الفيديو لالتقاط المسار الزمني للتورم.

بعد ذلك ، يتم تحليل المسار الزمني للتورم عدديا بواسطة برنامج بما في ذلك إجراءات تركيب cur من أجل تحديد PF لكل بروتوبلاست بناء على نتائج التحليل العددي التي تظهر الاختلافات في PF المستحثة ، على سبيل المثال ، عن طريق التعبير عن جينات الأكوابورين المختلفة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال فسيولوجيا الغشاء الخلوي ، مثل تنظيم وظيفة الأكوابورين. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للمياه الماتيزمية ، إلا أن نفاذية نبات المياه النباتية إما أصلية أو معدلة وراثيا.

يمكن أيضا تطبيقه على أنظمة أخرى مثل أصل الفائدة المكشوف. قبل البدء في هذا الإجراء ، قم بإعداد المحاليل متساوية التوتر ومفرطة التوتر المطلوبة وتحقق من أسموليتها. باستخدام OSM oter ، يجب أن تكون الأسمولية لكل حل في حدود 3٪ من القيمة المستهدفة.

املأ طبق بتري بطول 10 سم بحوالي ست قطرات من محلول متساوي التوتر. قشر ختم ABBA أو اخفض بشرة أوراق الأرانب وقطع الورقة المقشرة إلى مربعات تبلغ حوالي أربعة × أربعة ملليمترات. ضع القطع الصغيرة على قطرات المحلول متساوي التوتر مع الجانب المحوري المكشوف ووجهه لأسفل ولمس المحلول.

بعد ذلك ، قم بإذابة 5.7 ملليغرام من مزيج الإنزيم في 165 ميكرولتر من محلول متساوي التوتر في أنبوب سعة 1.5 مليلتر واخلطه برفق عن طريق سحب العينة لمدة دقيقة أو نحو ذلك حتى يذوب. ضع عدة قطرات متشابهة من المحلول الأنزيمي في نفس طبق بتري. انقل قطع الأوراق إلى المحلول الأنزيمي. القطرات.

أغلق الطبق وأغلق الغطاء بجولة واحدة من البيرفيل. تطفو الطبق في حمام مائي على 28 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد 20 دقيقة ، أضف عدة قطرات أخرى من محلول متساوي التوتر إلى الطبق باستخدام الملقط.

ارفع كل قطعة ورقة من حافتها لنقلها إلى محلول متساوي التوتر جديد إسقاط ثم بالتتابع إلى قطرة ثانية. رج قطعة الورقة في القطرة الثانية لتحرير البروتوبلاست باستخدام رأس ماصة مقطوع سعة 100 ميكرولتر. اجمع القطرات مع البروتوبلاست في أنبوب سعة 1.5 مل.

قم بإعداد نظام الوفرة عن طريق ملء عمود واحد بمحلول متساوي التوتر وعمود آخر بمحلول منخفض التوتر. افتح الصمام للسماح بتدفق بعض المحلول المنخفض التوتر لملء الأنبوب وصولا إلى مشعب المدخل. بعد التأكد من عدم وجود فقاعات هواء محاصرة ، أغلق الصمام.

كرر مع المحلول متساوي التوتر. قم بإغلاق زلة الغطاء باستخدام شحم السيليكون لعمل قاع للغرفة داخل شريحة زجاج شبكي لجعل قاع الغرفة لزجا للبروتوبلاست ، وتغطيته بشحنة موجبة تحمل كبريتات البروتامين أو بولي L ليسين. استخدم طرف الماصة لنشر هذا الغراء على زلة الغطاء.

انتظر لمدة دقيقة إلى دقيقتين. اشطف ثلاث إلى أربع مرات بمحلول متساوي التوتر وتخلص من المحلول المتبقي. املأ الغرفة بمحلول متساوي التوتر.

ثم استخدم طرف ماصة مقطوع لإضافة قطرة من البروتوبلاست تحتوي على محلول إلى الغرفة. وانتظر ثلاث إلى أربع دقائق حتى تستقر البروتوبلاست. قم بتغطية الغرفة بغطاء شفاف يلامس سطح المحلول.

تجنب حبس فقاعات الهواء تحتها. ضع شريحة برفق على طاولة مجهر مقلوبة وقم بتوصيلها بنظام التروية والمضخة التي تحمي من فقاعات الهواء في الأنبوب. قم بتشغيل تدفق المحلول متساوي التوتر للحصول على نضح مستمر بمعدل واحد مليلتر في الدقيقة.

لتسجيل تغييرات مستوى الصوت، اختر حقل عرض يحتوي على أكبر عدد ممكن من الخلايا ذات الشكل الكروي، ومع محيط خلية جيد التركيز في أكبر محيط لها. سجل مقطع فيديو 62 لبروتوبلاستات غير متحركة مختارة بمعدل صورة واحدة في الثانية أو هرتز واحد. ابدأ التسجيل بغسل محلول متساوي التوتر لمدة 15 ثانية وانتقل إلى محلول مفرط التوتر لمدة 45 ثانية.

احفظ الفيلم بتنسيق Tiff في لتحليل سلسلة من الصور لخلية منتفخة ، استخدم ملحقات محلل مستكشف الصور ومحلل البروتوبلاست في برنامج الصورة J. ابدأ الصورة J.To افتح الفيلم، وانقر فوق ملف على لوحة Image J، ثم على التوالي في القوائم المنسدلة أثناء فتح الاستيراد. ثم مستكشف الصور.

قم بتمييز الفيلم المختار. انقر بزر الماوس الأيمن فوقه ، ثم يسار. انقر فوق محلل البروتوبلاست.

في الصورة الأولى ، استخدم الماوس لرسم دوائر حول البروتوبلاست المحدد. ثم انقر فوق موافق. في جدول معلمات الكشف الذي يبدو أنه يقوم بتشغيل خوارزمية الكشف عن البروتوبلاستات ، انقر فوق محلي في اللوحة العلوية لصورة البروتوبلاست.

ثم العملية. في القائمة المنسدلة، افحص الدوائر الخضراء حول البروتوبلاست المحددة طوال الفيلم. باستخدام شريط التمرير السفلي ، احفظ النتائج في ملف Excel.

يتم التحليل إطارا تلو الآخر. لذلك ، في حالة وجود أكثر من خلية ، يلزم الفرز لفصل الخطوط التي تنتمي إلى كل خلية هنا. يتم عرض الدورات الزمنية الثلاثة في ورقة Excel قبل وبعد الفرز مع قيم المساحة المحولة من البكسل إلى ميكرومتر مربع.

بعد ذلك تصدير كل دورة تدريبية إلى ملف نصي منفصل. لبدء هذا الإجراء ، قم بتوصيل الغرفة بنظام التروية والمضخة وقم بتشغيل تدفق قالب المؤشر للحصول على معدل نضح ثابت يبلغ مليلتر واحد في الدقيقة ، وسجل مقطع فيديو 62 بمعدل هرتز واحد. ابدأ التسجيل ب 15 ثانية من قالب المؤشر ثم قم بالتبديل إلى محلول مفرط التوتر لمدة 45 ثانية ، أوقف التسجيل.

اتدفق مع المؤشر. تموت مرة أخرى لمدة 30 ثانية على الأقل. قبل البدء في تسجيل فيلم جديد وحفظ خمسة إلى ستة أفلام لتحليل الأفلام.

للحصول على متوسط المسار الزمني لنفاذية قالب المؤشر المتغير ، ابدأ ملف الصورة J click. ثم افتح الفيلم واستعرضه. لكل فيلم، ارسم مستطيلا رأسيا بعرض 10 بكسل في أي مكان في الصورة الأولى للفيلم، وانقر فوق الصورة على اللوحة الرئيسية للصورة J.

ثم انقر فوق اقتصاص في القائمة المنسدلة. لمحاذاة الإطارات ال 60 في صف واحد، انقر فوق الصورة ثم انقر على التوالي في القوائم المنسدلة أثناء فتح المكدسات وإنشاء مونتاج. ارسم مستطيلا أفقيا بارتفاع بكسل واحد في أي مكان على طول صف الصور بأكمله وانقر فوق تحليل في اللوحة الرئيسية للصورة J.

بعد ذلك ، انقر فوق ملف تعريف المؤامرة. في القائمة المنسدلة، انسخ قوائم بيانات الإرسال إلى ملف Excel. متوسط دورات وقت النفاذية التي تم الحصول عليها من أفلام Sero لتدفق قالب المؤشر.

قم بإنشاء قاعدة في الوقت الفعلي بضرب الرقم التسلسلي للصورة في 0.1. احفظ متوسط الوقت المقرر الدراسي في ملف نصي لحساب المعلمات المختلفة للمقرر الدراسي الزمني للأسمولية. استخدم برنامج تركيب MATLAB PF fit ، المتاح للاستخدام.

مجانا. تتوفر تفاصيل حول تنزيل هذا البرنامج واستخدامه في نص البروتوكول. في لوحة ملاءمة المؤشر.

استيراد بيانات متوسط المسار الزمني لنفاذية صبغة المؤشر. أدخل معلمات التجربة الحالية يدويا ، ويمكن أيضا تغيير التخمينات الأولية للمعلمات مع النمل H.وصف المسار الزمني لتركيز صبغة المؤشر. انقر فوق تشغيل لعرض الرسم البياني للدورات الزمنية للمؤشر DAI تركيز ومن الأسمولية الحمام النموذجية.

الملاءمة الجيدة للبيانات أمرا ضروريا لتحديد معامل نفاذية المياه. قم بالتبديل إلى لوحة ملاءمة مستوى الصوت. اختر استيراد ملف بيانات المنطقة.

اختر تركيب المؤشر الأخير كمصدر للمعلمة. اختر فئة النموذج. ابدأ باثنين.

تهيئة معلمات PF pf البطيئة PF والتأخير ، على سبيل المثال ، كما هو موضح ، ولكن القيم الأخرى ممكنة أيضا. يتحقق وضع علامة من جميع المعلمات الثلاثة المراد تركيبها. انقر فوق تشغيل.

ثم مقلة العين الشكل المؤقت واضبط معلمة التأخير وطول السجل إذا لزم الأمر. افحص الرسم البياني للنتائج لتقييم الملاءمة والجودة وتسجيل خطأ الملاءمة. قم بتغيير معلمات التهيئة عدة أضعاف لكل منها وأعد تشغيلها.

كرر هذا الإجراء عدة مرات ، بدءا من مجموعات مختلفة من معلمات التهيئة ، بهدف الحصول على أقل قيمة لخطأ الملاءمة من أجل تحديد معامل نفاذية الماء أو pf ، ومقارنة نشاط الأكوابورينات المختلفة تم عزل Mesil Protoplasts من ورقة أرنب أوبسيس وتحويلها بشكل منفصل بثلاثة تركيبات جينية مع جينات أكوابورين من أرنب ، opsys والمتاهة. تم تصنيف البروتوبلاستات من خلال التشغيل المشترك مع ناقل يشفر بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن. تم الحصول على الدورات الزمنية لتغيرات حجم الخلية عند التعرض للتحدي المنخفض التوتر لكل خلية بالإضافة إلى المسار الزمني لتغير أسمولية الحمام أثناء التحدي المنخفض التوتر ، وتم اشتقاق قيم PF لكل خلية.

باستخدام برنامج PF FIT ، لوحظ أن قيم PF ل PROTOPLASTS التي تم تحويلها مع كل من الأكوابورينات الثلاثة كانت أعلى بكثير من PF لخلية التحكم التي تم تحويلها باستخدام GFP وحده. بمجرد إتقانها ، يمكن لهذه التقنية تقديم تحليل لبضع عشرات من الخلايا في غضون أيام تجريبية قليلة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد نفاذية الماء SMO في البروتوبلاستات المعزولة أو الخلايا البؤرية الأخرى المعرضة لفحص نقص التوتر.

لأية أسئلة متبقية ، لا تتردد في الاتصال بنا.