تحديد الشركاء التفاعل البروتين في خلايا الثدييات عن طريق SILAC مناعي الكمي البروتيوميات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد شركاء تفاعل البروتين لبروتين معين ذي أهمية. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة الخلايا أولا في وسائط زراعة الخلايا التي تحتوي على الأرجينين والليسين المصنفة بنظائر مستقرة مختلفة من الكربون والنيتروجين. الخطوة الثانية هي نقل البلازميدات وطلاء البروتين ذي الأهمية أو البلازميد الضابط في الخلايا المصنفة.

بعد ذلك ، يتم تحلل الخلايا ويتم ترسيب العينات المناعية من المحلل. ثم يتم الجمع بين كميات متساوية من الرواسب المناعية للتحكم والعينة وتقديمها لتحليل LC MS MS. الخطوة الأخيرة هي تحليل بيانات قياس الطيف الكتلي لتحديد البروتينات التي تتفاعل مع البروتين محل الاهتمام.

في النهاية ، فإن وضع العلامات على النظائر المستقرة للأحماض الأمينية في زراعة الخلايا أو الترسبات الأمينية السيلاك قادرة على تحديد أعداد كبيرة من التفاعلات المباشرة وغير المباشرة مع البروتين ذي الأهمية من خلايا زراعة الأنسجة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل وضع العلامات على النقر ، هي أنها تزيل حاجة المحقق إلى إرسال نطاقات فردية من قياس الطيف الكتلي. هذا يزيل مصدرا مهما للتحيز مع زيادة الحساسية.

على الرغم من أنه يمكن استخدام هذه الطريقة لتوفير نظرة ثاقبة للبروتين الخلوي ، إلا أنه يمكن أيضا تطبيق تفاعلات البروتين على أنظمة أخرى مثل دراسة تفاعلات مضيف مسببات الأمراض. للبدء في كشط SLAC المسمى HEK 2 93 T الخلايا ، معبرة عن البروتين الموسوم ب GFP ذي الأهمية أو التحكم في GFP من طبق زراعة الخلية إلى PBS البارد المثلج ثم الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 220 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، اغسل الخلايا ثلاث مرات إضافية في 10 مل من PBS المثلج ، قم بإعادة تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من محلول تحلل الخلايا الذي يحتوي على كوكتيل مثبط البروتياز المضاف حديثا ثلاثة بتركيز X واحد وإضافة خمسة ميكرولترات من كوكتيل الحمض النووي الريبي لكل مليلتر من محلول التحلل ، واحتضانه على الجليد لمدة خمس دقائق. ثم قم بالطرد المركزي للخلية عند 13 ، 000 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية واحتفظ بالمادة الطافية كمحللة للخلية القابلة للذوبان.

قم بقياس تركيز البروتين في محللة الخلية باستخدام مقايسة BCA. ثم قم بتطبيع تركيز البروتين في كل عينة محللة في حجم نهائي قدره 500 ميكرولتر باستخدام مخزن التحلل الذي يحتوي على مثبطات البروتياز. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتخفيف يحتوي على كوكتيل مثبط للبروتياز x ثلاثة إلى كل من محللات الخلايا الطبيعية لضبط الحجم الكلي إلى مليلتر واحد.

احتفظ بالمحللات على الجليد أثناء تحضير الخرز المضاد ل GFP واحتفظ بكمية 50 ميكرولتر من كل عينة لاستخدامها في إدخال العينة. دوامة ملاط الخرزة لإعادة تعليق الخرز. ثم استخدم طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر مع القطع النهائي لنقل 25 ميكرولترا من الخرز لكل عينة إلى أنبوب جديد.

لكل 25 ميكرولتر من ملاط الخرز ، أضف 20 مجلدا من المخزن المؤقت للتخفيف للغسيل ، وقم بالطرد المركزي للحبات عند 2 ، 700 مرة G لمدة خمس دقائق. اغسل الخرزات إلى أوقات إضافية باستخدام 20 حجما من المخزن المؤقت للتخفيف. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتخفيف لكل 25 ميكرولتر من ملاط الخرز.

ثم استخدم طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر مع القطع النهائي لنقل 85 ميكرولترا من ملاط الخرزة المعلق إلى كل عينة من عينة اللايسات المسمى SLAC. احتضان العينات بالخرز على دوار عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين بعد احتضان العينات بالخرزات ، وقم بالطرد المركزي للعينات عند 2 ، 700 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. احتفظ ب 50 ميكرولترا من المادة الطافية كعينة غير مرتبطة وتخلص من ما تبقى من المادة الطافية.

أعد تعليق الخرزات في كل أنبوب في مليلتر واحد من المخزن المؤقت للتخفيف ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 2 ، 700 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. كرر خطوة الغسيل هذه مرتين لتصفية البروتين من الخرز. أضف 50 ميكرولترا من اثنين من المخزن المؤقت للتحميل XSDS إلى كل عينة وقم بتسخينه عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

بمجرد الانتهاء من التسخين ، قم بالطرد المركزي لكل عينة عند 2 ، 700 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. انقل المادة الطافية إلى أنابيب مشحمة مسبقا وخزنها على درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للتقديم لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد. ثم امزج كميات متساوية من التحكم وعينة من الرواسب الأمينية وأرسل العينة المدمجة إلى منشأة قياس الطيف الكتلي لتحليل LC ms MS.

قبل تحليل بيانات قياس الطيف الكتلي، انسخ البيانات الأولية إلى جدول بيانات جديد. ثم في جدول البيانات هذا ، قم بإزالة جميع الأعمدة باستثناء الأعمدة التي تحتوي على رقم الانضمام ، وعدد نسب الببتيدات الفريدة ، ومقارنة العينات ، وتباين النسبة ، ووصف البروتين. استخدم وظيفة الفرز في Excel لترتيب البيانات حسب عدد الببتيدات وإزالة إدخالات البروتينات التي تفتقر إلى أكثر من ببتيد واحد.

ثم قم بالفرز حسب النسبة وإزالة البروتينات التي تفتقر إلى نسب SLAC. بعد ذلك ، قم بتحويل نسب slac لتسجيل قيمتين. استخدام الصيغة يساوي أقواس السجل ونسبة SLAC اثنين والأقواس حيث يتم استبدال نسبة SLAC بمعرف الخلية.

ثم قم بإنشاء عمود جديد في ملف Excel وحساب تسجيل نسبتين من SLAC لجميع أعمدة عينة وهمية لتحويل نسبة عينة وهمية إلى نسبة وهمية عينة. استخدم الصيغة تساوي واحدا مقسوما على النسبة. افتح منشور GraphPad.

حدد جدول بيانات جديدين ورسم بياني حدد عمودا من القائمة الموجودة على الجانب الأيسر من النافذة وحدد إدخال بيانات الاستيراد. أدخل قيم النسخ المتماثلة المكدسة في خيارات الأعمدة. اضغط على إنشاء.

ثم حدد وانسخ سجل معين عينتين من عمود نسبة SLAC وهمي من جدول بيانات Excel إلى ملف المنشور الجديد. بعد ذلك ، انقر فوق القائمة المنسدلة إدراج القائمة وحدد تحليلا جديدا. ضمن تحليل العمود، حدد توزيع التردد.

احتفظ بالخيارات الافتراضية وانقر فوق موافق. في مجلد النتائج ، سيتم إنشاء قسم رسم بياني جديد. حدد قسم توزيع التردد ، ثم انقر فوق قائمة إدراج القائمة المنسدلة وحدد ملاءمة منحنى الانحدار غير الخطي للتحليل الجديد XY.

انقر فوق توزيع Gaussian وانقر فوق موافق. في نافذة النتائج التي تظهر ، يتم إعطاء المتوسط والانحراف المعياري. قم بإنشاء حد عن طريق إضافة 1.96 انحراف معياري إلى متوسط الإرجاع إلى ملف Excel.

أنشئ علامة تبويب جديدة تسمى انضمام عمود التسمية المدمج A وانسخ جميع أرقام الانضمام من كل تجربة من التجارب الفردية إلى هذا العمود الفردي. بعد ذلك ، حدد علامة تبويب البيانات ثم خيار إزالة التكرارات. ثم قم بإنشاء أعمدة لنسب SLAC وتباين النسبة من كل تجربة بالإضافة إلى عمود وصف اسم البروتين.

في علامة تبويب الوصف، استخدم صيغة VLOOKUP لتجميع وصف كل رقم وصول. اسحب الصيغة لأسفل العمود لملء وصف البروتين ، ثم استخدم هذه الصيغة للحصول على بيانات النسبة والتباين من التجارب الفردية. لتسليط الضوء على البروتينات المتفاعلة في مجموعة البيانات المجمعة ، لاحظ قيمة العتبة لتجربة معينة.

حدد عمود النسبة وانقر فوق علامة التبويب الصفحة الرئيسية. متبوعا بالتنسيق الشرطي ، قم بتمييز قواعد المزيد من القواعد ، ثم حدد نمط التنسيق الكلاسيكي الذي يبيع فقط الذي يحتوي على قيمة بيع أكبر من أو يساوي على. في المربع ، اكتب قيمة الانحراف المعياري 1.96 وانقر فوق موافق.

تقييم تباين النسبة لكل تفاعل إيجابي. إذا كان طرح التباين بالنسبة المئوية سيؤدي إلى انخفاض نتيجة إلى ما دون قيمة العتبة. يجب التعامل مع هذا بحذر.

كرر هذا لكل عمود من أعمدة النتائج وقارن عبر التجارب التي تم تمييزها والبروتينات التي تم تحديدها في تجربتين أو أكثر تمثل تفاعلا عالي الثقة. أكد تحليل اللطخة الغربية تنقية البروتين ذي العلامات GFP ذي الأهمية. يشير عدم وجود نطاق DH للفجوة في العينات المرتبطة إلى أن البروتينات غير المتفاعلة قد استنفدت من العينات من خلال خطوة الترسيب المناعي ، في حين أن وجود نطاق EIF 4G في هذه العينات يشير إلى الاحتفاظ بشركاء الربط المتفاعلين المعروفين.

تم الحفاظ على العديد من بروتينات ربط EIF الأربعة A المحددة بين الشكلين الإسوائيين. يتم تحديد البروتينات التي تتفاعل مع EIF four A من خلال نسبة LAC العالية ، في حين أن البروتينات غير المرتبطة على وجه التحديد في هذه التجربة لها نسب أقل من 0.96. في هذا الرسم البياني لمركب عامل البدء ، يتم تظليل بروتينات ربط EIF الأربعة A التي تم تحديدها في تجربة ترسيب الأمين SLAC باللون الأحمر إلى الأبيض.

وفقا لنسبة SLAC السجل الثاني ، توضح التغطية العالية لكل من شركاء الربط المباشر وغير المباشر لمجمعات EIF الأربعة A واحد واثنين فعالية هذا النهج لتحديد تفاعلات البروتين أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه في حين يمكن تعويض بعض الاختلافات في مستويات البروتين في مرحلة تحليل البيانات ، من الأفضل تجنب ذلك من خلال ضمان التطبيع الدقيق لمستويات مدخلات البروتين وتجنب فقدان حبات AROS أثناء خطوات الغسيل.