تحليل الأضرار الظهارية التي تنتجها المتحولة الحالة للنسج عدوى

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم التفاعلات المبكرة لمسببات الأمراض المضيفة وإمكانية غزو TBA. الهيستوليتيكا. قم أولا بإجراء الاستعدادات للتروفوزويت السليمة ، أو التروفوزويت ، أو التحلل الكلي أو التروفوزويت المفرز. ثم احتضان الخلايا الظهارية المضيفة بتركيزات مناسبة من التروفوزويت المختلفة.

الآن باستخدام التألق المناعي AM ، قم بتحليل الثقافات الظهارية المعالجة بحثا عن بروتينات ABA النسيجية المختارة التي تتفاعل مع التقاطعات الضيقة للخلايا الظهارية ، كما تقيس التغيرات في الحاجز شبه الخلوي عن طريق المقاومة الكهربائية عبر الظهارة. يمكن أن تظهر النتائج مجتمعة تفكيك الوصلة الضيقة بواسطة TBA Histolytica ، وكذلك تحديد مشاركة المجمعات المختارة في هذه العملية. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في استخدام منتجات مختلفة من الطفيلي لتقييم انتقال عوامل إيفا النسيجية إلى ظهارة المضيف ، وكذلك لإثبات مشاركة هذه الإيفا.

عوامله على فتح تقاطع الخلايا بأكملها في وقت مبكر جدا من الإصابة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الأميبا ، مثل فهم التفاعلات الجزيئية بين الطفيلي الظهاري والمغنية. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنهم لا يعرفون نسبة أوقات الحضانة المناسبة لأوقات الخلية لاحتضانة مشتركة ، وكذلك كيفية الحصول على منتجات ELI المختلفة وكيفية قياس TER.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاجنا للأمراض العضلية المزمنة لأن هذه العوامل الفيروسية مثل مركب E-H-C-P-A-D-H 112 يمكن استغلالها كأهداف في استراتيجيات العلاج الجديدة. أربعة. يمكن أن توفر هذه الطريقة المختبرية نظرة ثاقبة لمشاركة عامل أنيكا الفيروسي في التفاعل الأولي لموقع المستشفى. يمكن تطبيقه أيضا على أنظمة أخرى مثل inbivo ، ونماذج العدوى في فئران الهامستر ، وخنازير غينيا ، وكذلك في خزعات الأمعاء البشرية. ثقافة.

خلايا MDCK في 10 ملليلتر من وسائط DMEM المكملة عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية. تنمو أصلية مرة واحدة في 10 إلى الخامس تروفوزويت من تنفيس الأميبا النسيجية في 15 مل من TYIS 33 ، متوسطة عند 37 درجة مئوية. لفصل التروفوزويت ، قم بتبريد الأنبوب لمدة خمس إلى 10 دقائق في حمام ماء مثلج.

ثم انقل المزرعة بشكل معقم إلى أنبوب مخروطي الشكل وجهاز طرد مركزي عند 360 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. الآن ، صب بعناية الطافية. أضف PBS المثلج البارد إلى الحبيبات واقلب الأنبوب عدة مرات لتفريق الخلايا بعد الطرد المركزي.

حدد عدد التروفوزويت باستخدام مقياس الخلوي الدموي لتجميد التروفوزويت المفاجئ في النيتروجين السائل لمدة دقيقة واحدة ، والذوبان عند أربع درجات مئوية والدوامة بقوة. الآن قم بتنشيط البروتياز الموجود في المحللات بنسبة 0.02٪ بيتا ميركابتو إيثانول. خفف تسعة مرات 10 إلى ستة تروفوزويت في ثلاثة ملليلتر من PBS المثلج ، وانقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا.

الآن ضع تعليق tropho بزاوية أفقية مائلة بخمس درجات في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ساعتين لجمع المنتجات المفرزة ، والطرد المركزي للأنبوب عند 360 مرة G لمدة 10 دقائق. استخدم حقنة معقمة يمكن التخلص منها لجمع المادة الطافية بعناية ، وتجنب تلوث العينات بالتروفوزويت من الحبيبات. ثم للتخلص من أي خلايا منقولة ، قم بتمرير المادة الطافية عبر غشاء أسيتات السليلوز 0.22 ميكرون.

الآن قم بتنشيط البروتياز باستخدام 0.02٪ بيتا ميركابتو إيثانول لثقافة التألق المناعي. تنزلق خلايا MDCK على غطاء زجاجي معقم داخل 24 طبق ثقافة خلوي متعدد البئر. افحص الخلايا على المجهر المقلوب حتى تصل إلى التقاء 100٪.

أضف الظروف المختلفة للتروفوزويت المخفف في مليلتر واحد من PBS الدافئ. قم بتضمين ظروف التحكم في خلايا MDCK مع PBS وليس e histolitica ، بالإضافة إلى خلايا MDCK ذات الظروف المختلفة للتروفوزويت ، ولكنها تنبعث منها حضانة مع الأجسام المضادة الأولية. ضع لوحة الثقافة في الحاضنة لمدة دقيقتين أو 30 دقيقة.

بعد ذلك ، اغسل الخلايا الظهارية خمس مرات باستخدام PBS البارد للتخلص من الجزيئات غير المرتبطة أو التروفوزويت. قم بإصلاح الخلايا واختراعها بمليلتر واحد من 96٪ من الإيثانول لدقائق عند سالب 20 درجة مئوية في غرفة رطبة. أخرج الغطاء من الآبار بعناية.

قم بإزالة السائل الزائد من الحافة باستخدام ورق الترشيح واغمر زلة الغطاء بحيث تكون الخلايا متجهة لأسفل في محلول حجب BSA بنسبة 0.5٪. احتضان العينات لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في هذه الأثناء ، قم بإعداد خليط من الأجسام المضادة الأولية في PBS.

ارفع زلات الغطاء من محلول الحظر. جفف أي سائل زائد على ورق الترشيح. انقل الخلايا إلى محلول الجسم المضاد واحتضان العينات طوال الليل عند أربع درجات مئوية.

اغسل الخلايا خمس مرات بمليلتر واحد من PBS لإزالة الجزيئات غير المرتبطة. الآن قم بإعداد خليط من الأجسام المضادة الثانوية الفلورية في PBS. احتضان العينات في الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام للتلوين النووي.

احتضان الخلايا لمدة ثلاث دقائق ب 200 ميكرولتر من محلول دابي 0.05 مللي مولار في درجة حرارة الغرفة في الظلام. الآن ، قم بتحليل الاستعدادات عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر من خلال أقسام Zack وطائرات XZ في تجارب الحضانة المشتركة. باستخدام مثبطات الإنزيم البروتيني أو جسم مضاد معين ، احتضان كل حالة تجريبية لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية باستخدام مثبطات الإنزيم البروتيني أو ثقافة الأجسام المضادة أحادية النسيلة.

خلايا MDCK على دعامات معقمة قابلة للاختراق في المقصورة العلوية ، ضع 100 ميكرولتر من التعليق الخلوي وفي المقصورة السفلية ضع 600 ميكرولتر من وسط DMEM التكميلي. ضع مرشحات transwell المحضرة في الحاضنة على مجهر مقلوب. تحقق من أن الخلايا ملتقية بنسبة 100٪.

اجمع الوسط وجمعه من المقصورة العلوية لكل بئر إلى 50 ميكرولتر من خليط الوسائط هذا. أضف 50 ميكرولترا من تعليق التروفوزويت أو التحكم في PBS. الآن انقل المخاليط إلى الغرفة العلوية لكل بئر يحتوي على خلايا MDCK.

على الفور بغمس قطبين كهربائيين STX في كل بئر لقياس المقاومة الكهربائية الظهارية العابرة. تأكد من أن القطب الأطول يلامس الجزء السفلي من الغرفة السفلية وأن القطب الأقصر مغطى بوسيط في المقصورة العلوية. تم استزراع E histolitica في ظل ظروف لهجة وتم حصادها في المرحلة اللوغاريتمية المتأخرة إلى المرحلة الثابتة المبكرة من النمو.

هنا ، تم استخدام علامة الوصلة الضيقة صفر واحد لتصور ملامسات الخلايا للخلايا الظهارية التي يتم تثبيتها بواسطة تقاطعات ضيقة والالتصاق. تم استخدام التألق المناعي مع الجسم المضاد أحادي النسيلة لدراسة تفاعل المركب المشتق من الأميبا مع التطبيق السطحي الظهاري للتروفوزويت أو التروفوزويت أو التحلل الكلي أو المنتجات المفرزة في الطبقة الأحادية الظهارية مما أدى إلى تموضع المركب مع تقاطع ضيق. بعد 30 دقيقة ، تم تطوير تلطيخ ZO واحد متقطع عند حدود الخلية واستيعاب الحويصلات.

كان هذا الاضطراب أكثر بروزا في ملامسات خلايا MDCK مع التروفوزويت والتروفوزويت. أشار الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر الكلي إلى أن مركب الفوعة اخترق الفضاء بين الخلايا. التوطين المشترك مع التلامس الطفيلي المتلطخ ze O واحد ، أدى إلى تعطيل وظيفة الحاجز الظهاري وأدى إلى انخفاض بنسبة 90٪ في المقاومة الكهربائية عبر الظهارة.

أدى الحضانة المسبقة للتروفوزويت بجسم مضاد للمركب أو مع مثبطات الإنزيم البروتيني إلى الحماية من قطرة TER المأخوذة. معا. تشير هذه البيانات إلى أن كلا من النشاط المحلل للبروتين وخصائص اللصق هما من عوامل الفوعة المهمة لهذا المركب أثناء غزو الأنسجة الإلكترونية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل الآليات التي من خلالها EMBA inteletica الفيروسي في العوامل التي تفتح تقاطعات ضيقة في أوقات الإصابة المبكرة عندما يتقن هذا التحليل للضرر الظهاري يمكن إجراؤه في ثلاث ساعات بمجرد أن تصبح منتجات lya ومزارع الخلايا جاهزة.

أثناء الحصول على هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الالتزام بأوقات التفاعل الدقيقة للأيونات باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل فحوصات الترسيب المناعي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل الارتباطات المحتملة بين enba وعوامل العنف النسيجية والبروتينات الظهارية بعد تطورها. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التفاعلات الجانبية لاستكشاف التسبب في AMS في فئران الهامستر وخنزير غينيا والأنسجة البشرية.