عزل السريع وتنقية الميتوكوندريا لزرع الأنسجة بواسطة التفكك والتفضيلية الترشيح

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل ميتوكوندريا نقية وذات كفاءة تنفسية بسرعة من أنسجة الجرذان. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تجميع عينات الأنسجة وتجنيسها. وتتمثل الخطوات التالية في خلط subin A مع المستخلص المتجانس وحضنه على الثلج.

يتبع ذلك ترشيح المتجانس بعد خلطه بـ BSA ثم ترشيحه مرة أخرى. وتتمثل الخطوات النهائية في تدوير الراشح باستخدام جهاز الطرد المركزي وإعادة تعليق كتل الميتوكوندريا في منظم التنفس. وفي النهاية، يمكن أن تُظهر النتائج أن الميتوكوندريا المعزولة حيوية وقادرة على التنفس من خلال تحليل التنفس ومقايسة وميض ATP.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، التي تتراوح أوقات عزل الميتوكوندريا فيها من 60 إلى مائة دقيقة، في إمكانية عزل ميتوكوندريا حيوية وقادرة على التنفس في أقل من 30 دقيقة. ستقوم أليسون ماكاي، وهي فنية من مختبر متعاون، بشرح مقايسة اللمعان لـ ATP مباشرة قبل البدء. أذب subin A في 1 mL من محلول التجانُس المنظم، وأذب BSA أيضاً في 1 mL من محلول التجانُس المنظم.

ابدأ الآن بجمع عينتين من الأنسجة الطازجة باستخدام أداة ثقب الخزعة بمقاس 6 mm، واحفظهما في محلول XPBS واحد على الثلج في أنبوب طرد مركزي سعة 50 mL. وعند الجاهزية، انقل النسيج إلى أنبوب تفكيك C يحتوي على 5 mL من محلول منظم التجانس البارد جداً. ثم قم بتجنيس النسيج عن طريق تركيب الأنبوب في جهاز تفكيك الأنسجة واختيار دورة عزل الميتوكوندريا المحددة مسبقاً.

عند الانتهاء، ضع الأنبوب مرة أخرى على الثلج وأضف 250 µL من محلول sub to lyin المخزون. اخلط المزيج عن طريق القلْب. وعندما يبدو المزيج متوزعاً بشكل متجانس، قم بحضن المتجانس على الثلج لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، ضع مرشحاً شبكياً بمسامية 40 micron على أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 milliliter وثبته في الثلج. قم بترطيب المرشح باستخدام محلول التجانُس المنظم (homogenizing buffer) وتخلص من المحلول في حاوية النفايات. وبمجرد تجهيز كل شيء، صب المادة المتجانسة عبر المرشح إلى أنبوب الرشاحة.

أضف 250 µL من محلول BSA المخزون واخلطه عن طريق القلب. ومع ذلك، يجب تخطي هذه الخطوة عند تحليل البروتين الميتوكوندري. الآن قم بتحضير عينتين إضافيتين.

ضع أنابيب طرد مركزي مخروطية سعة 50 milliliter على الثلج، وقم بتجهيز إحداها بمرشح 40 micron والأخرى بمرشح 10 micron. بلل كلا المرشحين بكمية قليلة من محلول التجانُس المنظم (homogenizing buffer) ثم تخلص من هذا المحلول. بعد ذلك، صب المادة المتجانسة أولاً عبر مرشح 40 micron، ثم عبر مرشح 10 micron.

تعمل خطوات الترشيح هذه على تحسين نقاء الميتوكوندريا بشكل كبير. الآن، قم بتقسيم الرشاحة بين أنبوبي طرد مركزي دقيق (micro fuge tubes) سعة 1.5 milliliter مبردين مسبقاً، ثم قم بطردهما مركزياً عند 9, 000 Gs لمدة 10 minutes عند درجة حرارة four degrees Celsius. بعد ذلك، قم بإزالة الطافي، ثم أعد تعليق ودمج ركيبتي الميتوكوندريا المنقيتين.

في ملليلتر واحد من محلول التنفس المنظم المبرد بالثلج، من الضروري إجراء العملية بأكملها عند درجة حرارة 4 °C. يمكن الآن اختبار الميتوكوندريا المنقاة لتحديد النشاط الأيضي للميتوكوندريا المعزولة. ويمكن إجراء مقايسة تألق ATP باستخدام طقم مقايسة ATP.

أولاً، اترك كواشف الطقم لتصل إلى درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بتحضير المحلول المخزني لـ HT P وضعه على الثلج. الخطوة التالية هي إضافة خمسة milliliters من محلول المنظم الخاص بالركيزة إلى محلول الركيزة المجفف بالتجميد.

امزج هذا المزيج بلطف وضعه في مكان مظلم. ثم أضف 100 µl من منظم التنفس إلى كل بئر في طبق يحتوي على 96 بئرًا ويكون أسود معتمًا. أضف 10 µl من الميتوكوندريا المُحضّرة إلى الآبار الموجودة أسفل معايير ATP.

يجب توزيع كل عينة ميتوكوندريا فريدة في ثلاث مكررات، مع ملء ثلاث آبار بمحلول منظم التنفس وحده كضابط سلبي. استمر بإضافة 50 µL من محلول تحلل الخلايا الثديية إلى كل بئر بمجرد تحميلها. حضن اللوحة عند 37 °C لمدة خمس دقائق على هزاز مداري بسرعة 120 RPM.

أثناء فترة التحضين، قم بتحضير تخفيفات من المعيار A TP تتراوح من 0.1 millimolar إلى 0.1 micromolar. وبعد انتهاء التحضين، أضف 10 µL من كل من معايير A TP إلى الآبار المقابلة الموضحة في مخطط اللوحة. بعد ذلك، أضف 50 µL من محلول الركيزة المعاد تكوينه إلى كل بئر.

بعد ذلك، قم بحضن الطبق مرة أخرى كما سبق لمدة خمس دقائق. ثم انتقل إلى فحص الأطباق باستخدام قارئ الأطباق. افتح البرنامج تحت.

قم بإنشاء عنصر جديد. انقر على تجربة. ثم انقر على البروتوكول الافتراضي وانقر موافق.

من العمود الأيسر، اختر protocol. ثم procedure. بعد ذلك، اختر delay، واضبطه على 10 minutes. ثم اضغط okay لتأكيد الإدخال.

الآن قم بتحديد وقراءة واختيار luminescence من القائمة المنسدلة. اضبط الإعدادات الأخرى على النحو التالي: نوع القراءة endpoint ووقت التكامل integration time.

ثانية واحدة. قم بتعيين مجموعة المرشحات على موضع بصريات ثقب انبعاث واحد، والحساسية القصوى 100، والإزاحة الرأسية للمسبار العلوي 1 mm. بعد إجراء هذه التغييرات في الإعدادات، انقر فوق موافق.

انقر فوق تخطيط الطبق وقم بإعداده وفقاً لذلك. انقر فوق موافق. الآن وبعد ضبط كل شيء، انقر فوق أيقونة قراءة الطبق في الصف العلوي ثم انقر فوق قراءة.

عندما يفتح جهاز المطياف الضوئي، ضع الطبق في الدرج بحيث تكون البئر A1 في الزاوية العلوية اليسرى. سيظهر الآن مربع يعرض درجة الحرارة، انقر موافق، ثم انتقل إلى تحليل البيانات. أنتجت عينات العضلات الهيكلية التي تزن حوالي 0.18 grams رطبة حوالي 24 مليار ميتوكوندريا بناءً على عد حجم الجسيمات.

أعطت عينات الكبد ذات الحجم نفسه بضعة مليارات إضافية. وقد تم تقدير قراءات عداد خلايا الميتوكوندريا بأقل من قيمتها الحقيقية عند استخدام عداد الجسيمات. تم الحصول على تتبع تمثيلي يوضح أن الميتوكوندريا المعزولة تتمركز تحت ذروة واحدة بمتوسط قطر يبلغ حوالي 0.4 micron.

يتوافق هذا مع التقارير السابقة التي استخدمت مقايسة حمض bi. تم قياس البروتين الميتوكوندري بمقدار بضعة مليجرامات لكل جرام من أنسجة العضلات الهيكلية والكبد. وكان المنتج قابلاً للحياة وذا كفاءة تنفسية.

تم عزل الميتوكوندريا في إطار زمني يتوافق مع التدخلات العلاجية السريرية والجراحية. وأشارت الصور المجهرية الإلكترونية النافذة إلى أن الميتوكوندريا المعزولة كانت جميعها كثيفة الإلكترونات مع وجود تلف في أقل من حالة واحدة من كل 10,000، وكان التلوث أقل من حالة واحدة من كل مائة ألف. وكشفت نتائج مقايسة ATP أن الميتوكوندريا كانت حيوية وأن محتوى ATP كان حوالي 11 أو 15 nanomoles لكل mg من بروتين الميتوكوندريا.

أُجري تحليل التنفس الميتوكوندري باستخدام قطب من نوع كلارك، وأظهر أن استهلاك الأكسجين كان حوالي 180 MLEs من الأكسجين في الدقيقة لكل ميليجرام من بروتين الميتوكوندريا، بينما بلغت قيم RCI حوالي 2.5 لكل منها مع درجة أعلى قليلاً للكبد. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في أقل من 30 دقيقة إذا نُفذت بشكل صحيح.