عزل السريع وتنقية الميتوكوندريا لزرع الأنسجة بواسطة التفكك والتفضيلية الترشيح

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الميتوكوندريا النقية والتنفس بسرعة عن أنسجة الفئران. يتم تحقيق ذلك عن طريق ربط عينات الأنسجة وتجانسها أولا. الخطوات التالية هي خلط subin A في المتجانس وتحضنه على الجليد.

يتبع ذلك تصفية الخلط المتجانس في BSA وتصفيته مرة أخرى. تتمثل الخطوات النهائية في تدوير المرشح وإعادة تعليق كريات الميتوكوندريا في عازلة التنفس. في النهاية ، يمكن أن تظهر النتائج أن الميتوكوندريا المعزولة قابلة للحياة وأن التنفس مؤهل من خلال تحليل التنفس ومقايسة تلألؤ A TP.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية التي تبلغ عن أوقات عزل الميتوكوندريا التي تتراوح من 60 إلى مائة دقيقة ، هي أنه يمكن عزل الميتوكوندريا القابلة للحياة والتنفس في أقل من 30 دقيقة. ستعرض أليسون ماكاي ، فني من مختبر متعاون اختبار تلألؤ A TP قبل البدء مباشرة. قم بإذابة subin A في مليلتر واحد من المخزن المؤقت المتجانس وإذابة BSA أيضا في مليلتر واحد من المخزن المؤقت المتجانس.

ابدأ الآن بجمع عينتين من الأنسجة الطازجة باستخدام عينة خزعة بسعة ستة ملليمترات ، وقم بتخزينها في XPBS واحد على الجليد في أنبوب طرد مركزي سعة 50 لترا. عندما تصبح جاهزا ، انقل الأنسجة إلى أنبوب C للتفكك يحتوي على خمسة ملليلتر من محلول التجانس البارد المثلج. ثم قم بتجانس الأنسجة عن طريق تركيب الأنبوب على تفكك الأنسجة واختيار دورة عزل الميتوكوندريا المحددة مسبقا.

عند الانتهاء ، ضع الأنبوب مرة أخرى على الجليد وأضف 250 ميكرولترا من الفرع إلى محلول المخزون. امزج هذا عن طريق الانعكاس. عندما يبدو الخليط موزعا بشكل موحد ، احتضن المتجانس على الجليد لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، ضع مرشحا شبكيا 40 ميكرون على أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 مليلتر وقم بتعبئته في الجليد. بلل الفلتر بمخزن مؤقت متجانس وتخلص من المخزن المؤقت في حاوية نفايات. ثم بمجرد أن يصبح كل شيء جاهزا ، اسكب الجانس في المرشح.

أضف 250 ميكرولتر من محلول مخزون BSA واخلطه عن طريق الانعكاس. ومع ذلك ، يجب تخطي هذه الخطوة لتحليل بروتين الميتوكوندريا. الآن قم بإعداد اثنين آخرين.

أنابيب الطرد المركزي المخروطية سعة 50 مليلتر على الجليد تناسب أحدها بفلتر 40 ميكرون والآخر بفلتر 10 ميكرون. بلل كلا المرشحين بمخزن مؤقت متجانس قليلا وتخلص من هذا المخزن المؤقت. ثم صب المتجانس أولا من خلال مرشح 40 ميكرون ، ثم من خلال مرشح 10 ميكرون.

تعمل خطوات الترشيح هذه على تحسين نقاء الميتوكوندريا بشكل كبير. الآن قسم المرشح بين أنبوبين من أنابيب الصخور الدقيقة المبردة مسبقا سعة 1.5 مليلتر ، وقم بعملهما بالطرد المركزي عند 9،000 جي لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق ودمج حبيبات الميتوكوندريا المنقاة.

في مليلتر واحد من محلول التنفس المثلج ، من الضروري إجراء الإجراء بأكمله عند أربع درجات مئوية. يمكن الآن اختبار الميتوكوندريا المنقاة لتحديد النشاط الأيضي للميتوكوندريا المعزولة. يمكن إجراء اختبار تلألؤ A TP باستخدام مجموعة فحص A TP.

أولا ، أحضر كواشف المجموعة إلى درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول مخزون HT P وضعه على الجليد. الخطوة التالية هي إضافة خمسة ملليلتر من مخزن الركيزة إلى محلول الركيزة المجفف.

امزج هذا برفق وضعه في الظلام. ثم أضف 100 ميكرولتر من عازلة التنفس إلى كل بئر من صفيحة 96 بئر سوداء غير شفافة. أضف 10 ميكرولترات من الميتوكوندريا المحضرة إلى الآبار التي تقل عن معايير A TP.

يجب طلاء كل عينة فريدة من الميتوكوندريا في صفيحة ثلاثية النسخ ثلاثة آبار من عازلة التنفس وحدها كعنصر تحكم سلبي. استمر بإضافة 50 ميكرولترا من محلول تحلل خلايا الثدييات إلى كل بئر بمجرد تحميله. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق على شاكر مداري عند 120 دورة في الدقيقة.

أثناء الحضانة ، قم بإعداد تخفيفات لمعيار A TP تتراوح من 10 مليمولار إلى 10 ميكرومولار. بعد الحضانة ، أضف 10 ميكرولتر من كل من معايير A TP إلى الآبار المقابلة الموضحة في خريطة اللوحة. بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من محلول الركيزة المعاد تكوينه إلى كل منها.

حسنا ، ثم احتضن الطبق مرة أخرى ، كما كان من قبل لمدة خمس دقائق. تابع بفحص اللوحات في قارئ اللوحة. افتح البرنامج تحت.

إنشاء عنصر جديد. انقر فوق التجربة. ثم انقر فوق البروتوكول الافتراضي وانقر فوق موافق.

في العمود الأيمن، حدد البروتوكول. ثم الإجراء بعد ذلك ، حدد التأخير ، واضبطه على 10 دقائق. ثم حسنا ، الدخول.

الآن حدد واقرأ واختر اللمعان من القائمة المنسدلة. اضبط الإعدادات الأخرى على النحو التالي. قراءة نوع وقت تكامل نقطة النهاية.

ثانية واحدة. يحدد المرشح موضع بصريات ثقب انبعاث واحد ، وحساسية علوية 100 ، وإزاحة عمودية للمسبار العلوي ملليمتر واحد. بعد إجراء تغييرات الإعدادات هذه، انقر فوق موافق.

انقر فوق تخطيط اللوحة وقم بإعداده وفقا لذلك. انقر فوق موافق. الآن بعد تعيين كل شيء ، انقر فوق أيقونة لوحة القراءة في الصف العلوي وانقر فوق قراءة.

عندما يفتح مقياس الطيف الضوئي ، ضع اللوحة في الدرج مع البئر A في الزاوية اليسرى العليا. الآن سيتم فتح مربع يعرض درجة الحرارة ، انقر فوق موافق ، ثم تابع تحليل البيانات. أسفرت عينات العضلات الهيكلية التي تزن حوالي 0.18 جرام رطبة عن حوالي 24 مليار ميتوكوندريا بناء على حساب حجم الجسيمات.

أعطت عينات الكبد من نفس الحجم بضعة مليارات أخرى. تم التقليل من قراءات مقياس الخلوي الدموي للميتوكوندريا باستخدام عداد الجسيمات. تم الحصول على تتبع تمثيلي ، والذي يبين أن الميتوكوندريا المعزولة موضعية تحت ذروة واحدة بمتوسط قطر يبلغ حوالي أربعة أعشار ميكرون.

هذا يتفق مع التقارير السابقة التي تستخدم مقايسة الحمض ثنائي. تم قياس بروتين الميتوكوندريا ببضعة ملليغرام لكل جرام من الأنسجة من العضلات والهيكل العظمي والكبد. كان المنتج قابلا للتطبيق وكفاءة في التنفس.

الميتوكوندريا معزولة في إطار زمني متوافق مع التدخل العلاجي السريري والجراحي. أشارت الصور المجهرية الإلكترونية للإرسال إلى أن الميتوكوندريا المعزولة كانت كلها خدوش إلكترونية مع تلف أقل من واحد من كل 10،000 ، وكان التلوث أقل من واحد في مائة ألف اختبار TP. كشفت النتائج أن الميتوكوندريا كانت قابلة للحياة وأن محتوى TP كان حوالي 11 أو 15 نانومول لكل ملليغرام من بروتين الميتوكوندريا.

تم إجراء تحليل تنفس الميتوكوندريا باستخدام قطب كهربائي من نوع كلارك وكشف أن استهلاك الأكسجين كان حوالي 180 ميلا بايت من الأكسجين في الدقيقة. لكل مليغرام من بروتين الميتوكوندريا بينما كانت قيم RCI حوالي 2.5 مع درجة كبد أعلى قليلا بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في أقل من 30 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.