الجلوتامين الجريان التصوير باستخدام مجسات مشفرة وراثيا

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير نقل الجلوتامين عبر ناقل تم التعبير عنه بشكل متغاير في خلايا حية باستخدام مستشعرات نقل الطاقة الرنيني فورستر (fret). ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق ترنسفكشن خلايا cause seven بمستشعر جلوتامين وناقل. يتكون المستشعر من مانح fret مدرج في بروتين بكتيري رابط للجلوتامين، ومستقبل fret عند الطرف الكربوكسيلي (C terminus) للبروتين الرابط للجلوتامين.

تتمثل الخطوة الثانية في إعداد نظام تروية وتصوير الخلايا في الوقت الفعلي باستخدام مجهر فلوري مقلوب. وتتمثل الخطوة النهائية في تحليل الصور وتصور ديناميكيات الجلوتامين. وفي نهاية المطاف، يمكن الكشف عن أنشطة الناقلات في خلية واحدة باستخدام مستشعرات fret هذه.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل القياس القائم على الكروماتوغرافيا، في الحصول على دقة زمانية ومكانية أعلى بكثير. تتكون هذه التقنية من ثلاثة أجزاء: ترانسفكشن الخلايا ببروتينات استشعار، والتصوير في الوقت الحقيقي، والتحليل بعد التجربة. تُستخدم خلايا Seven في هذه التجربة نظراً لانخفاض نشاط نقل الجلوتامين الداخلي لديها.

قم بزراعة الخلايا بكثافة تبلغ حوالي 70 إلى 80% في وسط DMEM مضاف إليه 10% من مصل العجول الكوني (CCS) و 100 وحدة لكل ملليلتر من البنسلين والستربتومايسين في طبق زجاجي القاع مكون من ثماني آبار. تُحضن الخلايا عند 37 °C، و 5% CO2، ورطوبة 100% لمدة 24 ساعة.

بعد مرور 24 ساعة، استبدل وسط النمو بوسط DMEM مضافاً إليه 10% CCS بدون مضادات حيوية، واتركه ينمو طوال الليل عند 37 درجة Celsius، و 5% CO2 ورطوبة 100%. وفي يوم عفن الخلية (transfection)، أضف 0.4 micrograms من كل من DNA البلازميد الذي يشفر مستشعر الجلوتامين ومبادل الأحماض الأمينية الإلزامي الموصوم m cherry A SCT إلى 50 microliters من الوسط الخالي من المصل.

أضف 1 µL من كاشف عفن الخلايا (transfection reagent) إلى 50 µL من الوسط الخالي من المصل، واخلطهما برفق ثم احضنهما في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، اخلط المحلول الذي يحتوي على DNA مع كاشف عفن الخلايا المخفف واحضنهما في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. وبعد مرور 20 دقيقة، أضف خليط كاشف عفن الخلايا برفق فوق خلايا cost seven، واخلطهما برفق عن طريق هز الحجرة.

تُحضن الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 °C، و5%CO2، ورطوبة 100% بعد مرور 24 ساعة. يُستبدل الوسط بوسط DMEM مضافاً إليه 10%CCS و100 units من penicillin streptomycin. تُعاد الخلايا إلى الحاضنة قبل البدء بعملية التروية.

قم بتحضير محاليل التروية المنظمة من A إلى F باتباع الوصفات الواردة في المخطوطة المرفقة. قم بتوصيل صمامات الإيقاف بمحاقن سعة 50 milliliter. أغلق صمامات الإيقاف واملأ المحاقن بمحاليل التروية.

افتح صمام الإيقاف لفترة وجيزة لملء الفراغ الموجود في الصمام بالمحلول المنظم. بعد ذلك، قم بتشغيل نظام التروية بالجاذبية ثماني القنوات باستخدام قلم تروية واختيار الوضع اليدوي.

تحت خيار وظيفة الاختيار، ضع حاوية نفايات أسفل قلم التروية. لضمان نجاح هذه التجربة، من المهم إعداد عملية التروية بطريقة تقلل من الانزياح وانتقال المحلول.

قم بتنشيط المنافذ يدويًا بالضغط على الأرقام المقابلة واملأ الأنابيب بالماء. باستخدام حقنة سعة 10 milliliter، أغلق المنافذ، وضع الحقن التي تحتوي على المحاليل المنظمة من A إلى F على المنافذ من واحد إلى ستة في نظام التروية، ثم افتح صنابير الإيقاف. بعد ذلك.

افتح المنافذ مرة أخرى لاستبدال الماء الموجود في الأنابيب بالمحاليل المنظمة. يجب أن يكون معدل التدفق حوالي 0.8 milliliters per minute. اضغط على إلغاء مرة واحدة في وحدة التحكم في التروية للعودة إلى قائمة اختيار الوظائف.

قم بالتبديل إلى خيار تحرير البرنامج، ثم أدخل بروتوكول التروية الموضح في هذا الجدول. احفظ برنامج التروية. يتم تصوير الخلايا بعد 48 إلى 72 ساعة من عملية عفن التحول (transfection).

اغسل آبار الطبق ذو القاعدة الزجاجية مرتين باستخدام محلول التروية A، مع الحرص على عدم غسل الخلايا. ضع الطبق ذو القاعدة الزجاجية على منصة المجهر الفلوري. صِل نظام التروية بالغرفة.

في حال استخدام غرفة مفتوحة، قم بتجهيز مضخة أخرى لسحب محلول التروية من الغرفة. افتح برنامج تصوير الشرائح. ابدأ شريحة جديدة باستخدام وظيفة التركيز، وابحث عن الخلايا التي تعبر عن المستشعر و A SCT two M cherry باستخدام مجموعات المرشحات المناسبة.

اضبط الكسب عن طريق النقر على علامة تبويب الكاميرا وتحريك شريط التمرير الموجود أسفل الكسب. كما يجب ضبط إعداد مرشح الكثافة المحايدة من القائمة المنسدلة لمرشح الكثافة المحايدة. انقر على التقاط الصورة، ثم حدد المرشحات المراد استخدامها في نافذة الاستحواذ.

سيتم الحصول على الصور عبر ثلاث قنوات: استثارة المانح وانبعاث المانح، واستثارة المستقبل وانبعاث المستقبل. انقر فوق زر الاختبار لضبط وقت التعريض من خلال كتابة وقت التعريض المطلوب في المربع المجاور لإعدادات المرشح؛ حيث يجب تعريض القنوات الثلاث جميعها لنفس الفترة الزمنية.

قم برسم منطقة الاهتمام باستخدام أداة المناطق (regions tool). اختر "التصوير الزمني" (time-lapse) من مربع نوع الالتقاط. ثم حدد الفاصل الزمني والنقاط الزمنية للتجربة.

بعد ذلك، قم برسم منطقة في مساحة تخلو من أي خلايا فلورية لاستخدامها في طرح الخلفية. انقر بزر الماوس الأيمن على المنطقة المرسومة ثم قم بتعيينها كخلفية. ومن الناحية المثالية، يجب استخدام الخلايا التي لا تعبر عن المستشعرات كمنطقة خلفية لحساب كل من الفلورية الذاتية والفلورية الخلفية التي تلتقطها الكاميرا.

اختر البرنامج المطلوب من خيار select function run programs، ثم انتقل إلى البرنامج المحفوظ واضغط على مفتاح enter في وحدة التحكم في التروية (perfusion controller). يتم الآن تحميل البرنامج، وسيؤدي الضغط على أي مفتاح إلى بدء التروية لضمان بدء كل من عملية التروية وتجربة التصوير في الوقت ذاته. انقر فوق زر start في نافذة الالتقاط (capture window) بالتزامن مع الضغط على مفتاح في وحدة التحكم في التروية.

تظهر هنا تجارب المسار الزمني النموذجية باستخدام خلايا تعبر بشكل مشترك عن ناقل a s CT two ومستشعرات FRET للجلوتامين ذات ألفة تبلغ 8 millimolar و 100 micromolar. يتم الكشف عن تدفق الجلوتامين من خلال التغير في نسب شدة الفلورة بين المانح mtfp one والمستقبل Venus. كما يتم توضيح تدفق الجلوتامين في وجود الألانين كمادة ركيزة.

يمكن أيضاً فحص خصوصيات الناقلات باستخدام المستشعرات. هنا، تم تحميل الخلايا مسبقاً بالجلوتامين ثم أضيفت أحماض أمينية مختلفة إلى المحلول المروي خارج الخلوي. وكما كان متوقعاً، حفزت ثماني مواد ركيزة تدفق الجلوتامين، بينما لم تفعل الأحماض الأمينية التي لا تعتبر ركيزة ذلك.

قد يعود غياب التغيرات في كفاءة FRET عند إضافة الركيزة إلى عدة أسباب، مثل انخفاض قدرة الامتصاص للركيزة التي يتم اختبارها كما ظهر في الخلايا التي تعبر عن المستشعر بتركيز 8 millimolar أو المستشعر بتركيز 100 micromolar. ولكن لا يتم التعبير عن الناقل s CT two للتأكد من أن التغير في كفاءة FRET ناتج عن التغير الفعلي في الركيزة وليس عن تغير في عوامل أخرى. يتم تنفيذ بروتوكول التروية نفسه باستخدام خلايا تعبر عن مستشعر يُتوقع أن يكون مشبعاً في ظل الظروف التجريبية.

وفي هذا المثال، تبلغ ألفة المستشعر 1.5 micromolar. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصوير ديناميكيات المستقلبات باستخدام مستشعرات fret. لا تنسَ ضرورة التعامل مع المزارع الخلوية بشكل مناسب وفقاً لإجراءات التشغيل القياسية لتقليل مخاطر التعرض إلى أدنى حد.