تقييم موسع من القلب شذوذ في التجريبية المناعة الذاتية التهاب عضلة القلب بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي المجهر في ماوس

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد الاختلالات الوظيفية القلبية عن طريق تصوير القلوب في حيوانات حية مصابة بأمراض القلب الالتهابية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحفيز المرض، مثل التهاب عضلة القلب. وتتمثل الخطوة الثانية في تحضير الحيوان للتصوير بالمجهر بالرنين المغناطيسي، ووضعه في حامل الحيوانات.

بعد ذلك، يتم وضع الفأر داخل المغناطيس للحصول على صور القلب. وتتمثل الخطوة النهائية في تحليل بارامترات وظائف القلب باستخدام برنامج segment. وفي النهاية، تُستخدم هذه التقنية لحساب حجم نهاية الانبساط والكسر القذفي في الفئران المصابة بالتهاب عضلة القلب المناعي الذاتي.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل الفحص النسيجي المرضي في كونها غير بضعية وتوفر رؤية ثلاثية الأبعاد عالية الدقة للقلب. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال طب القلب تتعلق بتشخيص أمراض القلب الالتهابية. وبوجه عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة بسبب عدم الإلمام بكيفية تحضير الحيوانات للحصول على صور مجهرية بالرنين المغناطيسي.

لذلك، يعد التوضيح المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية. ابدأ هذا البروتوكول أولاً بتحضير محلول ببتيدي لتحفيز التهاب عضلة القلب المناعي الذاتي، وذلك بإذابة ببتيد cardiac myosin heavy chain alpha peptide 3 34 to 3 52 في محلول ملحي منظم بالفوسفات ليصل إلى تركيز نهائي قدره 2 mg لكل 1.5 mL. بعد ذلك، قم بتحضير ذيفان السعال الديكي عن طريق إضافة 1 mL من محلول ملحي منظم بالفوسفات 1x معقم إلى عبوة تحتوي على 50 µg من ذيفان السعال الديكي المجفف بالتجميد.

للحصول على تركيز مخزون يبلغ 50 nanograms per microliter. ثم يتم نقل 20 microliters من المحلول المخزون إلى أنبوب معقم سعة 1.5 milliliter وإضافة 980 microliters من phosphate buffered saline المعقم بتركيز one x للحصول على تركيز عمل يبلغ one nanogram per microliter. كما يتم تحضير complete frons adjuvant أو CFA عن طريق إضافة 40 milligrams من mycobacterial tuberculosis, H 37 RV أو مستخلص MTB إلى 10 milliliters من CFA للحصول على تركيز نهائي يبلغ five milligrams per milliliter.

قم الآن بتحضير مستحلب الببتيد CFA؛ لتحضير جزء من المستحلب بحجم 1.5 مل، ضع 750 ميكرولتر من محلول ببتيد cardiac myosin heavy chain alpha 3 34 to 3 52 في أنبوب سعة 1.5 مل، ثم ضع حجماً مساوياً من CFA المضاف إليه مستخلص MTB في أنبوب آخر سعة 1.5 مل. بعد ذلك، وباستخدام حقنة lure lock سعة 3 مل، اسحب محلول الببتيد أولاً، يليه C-F-A-M-T-B extract. قم بتوصيل الحقنة بصمام إيقاف ثلاثي الاتجاهات، ثم صِل المخرج الآخر للصمام بحقنة فارغة سعة 3 مل.

اضبط فتحة صنبور الإيقاف بحيث يتدفق خليط الببتيد وCFA من حقنة إلى أخرى بمقاومة جيدة نسبياً. امزج الخليط عن طريق دفع المحتويات من حقنة إلى أخرى بشكل متكرر لمدة دقيقة واحدة تقريباً، ثم ضع المجموعة كاملة على الثلج لمدة ثلاث دقائق تقريباً.

كرر هذا الإجراء 10 مرات على الأقل. حدد مدى تماسك المستحلب عن طريق وضع قطرة صغيرة بعناية على ماء ساكن في وعاء زجاجي سعة 100 milliliter. يجب ألا تتشتت القطرة في الماء؛ وإذا حدث ذلك، استمر في الخلط حتى يتم الوصول إلى التماسك المطلوب.

انقل محتويات المستحلب من سرنجات سعة 3 mL إلى سرنجة سعة 1 mL ذات قفل لور (Lure lock)، وذلك باستبدال إحدى السرنجتين سعة 3 mL المتصلتين بصمام الإيقاف بالسرنجة سعة 1 mL. ثم قم بتركيب إبرة قياس 27.5 gauge.

احقن 150 µL من مستحلب الببتيد CFA بجرعات مقسمة تحت الجلد في المنطقتين الإربيتين لإناث فئران aj التي يتراوح عمرها بين ستة وثمانية أسابيع. ثم يتم إعطاء 100 µL من معلق ذيفان السعال الديكي عن طريق الحقن داخل الصفاق لكل حيوان في اليوم صفر واليوم الثاني بعد التحصين. كرر إجراء التحصين في اليوم السابع عن طريق إعطاء 150 µL من مستحلب الببتيد CFA بجرعات مقسمة تحت الجلد على جانبي عظمة القص.

قم بتحضير هذا المستحلب طازجاً كما هو موضح. ثم في اليوم 21، أخضع الحيوانات للتصوير بالرنين المغناطيسي (MRM). وللتحضير للتصوير، ضع أولاً كل فأر في غرفة تحريض تخدير تحتوي على خليط هواء بنسبة 2% ISO fluorine مع وسادة تدفئة للحفاظ على الدفء.

بعد ذلك، يتم نقل الحيوان إلى حامل حيوانات مصمم خصيصاً. يتم تثبيت الرأس باستخدام قضيب عض لضمان عدم تحرك الحيوان في وضعية الانبطاح. يجب أن يستقر الخطم داخل المخروط الأنفي للحفاظ على التخدير.

قم بتشغيل سخان نفخ الهواء مع إدخال خرطوم المخرج الخاص به في اللوح الرأسي للماسح الضوئي للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان أثناء التجربة. حافظ على التخدير بنسبة 1 إلى 2% من isof fluorine وبمعدل تدفق قدره 2 mL في الدقيقة طوال جلسة التصوير. تأكد من فاعلية التخدير عن طريق إجراء قرصة لإصبع القدم.

بعد ذلك، قم بتركيب مستشعر وسادة هوائية ومسبار لدرجة حرارة المستقيم لمراقبة التنفس ودرجة حرارة الجسم طوال جلسة التصوير. كما يجب تثبيت مستشعر قياس تأكسج النبض بالألياف الضوئية في الكاحل الأيسر، وتثبيت القدم باستخدام حلقة خيطية وشريط لاصق للحفاظ على وضعيتها. سيتم إجراء التصوير عن طريق مزامنة إشارات التنفس والقلب دون استخدام أي مواد تباين.

يجب استخدام مغناطيس ذو فتحة عمودية واسعة بقوة 9.4 Tesla للحصول على صور مجهرية بالرنين المغناطيسي ثلاثية الأبعاد وعالية الدقة. بعد تحضير الحيوان، ضع الفأر في الماسح الضوئي مع وضع القلب في مركز مجال الرؤية. بعد ذلك، قم بتشغيل واجهة التصوير واختيار قائمة نوع الدراسة الجديدة في شريط الأوامر، ثم افتح صفحة الضبط، واختر بدء المسبار، والضبط، والقياس التلقائي.

استخدم مقابض الضبط والمطابقة عن بعد الموجودة في نهاية الملف لضبط ملف التردد الراديوي (RF coil) على تردد رنين البروتون البالغ 400 megahertz. بعد ذلك، انتقل إلى صفحة ما قبل المسح (pre-scan). ولتشغيل معايرة التردد والقدرة، اضغط على الزر السريع x, Y, Z لفتح صفحة التشييم (shimming page).

ثم حدد جميع التكرارات وقم بإجراء عملية الضبط التلقائي للمجال (auto shimming). اختر تسلسلاً استكشافياً (scout sequence). قم بتغيير مجال الرؤية إلى 35 millimeters.

احتفظ بالإعدادات الافتراضية الأخرى وقم بتشغيل التسلسل. إذا لم يكن القلب في مركز مجال الرؤية، فقم بتعديل موضع حامل الحيوان، وأعد ضبط ملف التردد الراديوي (RF coil)، وأعد اكتساب الصورة الاستطلاعية (scout). بعد ذلك، اختر تسلسل gem.

أدخل معاملات الاستحواذ الموضحة هنا في علامة تبويب الاستحواذ (acquire tab) للحصول على مستويين متعامدين على طول المحورين القصير والطويل للقلب. بعد ذلك، حدد تسلسل السينما (cine sequence) لجمع صور السينما للمحور القصير لمقياس قياس تأكسج النبض وقياس المعاملات التشريحية والوظيفية للبطين الأيسر. أدخل المعاملات الموضحة هنا للحصول على تسلسل سينما صدى التدرج (gradient echo cine sequence).

اضبط موضع وزاوية شرائح التصوير بناءً على عرض المحور الطولي للقلب. ثم قم بتشغيل التسلسل. وبمجرد اكتمال التصوير.

قم بتحويل الصور المكتسبة إلى صيغة DICOM باستخدام علامة تبويب IO وانقل الملفات المقابلة إلى مركز البيانات للمعالجة. في نهاية إجراء التصوير، اترك الحيوان ليتعافى من التخدير داخل قفص ذي غطاء مرشح. لا تترك الفأر دون مراقبة حتى يستعيد وعياً كافياً للحفاظ على وضعية الانبطاح الصدري.

هنا، يُستخدم برنامج segment لتحليل المعاملات التشريحية والوظيفية للبطين الأيسر. ابدأ بتحميل صور cine بصيغة DICOM في البرنامج. ثم اختر MRGE كتقنية تصوير، وcine كنوع للصورة، وshort axis mid ventricular.

في مستوى عرض الصورة، حدد الأطر الزمنية التي سيتم استخدامها لنهاية الانبساط ونهاية الانقباض باستخدام القوائم الفرعية "تعيين الإطار الزمني الحالي لنهاية الانبساط" و"تعيين الإطار الزمني الحالي لنهاية الانقباض" من قائمة التحرير على التوالي. بعد ذلك، استخدم أزرار الأوامر LV ثم endo وEPI الموجودة في اللوحة السفلية اليمنى. لرسم البطين الأيسر، وشغاف القلب، ونخاب القلب يدوياً على التوالي، قم بإزالة العضلات الحليمية بالضغط على زر الأمر المقابل.

من أجل زيادة دقة الحسابات، اقرأ معايير البطين الأيسر المحددة كمياً مثل الحجم الانبساطي، والحجم الانقباضي، وحجم الضربة، والكسر القذفي من اللوحة العلوية اليمنى. ثم استخدم زر أمر mis وبعد ذلك زر أمر caliper القياس لقياس معايير البطين الأيسر مثل سمك الجدار وقطر البطين. وأخيراً، تأكد من استخدام خيار save both image stacks and segmentation لحفظ الصور، بما في ذلك التقسيمات بصيغة dot mat، لإعادة معالجة الصور حسب الحاجة.

يمكن رؤية الزاوية التي تم بها تقطيع القلب للحصول على صورة العرض ثنائي الحجرات هنا. وهنا يمكننا ملاحظة زيادة تقريبية بمقدار 1.5 ضعف في سمك البطين الأيسر، مما يشير إلى وجود عيوب هيكلية في قلوب الفئران المصابة بالتهاب عضلة القلب المناعي الذاتي التجريبي مقارنة بالفئران السليمة. وقد انخفض نتاج القلب الذي تم قياسه بناءً على حجم البطين الأيسر والحجم الانبساطي والكسر القذفي في الفئران المصابة بالتهاب عضلة القلب المناعي الذاتي مقارنة بالفئران السليمة.

أخيرًا، تم تقييم الالتهاب في القلوب من مجموعات العلاج المذكورة أعلاه عن طريق صبغ الهيماتوكسيلين والإيوزين؛ حيث أظهر التقييم النسيجي لقلوب الفئران المصابة بالتهاب عضلة القلب، وليس الفئران السليمة، وجود ارتشاحات ليمفاوية متعددة البؤر. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم التأكد من بقاء درجة حرارة جسم الحيوان ثابتة حتى لا يتغير معدل ضربات القلب ومعدل التنفس بشكل ملحوظ أثناء التجارب. ويعد هذا الأمر بالغ الأهمية للحصول على نتائج قابلة للتكرار.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لتقنية التصوير المجهري بالرنين المغناطيسي لتقييم الاختلالات الوظيفية في أمراض القلب الالتهابية مثل التهاب عضلة القلب في الفئران. ولكن لا تنسَ أن العمل في المجالات المغناطيسية العالية يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا يجب أن يكون حامل الحيوان والمكونات الأخرى غير مغناطيسية.