تحليل الأضرار الظهارية التي تنتجها

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم التفاعلات المبكرة بين المضيف والممرض وإمكانية غزو TBA.Histolytica. أولاً، قم بتحضير التروفوزويتات السليمة، أو التروفوزويتات، أو نواتج التحلل الكلي، أو الإفرازات التروفوزويتية. بعد ذلك، قم بتحضين الخلايا الظهارية للمضيف مع تركيزات مناسبة من التروفوزويتات المختلفة.

الآن، باستخدام التألق المناعي AM، قم بتحليل المزارع الطلائية المعالجة للكشف عن بروتينات مختارة من *E. histolytica* التي تتفاعل مع الوصلات المحكمة للخلايا الطلائية، وقم أيضًا بقياس التغيرات في الحاجز بين الخلايا عن طريق قياس المقاومة الكهربائية عبر الطلائية. وبشكل مجتمع، يمكن للنتائج أن توضح تفكك الوصلات المحكمة بواسطة *E. histolytica*، وتحدد بدقة مشاركة المعقدات المختارة في هذه العملية. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في استخدام منتجات مختلفة للطفيلي لتقييم انتقال عوامل *E. histo* إلى طلائية المضيف، بالإضافة إلى إثبات مشاركة هذه العوامل.

عوامل تأثير فتح الموصلات في الخلايا الكاملة في أوقات مبكرة جداً من العدوى. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال دراسة الأميبا، مثل فهم التفاعلات الجزيئية بين الخلايا الطلائية والطفيل. وبشكل عام، سيواجه الأفراد الجدد في هذه الطريقة صعوبة لأنهم لا يعرفون أوقات الحضن المناسبة، ونسبة نوعي الخلايا اللازمة للحضن المشترك، وكذلك كيفية الحصول على منتجات ELI المختلفة وكيفية قياس TER.

تمتد تداعيات هذه التقنية إلى علاجنا للأميبا لأن عوامل الفيروس هذه، مثل معقد E-H-C-P-A-D-H 112، يمكن استغلالها كأهداف في استراتيجيات علاجية جديدة. رابعاً، يمكن لهذه الطريقة المختبرية (in vitro) أن توفر رؤية متعمقة حول مشاركة العامل الفيروسي في التفاعل الأولي مع موقع الإصابة. كما يمكن تطبيقها على أنظمة أخرى مثل نماذج العدوى في الجسم الحي (in vivo) في الهامستر والفئران وخنازير غينيا، وكذلك في الخزعات المعوية البشرية. الزرع.

توضع خلايا MDCK في 10 milliliters من وسط DMEM المكمل عند 5% carbon dioxide و 37 degrees Celsius. يتم استنبات 1 times 10 to the fifth من تروفوزويتات Entamoeba histolytica الأصلية في 15 milliliters من وسط TYIS 33 عند 37 degrees Celsius. ولفصل التروفوزويتات، يتم تبريد الأنبوب لمدة تتراوح من خمس إلى 10 minutes في حمام مائي جليدي.

بعد ذلك، انقُل المزرعة بطريقة معقمة إلى أنبوب مخروطي، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 360 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C. الآن، اسكب السائل الطافي بعناية. أضف محلول PBS المبرد بالثلج إلى الراسب، واقلب الأنبوب عدة مرات لتشتيت الخلايا بعد عملية الطرد المركزي.

حدد عدد التروفوزويتات (trophozoites) باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer)، ثم قم بتحليل التروفوزويتات عن طريق التجميد السريع في النيتروجين السائل لمدة دقيقة واحدة، ثم الإذابة عند 4 °C والرج بقوة باستخدام جهاز الفورتكس. بعد ذلك، قم بتنشيط البروتيازات الموجودة في النواتج المحللة باستخدام 0.02% beta mercaptoethanol. خفف 9 × 10⁶ من التروفوزويتات في 3 mL من محلول PBS المبرد بالثلج، وانقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 mL.

الآن، ضع معلق التروفوزويتات بزاوية أفقية مائلة بمقدار خمس درجات في حضانة عند درجة حرارة 37 degrees Celsius لمدة ساعتين لجمع النواتج المفرزة، ثم قم بطرد مركزي للأنبوب بسرعة 360 times G لمدة 10 minutes. استخدم سرنجة معقمة وتستخدم لمرة واحدة لجمع السائل الطافي بعناية، مع تجنب تلوث العينات بالتروفوزويتات الموجودة في الراسب. بعد ذلك، وللقضاء على أي خلايا منقولة، مرر السائل الطافي عبر غشاء من أسيتات السليلوز بمسامية 0.22 micron.

قم الآن بتنشيط البروتياز باستخدام 0.02% beta mercaptoethanol من أجل زراعة التألق المناعي. توضع خلايا MDCK على شرائح زجاجية معقمة داخل طبق زراعة خلايا متعدد الفجوات مكون من 24 فجوة. افحص الخلايا باستخدام المجهر المقلوب حتى تصل إلى 100% confluence.

أضف الظروف المختلفة للأتاريفات (trophozoites) المخففة في 1 mL من محلول PBS الدافئ. قم بتضمين ظروف التحكم لخلايا MDCK مع محلول PBS وبدون وجود *E. histolytica*، بالإضافة إلى خلايا MDCK مع الظروف المختلفة للأتاريفات، مع استبعاد فترة التحضين مع الأجسام المضادة الأولية. ضع طبق الزرع في الحاضنة لمدة 30 دقيقة أو دقيقتين.

بعد ذلك، اغسل الخلايا الظهارية خمس مرات باستخدام PBS بارد للتخلص من الجزيئات أو التروفوزويتات غير المرتبطة. قم بتثبيت الخلايا ونفاذيتها باستخدام 1 mL من الإيثانول بتركيز 96% لعدة دقائق عند درجة حرارة -20 °C في غرفة رطبة. أخرج شرائح التغطية من الآبار بعناية.

قم بإزالة السائل الزائد من الحافة باستخدام ورق ترشيح، ثم اغمر شريحة التغطية بحيث تكون الخلايا متجهة للأسفل في محلول حجب BSA بتركيز 0.5%. احضن العينات لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. وفي هذه الأثناء، قم بتحضير مزيج من الأجسام المضادة الأولية في PBS.

ارفع شرائح التغطية من محلول الحجب. جفف أي سائل زائد باستخدام ورق ترشيح. انقل الخلايا إلى محلول الأجسام المضادة واحضن العينات طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C.

اغسل الخلايا خمس مرات باستخدام 1 mL من PBS لإزالة الجزيئات غير المرتبطة. الآن، قم بتحضير خليط من الأجسام المضادة الثانوية الفلورية في PBS. قم بحضن العينات في الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام لإجراء الصبغ النووي.

يتم تحضين الخلايا لمدة ثلاث دقائق مع 200 µL من محلول dappy بتركيز 0.05 mM في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام. بعد ذلك، يتم تحليل التحضيرات باستخدام المجهر البؤري (confocal microscopy) عبر المقاطع Zack ومستويات XZ في تجارب التحضين المشترك. وباستخدام مثبطات البروتياز أو جسم مضاد محدد، يتم تحضين كل حالة تجريبية لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C مع مثبطات البروتياز أو مزرعة أجسام مضادة أحادية النسيلة.

ضع 100 microliters من المعلق الخلوي لخلايا MDCK على دعامات نفاذة ومعقمة من نوع transwell في الحجرة العلوية، وفي الحجرة السفلية ضع 600 microliters من وسط DMEM المكمل. ضع مرشحات transwell المُجهزة في الحاضنة فوق مجهر مقلوب. تحقق من أن الخلايا قد وصلت إلى حالة التلاقي التام (100% confluent).

اجمع واخلط الوسط من الحجرة العلوية لكل transwell حتى تصل كمية هذا المزيج من الوسط إلى 50 µL. أضف 50 µL من معلق الـ trophozoites أو PBS كعينة ضابطة. الآن انقل المخاليط إلى الحجرة العلوية لكل transwell تحتوي على خلايا MDCK.

اغمس قطبي STX فوراً في كل transwell لقياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارة. تأكد من أن القطب الأطول يلامس قاع الغرفة السفلية وأن القطب الأقصر مغطى بالوسط في الحجرة العلوية. تم استزراع E histolytica تحت ظروف accent وحُصدت في المرحلة اللوغاريتمية المتأخرة إلى بداية المرحلة الثابتة من النمو.

هنا، استُخدم مؤشر الوصلات المحكمة ZO-1 لتصوير نقاط اتصال الخلايا الظهارية التي يتم تثبيتها بواسطة الوصلات المحكمة والوصلات اللاصقة. واستُخدم التألق المناعي باستخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة لدراسة التفاعل بين المعقد المشتق من الأميبا وسطح الخلايا الظهارية؛ حيث أدى تطبيق التروفوزويتات (trophozoites)، أو نواتج التحلل الكلي، أو المنتجات المفرزة على الطبقة الظهارية أحادية الخلية إلى التوضع المشترك للمعقد مع الوصلات المحكمة. وبعد مرور 30 دقيقة، ظهر صبغ غير مستمر لـ ZO-1 عند حدود الخلايا مع حدوث استيعاب خلوي داخل الحويصلات.

كان هذا التعطيل أكثر بروزاً في نقاط تلامس خلايا MDCK مع التروفوزويتات (trophozoites). وأشار الفحص بالمجهر الليزري البؤري للمحللات الكلية إلى أن معقد الضراوة قد اخترق باتجاه الحيز بين الخلوي. وقد ترافق ذلك مع تضرر صبغ ZO-1 في نقاط تلامس الطفيليات، مما أدى إلى تعطل وظيفة الحاجز الظهاري ونتج عنه انخفاض بنسبة 90% في المقاومة الكهربائية عبر الظهارة.

أدى التحضين المسبق للتروفوزويتات (trophozoites) باستخدام جسم مضاد للمُعقد أو باستخدام مثبطات البروتياز إلى توفير حماية ضد انخفاض قيمة TER. تشير هذه البيانات مجتمعة إلى أن كلاً من النشاط البروتيني والخصائص اللاصقة تمثل عوامل ضراوة مهمة لهذا المُعقد أثناء غزو *E. histolytica*. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل الآليات التي تفتح من خلالها عوامل ضراوة *E. histolytica* الموصلات المحكمة في الأوقات المبكرة من العدوى. بمجرد إتقان ذلك، يمكن إجراء هذا التحليل للتلف الظهاري في غضون ثلاث ساعات بمجرد تجهيز منتجات lya والمزارع الخلوية.

أثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الالتزام بأوقات التفاعل الدقيقة للأيونات المتبعة في هذا البروتوكول. ويمكن إجراء طرق أخرى مثل مقاييس الترسيب المناعي للإجابة على أسئلة إضافية مثل الارتباطات المحتملة بين عوامل الضراوة في *E. histolytica* والبروتينات الظهارية بعد تطويرها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التفاعلات الجانبية لاستكشاف إمراضية مرض AMS في الهامستر، وخنازير غينيا، وفي الأنسجة البشرية.