الجلوتامين الجريان التصوير باستخدام مجسات مشفرة وراثيا

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير نقل الجلوتامين عبر ناقل عبر غير متجانس في الخلايا الحية باستخدام نقل طاقة الرنين الأول أو مستشعرات الحنق. يتم تحقيق ذلك عن طريق التحويل الأول سبع خلايا مع مستشعر الجلوتامين والناقل. يتكون المستشعر من متبرع الحنق الذي يتم إدخاله في بروتين مرتبط بالجلوتامين البكتيري ومتقبل الحنق في الطرف C لبروتين ربط الجلوتامين.

الخطوة الثانية هي إعداد نظام التروية وتصوير الخلايا في الوقت الفعلي باستخدام مجهر فلوري مقلوب. الخطوة الأخيرة هي تحليل الصور وتصور ديناميكيات الجلوتامين. في النهاية ، يمكن اكتشاف أنشطة الناقل في خلية واحدة باستخدام مستشعرات الحنق هذه.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل القياس القائم على الكروماتوغرافيا ، هي أنك تحصل على دقة زمنية مكانية أعلى بكثير. تتكون هذه التقنية من ثلاثة أجزاء ، تعداء الخلايا ببروتينات المستشعر ، والتصوير في الوقت الفعلي ، وتكلفة التحليل التجريبي. يتم استخدام سبع خلايا في هذه التجربة بسبب نشاطها المنخفض لنقل الجلوتامين الداخلي.

قم بزرع الخلايا بحوالي 70 إلى 80٪ من الطلاقة المشتركة في DMEM بالإضافة إلى 10٪ مصل ربلة الساق الكونية أو CCS و 100 وحدة لكل مليلتر. بنسلين ستربتومايسين في طبق قاع زجاجي من ثمانية آبار. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، 100٪ رطوبة لمدة 24 ساعة.

بعد 24 ساعة. استبدل وسط النمو ب DMEM بالإضافة إلى 10٪ CCS بدون مضادات حيوية تنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 100٪ رطوبة في يوم التعدين. أضف 0.4 ميكروغرام لكل من الحمض النووي للبلازما الذي يشفر مستشعر الجلوتامين ومبادل الأحماض الأمينية الإلزامي الموسوم m cherry A SCT من اثنين إلى 50 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل.

أضف ميكرولتر واحدا من كاشف التعداء إلى 50 ميكرولترا من مزيج الوسائط الخالية من المصل برفق واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، امزج المحلول الذي يحتوي على الحمض النووي مع كاشف التعداء المخفف واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. بعد 20 دقيقة ، أضف خليط كاشف النفقة برفق فوق سبع خلايا تكلفتها واخلطها برفق عن طريق هز الغرفة.

احتضن لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ CO2 ، و 100٪ رطوبة بعد 24 ساعة. استبدل الوسط ب DMEM بالإضافة إلى 10٪ CCS بالإضافة إلى 100 وحدة من البنسلين ستربتومايسين. أعد الخلايا إلى الحاضنة قبل بدء التروية.

قم بإعداد مخازن التروية من A إلى F باتباع الوصفات الموجودة في المخطوطة المصاحبة. قم بتوصيل إيقاف كوكس بمحاقن سعة 50 ملليلترا. أغلق ديوك الإيقاف واملأ المحاقن بمحاليل التروية.

افتح الديك التوقف لفترة وجيزة لملء فراغ الرأس في قضيب التوقف بالمخزن المؤقت. قم بالتبديل التالي على جاذبية ثماني قنوات. تغذية نظام التروية بقلم رصاص التروية وتحديد الوضع اليدوي.

ضمن خيار تحديد الدالة. ضع حاوية نفايات تحت قلم رصاص التروية. لنجاح هذه التجربة ، من المهم إعداد التروية بطريقة تقلل من الانجراف وانتقال الحل.

قم بتنشيط المنافذ يدويا عن طريق الضغط على الأرقام المقابلة وملء الأنابيب بالماء. باستخدام حقنة سعة 10 مليلتر ، أغلق المنافذ ، واضبط المحاقن التي تحتوي على المخازن المؤقتة من A إلى F على المنافذ من واحد إلى ستة من نظام التروية ، وافتح ديوك التوقف. بعد ذلك.

افتح المنافذ مرة أخرى لاستبدال الماء الموجود في الأنبوب بالمخازن المؤقتة. يجب أن يكون معدل التدفق حوالي 0.8 مل في الدقيقة. اضغط على إلغاء مرة واحدة على وحدة التحكم في التروية للعودة إلى قائمة وظائف التحديد.

قم بالتبديل إلى خيار تحرير البرنامج ، ثم اكتب بروتوكول التروية الموضح في هذا الجدول. احفظ برنامج التروية. يتم تصوير الخلايا بعد 48 إلى 72 ساعة بعد التعدين.

اغسل آبار الطبق السفلي الزجاجي مرتين باستخدام عازلة التروية A مع الحرص على عدم غسل الخلايا. ضع الطبق السفلي الزجاجي على مسرح المجهر الفلوري. قم بتوصيل نظام التروية بالغرفة.

إذا تم استخدام غرفة مفتوحة ، فقم بإعداد مضخة أخرى تزيل محلول التروية من الغرفة. افتح برنامج تصوير دفتر الشرائح. ابدأ شريحة جديدة باستخدام وظيفة التركيز ، وابحث عن الخلايا coex التي تعبر عن المستشعر و SCT two M cherry باستخدام مجموعات المرشحات المناسبة.

اضبط الكسب بالنقر فوق علامة تبويب الكاميرا وتحريك شريط التمرير أسفل الكسب. أيضا ، اضبط إعداد مرشح الكثافة المحايدة من القائمة المنسدلة لمرشح الكثافة المحايدة. انقر فوق التقاط الصورة، ثم في نافذة الاكتساب، حدد عوامل التصفية المراد استخدامها.

سيتم الحصول على الصور في ثلاث قنوات. إثارة المتبرع ، إثارة المتبرع بانبعاثات المتبرعين ، مهمة القبول ومهمة قبول الإثارة المتقبلة. انقر فوق زر الاختبار لضبط وقت التعرض عن طريق كتابة وقت التعريض الضوئي المطلوب في المربع بجانب إعدادات الفلتر ، يجب أن تكون جميع القنوات الثلاث مكشوفة لنفس المدة الزمنية.

ارسم منطقة اهتمام باستخدام أداة المناطق. حدد اللقطات المتتابعة في مربع نوع الالتقاط. ثم حدد الفاصل الزمني والنقاط الزمنية للتجربة.

بعد ذلك ، ارسم منطقة في منطقة لا تحتوي على أي خلايا فلورية لاستخدامها في طرح الخلفية. انقر بزر الماوس الأيمن فوق المنطقة المرسومة ثم قم بتعيينها كخلفية. من الناحية المثالية ، يجب استخدام الخلايا التي لا تعبر عن المستشعرات كمنطقة خلفية لحساب كل من التألق الذاتي ومضان الخلفية الذي تكتشفه الكاميرا.

حدد البرنامج المطلوب ضمن خيار تشغيل الوظيفة ، وقم بالتبديل إلى البرنامج المحفوظ ثم اضغط على Enter في وحدة التحكم في التروية. يتم الآن تحميل البرنامج وسيؤدي الضغط على أي مفتاح إلى بدء التروية لضمان بدء كل من التروية وتجربة التصوير في نفس الوقت. انقر فوق زر البدء في نافذة الالتقاط في نفس الوقت الذي تضغط فيه على مفتاح على وحدة التحكم في التروية.

تظهر هنا تجارب نموذجية للدورة الزمنية باستخدام الخلايا coex التي تعبر عن أجهزة استشعار الجلوتامين المقطعية والمحمولة مع تقاربات تبلغ ثمانية مللي مولار و 100 ميكرومولار. تم الكشف عن تدفق الجلوتامين على أنه التغيير في نسب شدة التألق بين المتبرع mtfp واحد والزهرة المتقبل. كما يظهر تدفق الجلوتامين في وجود الألانين ركيزة.

يمكن أيضا فحص خصوصيات الناقلات باستخدام أجهزة الاستشعار. هنا ، تم تحميل الخلايا مسبقا بالجلوتامين ثم تمت إضافة أحماض أمينية مختلفة إلى النفهات خارج الخلية. ثمانية كما هو متوقع ، تسببت ركيزتان CT في تحفيز الجلوتامين flx ، في حين أن الأحماض الأمينية غير الركيزة لم تفعل ذلك.

يمكن أن يرجع عدم وجود تغييرات في كفاءة الحنق عند إضافة الركيزة إلى عدة أسباب ، مثل انخفاض قدرة الامتصاص للركيزة التي يتم اختبارها كما هو موضح في الخلايا التي تعبر عن مستشعر ثمانية مللي مولار أو مستشعر 100 ميكرومولار. لكن هذا لا يعبر عن ناقل CT الثاني لتأكيد أن تغيير كفاءة الحنق يرجع إلى التغيير الفعلي في الركيزة وليس التغيير في المعلمات الأخرى. يتم تنفيذ نفس بروتوكول التروية باستخدام الخلايا التي تعبر عن جهاز استشعار من المتوقع أن يكون مشبعا في ظل الحالة التجريبية.

وهذا المثال، تقارب المستشعر هو 1.5 ميكرومولار. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصوير ديناميكيات المستقلبات باستخدام مستشعرات الحنق. لا تنس أنه يجب التعامل مع زراعة الخلايا بشكل مناسب باتباع إجراءات التشغيل القياسية بحيث يتم تقليل مخاطر التعرض.