في الكشف الموضعي للخلايا CD4 T Autoreactive في الدماغ والقلب عن طريق التوافق النسيجي الرئيسية الدرجة الثانية مجمع Dextramers

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن الخلايا التائية ذات التفاعلية الذاتية بدرجة عالية من النوعية باستخدام ثلاثيات MHC من الفئة الثانية. في هذا الفيديو، يتم استخلاص النسيج الدماغي من دماغ فأر مصاب بالتهاب الدماغ والنخاع المناعي التجريبي المستحث ببروتين الدهون البروتينية المييلينية. ويتم تحقيق ذلك من خلال حصاد الأنسجة بعناية أولاً ثم تحضير كتل الـ aros.

تتمثل الخطوة الثانية في تقطيع النسيج المغمور في الأجار إلى مقاطع بسمك 200 micrometer باستخدام الميكروتوم. ثم تُنقل هذه المقاطع إلى غرف الأنسجة في طبق يحتوي على 24 well حيث يتم صبغها وتثبيتها. والخطوة النهائية هي تثبيت مقاطع النسيج على شرائح مجهرية.

في نهاية المطاف، يُستخدم المجهر البؤري (confocal microscopy) لإظهار الخلايا المرتبطة بـ dex trimmers والأجسام المضادة لـ CD four. وقد تبلورت هذه الفكرة لدينا عندما أثبتنا لأول مرة أن MHC class two dextro ERs كانت أكثر حساسية من MHC Class two tetramers التقليدية في الكشف عن خلايا CD four T ذات التفاعل الذاتي والنوعية للعامل.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن خطوات التقطيع والتثبيت والتحليل يصعب تعلمها نظراً لدقتها وتعقيدها. بالإضافة إلى Ting، سيقوم كل من Chandy وAaron، وهما باحثان في مرحلة ما بعد الدكتوراه من مجموعتي، وChristian من مختبر الدكتورة Zoe بتقديم عرض توضيحي لهذا الإجراء. بعد القتل الرحيم للفئران المصابة بالتهاب الدماغ والنخاع المناعي التجريبي أو EAE، يتم استئصال الجمجمة عن طريق قص القحف بشكل دائري باستخدام مقص منحني، ثم رفع عظام الجمجمة بعناية باستخدام الملقط. بعد ذلك، يتم استخراج الدماغ عن طريق التشريح غير الحاد باستخدام مشرط نظيف.

افصل الـ rerum عن المخيخ. ضع الـ rerum في أنبوب يحتوي على phosphate buffered saline أو PBS بارد بتركيز one x واترك الأنبوب على الثلج حتى بدء المعالجة. ضع الـ rerum في كاسيت نسيجي (histology cassette) ذي قاعدة عميقة مخصص للاستخدام مرة واحدة ومحفوظ فوق الثلج.

بعد ذلك، صب مادة الأغار (aros) منخفضة درجة الانصهار والمخففة بمحلول 4% PBS المنصهرة داخل الكاسيت. اضغط على المخ بلطف وباستخدام ملقط فوراً لغمر النسيج، واترك الكاسيت على الثلج حتى يكتمل التصلب. بمجرد التصلب، قم بتقليم الأغار الزائد من جميع جوانب النسيج المضمن، وكشف السطح البطني للمخ قليلاً.

بعد ذلك، يتم وضع طبقة من الغراء السريع (super glue) على كتلة نسيج Vibram، ثم يتم نقل النسيج المغمور في aros فوق السطح المغمى بغراء عن طريق وضع السطح البطني المكشوف للدماغ فوق الغراء لإجراء القطاعات العرضية. لا تحرك النسيج بمجرد تثبيته فوق الكتلة. ضع كتلة vibrate tone التي تحتوي على النسيج المغمور في aros على الثلج واترك الغراء ليجف لمدة 15 دقيقة.

في هذه الأثناء، ضع غرف الأنسجة المُجهزة في طبق يحتوي على 24 بئراً، بمعدل غرفة واحدة في كل بئر. املأ الآبار التي تحتوي على غرف الأنسجة بـ 1 mL من محلول 1X PBS البارد واترك الطبق على الثلج. بمجرد جفاف الغراء، اخفض شفرة الهزاز إلى مستوى السطح العلوي للنسيج.

اضبط سرعة جهاز Vibram على 0.22 مليمتر في الثانية وابدأ بعملية التقطيع بحركة أمامية للحصول على مقاطع بسمك 200 ميكرومتر. باستخدام فرشاة مائية ناعمة، انقل مقطعاً دماغياً واحداً إلى كل غرفة أنسجة. في طبق الـ 24 عيناً، احتفظ بالطبق على الثلج حتى اكتمال عملية التقطيع لمنع تحلل الأنسجة.

بعد ذلك، قم بتحضير لوحة ثانية مكونة من 24 بئراً عن طريق إضافة 300 microliters من مزيج يحتوي على IA of S myelin protio lipid protein 1 39 to 1 51 dextro و CD four antibody إلى ثلاثة من الآبار. ثم أضف 300 microliters من مزيج التحكم IA of S Tyler's murine encephalomyelitis virus 70 to 86 dextro و CD four antibody إلى مجموعة أخرى مكونة من ثلاثة آبار. انتقل بعد ذلك إلى تسمية الآبار.

بعد ذلك، انقل ثلاث غرف أنسجة تحتوي على المقاطع المخصصة للتصبيغ باستخدام dex trimmers النوعية إلى الآبار الثلاثة المحددة في الطبق ذي الـ 24 بئراً، بمعدل غرفة واحدة لكل بئر. وبالمثل، انقل غرف الأنسجة الثلاث التي تحتوي على المقاطع المخصصة للتصبيغ باستخدام dex streamers المضبوطة إلى تلك الآبار. مع وضع غرفة واحدة في كل بئر، قم بتغطية الآبار بغطاء.

غلف الطبق بورق الألومنيوم وضعه على منصة هزازة مضبوطة على دوران لطيف لمدة 1.5 hours في الظلام وفي درجة حرارة الغرفة. بعد فترة التحضين، اغسل مقاطع الأنسجة بنقلها إلى بئر جديدة تحتوي على 1 mL من محلول غسيل XPBS البارد لمدة 10 minutes على الأقل على المنصة الهزازة. كرر عملية الغسيل ثلاث مرات.

تأكد من عدم جفاف مقاطع الأنسجة لأنها قد تلتصق بجوانب الغرفة. قم بتثبيت المقاطع عن طريق نقل غرف الأنسجة إلى بئر جديدة من طبق ذو 24 بئرًا يحتوي على 1 mL من مادة para formaldehyde الموقّتة بـ 4%PBS المفلترة، ثم حضنها على منصة هزازة لمدة ساعتين مع تدوير لطيف.

بعد غسل القطاعات ثلاث مرات إضافية، ضع القطاعات المصبوغة والمثبتة على شريحة مجهرية نظيفة. وباستخدام فرشاة ألوان مائية ناعمة، امسح الماء الزائد دون لمس القطاع، ثم قم بتثبيت القطاع باستخدام وسط تثبيت. غطِ الشريحة بغطاء مجهري واترك الشرائح لتجف في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.

في الغرفة المظلمة، استخدم نظام المجهر البؤري Nikon A one Eclipse 90 I لإجراء المسح الروتيني واكتساب الصور. للبدء، افتح برنامج NIS elements AR، واختر قنوات tetraethyl, rumine, isothiocyanate أو Trit C و cyan five أو SCI five من اللوحة. تظهر أطوال موجات الاستثارة والانبعاث لقنوات Trit sea و sci-fi افتراضيًا.

قم بتعيين اللون الأخضر الزائف لقناة Trit Sea واللون الأحمر لقناة SCI five. ضع الشريحة المراد فحصها على منصة المجهر وقم بالتركيز يدويًا تحت تكبير 100 مرة. اضبط قيمة HV على 10 والـ offset على صفر، ثم انقر على focus وقم بتعديل الجهد الكهربائي.

لتحسين أداء الليزرات، انقر فوق "focus scan" لمسح المقطع من الأعلى إلى الأسفل وتحديد مستوى Z الخاص بالحصول على الصورة. بعد ذلك، انقر فوق "CH series" والحصول على الصور بالتتابع. حدد خلايا T الموجبة لـ CD4 اليمنى أو الموجبة، والتي تظهر كخلايا نقطية صفراء بناءً على التوضع المشترك للإشارات الناتجة من كل من القناتين الحمراء والخضراء.

استخدم مجهر Olympus FV 500 BX 60 confocal للتعداد الكمي السهل لخلايا T الموجبة لـ CD4 أو dextro. للبدء، افتح برنامج flu ovu. اختر الأصباغ S SI three و SCI five من القائمة المنسدلة وانقر فوق apply لتحميل الليزرات المقابلة.

ضع الشريحة المراد فحصها على منصة المجهر وقم بضبط التركيز يدويًا تحت تكبير منخفض، ثم انقر على focus أثناء تشغيل ليزر SI three وقم بتركيز البؤرة الالتهابية. قم بتغيير العدسة الشيئية إلى تكبير 100 مرة. اضبط حجم الملف على five 12 over five 12 من القائمة المنسدلة، وانقر على focus وقم بتعديل قيم PMT gain و offset لتحسين الليزر بشكل منفصل لكل من S SI three و sci five، ثم انقر على Z stage وبعد ذلك انقر على focus أثناء تشغيل كلا الليزرين.

حدد سمك المنصة Z بالنقر على السهمين لأعلى ولأسفل. اضبط الفاصل الزمني Z على 2 µm. انقر على إيقاف ثم اختر.

قم بالبحث عن 1، 2، 3. ثم انقر فوق X، y، Z وابدأ في الحصول على صور سلسلة Z للمنطقة المحددة داخل البؤرة الالتهابية، واحفظ صور سلسلة Z كملفات VI. لحفظ ملفات الصور، اختر الصورة من سلسلة صور Z ثم احفظها بصيغة TIFF.

احفظ دائماً صور TIFF المتعددة. أولاً لحماية البيانات، وتتمثل الخطوة التالية في فحص ثلاثة مقاطع مزدوجة صبغت بكلتا المجموعتين من مقصات dex. أولاً، التقط الصور المتسلسلة لمحور Z عن طريق مسح الشرائح بحركة أفقية رأسية للأعلى ثم أفقية رأسية للأسفل لتجنب تكرار سلسلة Z ضمن نفس البؤرة.

بمجرد التقاط الصور المتسلسلة Z، قم بتسمية الملفات من خلال تحديد أرقام الشرائح وأسماء المقاطع وعدد الصور المتسلسلة Z التي تم التقاطها. استخدم برنامج Image J لحساب عدد الخلايا التائية CD4 الموجبة والـ dextro الموجبة بالنسبة للعدد الإجمالي للخلايا التائية CD4 الموجبة. اختر نوع العداد في برنامج Image J، وحدد خيار "إظهار الكل" (show all)، وابدأ العد بالنقر على مركز كل خلية، مع الاستمرار في العد عبر الصور المتسلسلة Z المختلفة باستخدام الأسهم الجانبية.

بعد عد جميع خلايا CD4 T، اختر نوعاً آخر من العدادات وقم بعد خلايا CD4 T الإيجابية للدكستران. انقر فوق علامة تبويب النتائج للحصول على العدد الإجمالي للخلايا التي تم عدها باستخدام العدادين المختلفين. تم إجراء الكشف عن خلايا CD4 T النوعية لبروتين الليبيد البروتيني للميالين أو PLP باستخدام مقاطع دماغية مقطوعة حديثاً مستمدة من فئران مصابة بـ EAE والمصبوغة بخليط يحتوي على anti CD4 وPLP 1 39 to 1 51 Dexters أو TMEV 70 to 86 Dexters الضابطة باستخدام LSCM.

يُظهر تحليل المقاطع الدماغية المصبوغة صبغاً مزدوجاً خلايا إيجابية لـ PLP 1 39 to 1 51 dex trimers باللون الأحمر، وخلايا إيجابية للأجسام المضادة CD four باللون الأخضر، بينما ظهرت الخلايا الإيجابية المزدوجة باللون الأصفر. أظهرت الخلايا المصبوغة صبغاً مزدوجاً نقاطاً نقطية حول المحيط. وكانت هذه السمة غائبة في المقطع المصبوغ بـ TMEV 70 to 86 الضابط.

تم أيضاً إجراء كشف عن خلايا T CD4 النوعية للميوسين القلبي باستخدام مجسات Dex trimmers عن طريق التلوين الموضعي (in situ staining) للميوسين القلبي ذو السلسلة الثقيلة alpha 3 34 to 3 52 Dexters. وأظهر تحليل هذه الصور بواسطة المجهر confocal (LSCM) وجود خلايا موجبة لـ MYHC 3 34 to 3 52 dexters باللون الأحمر، وخلايا موجبة لـ CD4 باللون الأخضر، وخلايا مرتبطة بكل من Dexter و CD4 في صورة خلايا منقطة باللون الأصفر. وكان التلوين الخلفي لـ RNAs 43 to 56 Dexters الضابطة ضئيلاً. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون 8 إلى 10 ساعات تقريباً، بدلاً من ثلاثة أيام كما في البروتوكولات الأخرى المنشورة، إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تحضير الكواشف مسبقاً واتباع الخطوات بشكل منهجي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية تقطيع وصبغ الأنسجة من أجل تعداد خلايا C-reactive CD four T في الأهداف المحددة.