في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على مداخن ثلاثية الأبعاد عالية الدقة تحتوي على خلايا جذعية وسلف مكونة للدم ، ومراقبتها بمرور الوقت من خلال التصوير متعدد النقاط. يتم تحقيق ذلك عن طريق وضع العلامات أولا على الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية أو الخلايا الجذعية المكونة للدم أو الخلايا الجذعية الجذعية بصبغة محبة للدهون. ثم يتم حقن HSCs في الماوس المستلم.

يتم تحضير الفأر للفحص المجهري باستخدام غطاء رأس مخصص وحامل عينة لتحديد المواقع المستقرة للحيوانات. بعد ذلك ، يتم الحصول على أكوام عالية الدقة من منافذ الخلايا الجذعية السلفية المكونة للدم ويتم إجراء التصوير بفاصل زمني لمواقع نخاع العظام المتعددة التي تحتوي على أجهزة كمبيوتر HS في نهاية المطاف داخل البؤر الحيوي ويتم استخدام اثنين من المجهريات الفوتונית لإظهار توطين وحركة الخلايا الجذعية السرطانية في مساحة نخاع العظم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التألق المناعي على أقسام نخاع العظام هي أننا قادرون على التقاط المعلومات على مقياس رباعي الأبعاد ، ثلاثة أبعاد بالإضافة إلى الوقت.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج أمراض الدم لأنها تساعد في فهم المكان الذي نحتاج فيه إلى توجيه الخلايا الجذعية المكونة للدم داخل نخاع العظام لضمان أدائها الصحيح. خطرت لنا هذه الفكرة لأول مرة لهذه الطريقة عندما أدركنا مدى أهمية التمكن أولا من متابعة أجهزة الكمبيوتر HS بمرور الوقت. تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على أي أسئلة لدينا حول مجال الخلايا الجذعية حيث نريد أن نعرف أين توجد الخلايا الجذعية وكيف تتصرف بمرور الوقت.

لبدء حصاد الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية كما هو موضح في هذا المختبر في فيديو جغرافي سابق والمشار إليه في بروتوكول النص. بعد ذلك ، أضف صبغة DID المحبة للدهون إلى تعليق الخلية بتركيز نهائي يبلغ خمسة ميكرومولار. قم بتدوير التعليق على الفور للتأكد من أن الصبغة لا تترسب خارج المحلول وتفشل في تسمية الخلايا.

احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية لغسل الخلايا. قم أولا بالدوران عند 500 مرة جم لمدة خمس دقائق ثم صب السائل. ثم أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من PBS وتجميعها في حقنة الأنسولين.

يوصى باستخدام حقنة الأنسولين على حقنة تقليدية لأنها لا تحتوي على مساحة ميتة للإبرة. السماح بإعطاء تعليق الخلية بالكامل للفأر لحقن الخلايا في الفأر المميت عن طريق حقن وريد الذيل. ضع الماوس أولا في غرفة دافئة.

بمجرد ظهور وريد الذيل ، توسع الأوعية الدموية ، حرك الماوس إلى التقييد. حرك الإبرة بعناية في وريد الذيل. حقن الخلايا في الوريد.

لا ينبغي مواجهة مقاومة للحقن. اترك الماوس طوال الليل. من أجل السماح للخلايا بالهجرة إلى مساحات نخاع العظم ، قم بتخدير الفأر ومراقبة بداية التخدير العميق عبر منعكس البتلة.

امسح الجزء العلوي من فروة الرأس بنسبة 70٪ من الإيثانول على منديل. الحرص على عدم الحصول على أي إيثانول في عيون الفأر. لفضح منطقة الكالفاريوم المراد تصويرها ، قم بعمل شق صغير في مؤخرة الرأس بين الأذنين عن طريق رفع الجلد لأعلى بالملقط أثناء رفع الجلد لأعلى.

حرك المقص تحت الجلد واقصه برفق على طول الجزء الخارجي من منطقة التصوير المطلوبة. امسح العظم المكشوف بقطعة قطن معقمة مبللة ب PBS معقم للحفاظ على رطوبة العظام. هذا يتجنب الجفاف المفرط والتندب ، مما قد يؤثر على جودة التصوير.

بعد ذلك ، اخلطي كمية كافية من أسمنت الأسنان في قارب مصل اللبن حتى يصبح عجينة. قم بتطبيقه بسرعة على السطح السفلي لغطاء الأوتوكلاف الذي سيتم إرفاقه بالجمجمة. قبل أن يتماسك الأسمنت ، ضع غطاء الرأس على جمجمة الفأر ، مع التأكد من عدم وضع أي أسمنت أسنان على منطقة التصوير وانتظر حتى يتماسك.

ضع كمية صغيرة من الهيدروجيل الداخلي ، الذي يحافظ على رطوبة الجمجمة ، مع الحرص على عدم إزعاج الأسمنت أثناء جفافه. ثم قم بتوصيل غطاء الرأس بالحامل وثبته في مكانه. باستخدام المسمار لضمان ملاءمة الأخاديد داخل شقوق الحامل.

قم بإزالة الهيدروجيل باستخدام براعم قطنية معقمة قبل نقله إلى المجهر. بعد ذلك ، أدخل الحامل في مرحلة المجهر وضع حصيرة التسخين أسفل الماوس. أدخل مسبار مقياس حرارة المستقيم وقم بتأمين كل شيء في مكانه على المسرح بشريط لاصق.

ضع قطرة صغيرة من مرهم العيون على عيون الفأر للتأكد من عدم جفافها أثناء التخدير. يجب عدم ترك الفأر دون رقابة في أي وقت أثناء عملية التصوير أثناء التخدير. للتركيز على الجمجمة عبر قطع العين.

أولا ، املأ نافذة تصوير الكالفاريوم بالماء المعقم النقي باستخدام عدسة غمس الماء. قم بخفضه حتى يلامس قطرة الماء. ركز على الجزء العلوي من الجمجمة باستخدام قطع العين المجهرية.

ضع منطقة التصوير على الخيط المركزي وتحرك نحو الجزء الخلفي من الرأس للعثور على الخيط الإكليلي. كموضع بدء ، ضع البرنامج في وضع لالتقاط صور XY بالإضافة إلى مكدس ثلاثة DZ. اضبط سرعة التصوير على 400 هرتز والدقة على 512 × 512 بكسل.

قم بتعيين البرنامج بحيث يتم التقاط قنوات متعددة وتعيين طريقة التجميع لتغيير الإعدادات بين المكدسات أو بين الإطارات. قم بإعداد ثلاثة إعدادات التقاط مستقلة. إيقاف تشغيل إضاءة الليزر في نهاية الحصول على كل كومة.

ثم قم بإعداد أول مسح تسلسلي لإشارة عظم الجيل التوافقي الثاني للفوتون. افتح الغالق لليزر متعدد الفوتون وتأكد من إعداد كسب ليزر الفوتون المتعدد وإزاحة بشكل صحيح. تأكد أيضا من أن طاقة الليزر من 12.5 إلى 25٪ وأن الليزر قيد التشغيل.

حدد PMT مناسبا باعتباره الكاشف الوحيد وقم بتغيير اللون إلى اللون الأبيض. كرر إجراء إعداد القناة للتألق الذاتي المشترك واضطراب الشخصية الانفصامية في الإعداد الثاني. المسح الضوئي باستخدام اثنين من p mts المناسبين.

قم بتغيير لون القناة إلى الأخضر للتألق الذاتي والأحمر لاضطراب الشخصية الانفصالية. أخيرا ، قم بإعداد الفحص الثالث والأخير لاكتشاف GFP. اضبط قوة الليزر لخط الليزر 488 نانومتر على حوالي 15٪ حدد أنبوب مضاعف الصور المناسب أو PMT باعتباره الكاشف النشط الوحيد وقم بتغيير لونه الزائف إلى اللون الأخضر.

قم بتنشيط وضع التصوير المباشر لبدء فحص معاينة للقناة المحددة وضبط كسب الكاشف وإزاحة التعريض الضوئي الأمثل. كرر هذا لكل فحص في النافذة المتسلسلة واحفظ إعدادات عمليات الفحص متعددة القنوات هذه لإعادة الاستخدام بسهولة. ثم قم بتنشيط التقاط متعدد المواضع المشار إليه باسم علامة والعثور عليه في هذا البرنامج وإعادة تعيين نقاط الإحداثيات.

بعد ذلك ، قم بمسح منطقة تصوير العظام بدءا من التقاطع بين الخيط المركزي والإكليلية. امسح عمق منطقة نخاع العظم باستخدام كل من التألق الذاتي واضطراب الشخصية الانفصامية باستخدام عرض مركب. عند اكتشاف خلية ، ضع علامة على هذا كموضع إحداثي جديد بالنقر فوق رمز إضافة موضع جديد على الجانب الأيسر من العلامة والنافذة.

عند فحص مجال الرؤية الحالي ، حرك المرحلة مسافة مجال رؤية واحد. كرر هذه العملية لكل مجال من مجالات الرؤية. العمل تدريجيا حول نافذة التصوير بأكملها على يسار الخيط المركزي ، والتحرك نحو أنف الفأر.

بمجرد أن يصبح التشعب المركزي في الأفق ، انتقل إلى الجانب الأيمن من الخيط وكرر الإجراء. مسح الجانب الأيسر في الاتجاه العكسي. ضع علامة على إحداثيات أي خلايا جديدة ذات أهمية باستخدام أداة وضع العلامات والبحث.

لمراجعة النقاط، قم بتعيين الجزء العلوي والسفلي من مكدس Zs حول كل خلية لكل موضع. لكل نقطة، ركز لأعلى ولأسفل وقم بتعيين مواضع Z العلوية والسفلية لالتقاط ثلاثة مكدس DZ. قم بتحديث النقطة الفردية في العلامة والبحث ، واضبط الفاصل الزمني Zack على خمسة ميكرومترات ومتوسط كل قناة مسح متسلسلة إلى الجودة المناسبة.

احصل على مكدس مرجعي عالي الجودة لكل نقطة اهتمام عن طريق بدء إجراء الفحص بالكامل. بمجرد الانتهاء من المسح الضوئي عالي الجودة ، قم بتنشيط إعداد الفاصل الزمني لالتقاط الصور وإعدادات الفاصل الزمني. اضبط الفاصل الزمني على خمس دقائق ووقت التشغيل الكلي على الطول المطلوب.

قم بتطبيق هذه الإعدادات على الفحص الكلي. يوضح هذا المثال كيف يمكن إجراء الحصول على أكثر من ثلاث نقاط من خلال تعديل هذه الإعدادات، يمكن تقليل وقت المسح الضوئي للسماح بفاصل زمني لمدة خمس دقائق عن طريق تقليل عدد عمليات الفحص المستخدمة لمتوسط الحد من الدقة إلى 512 × 512 بكسل. يؤدي تحويل المسح الضوئي إلى ثنائي الاتجاه أو زيادة سرعة المسح الضوئي إلى 600 هرتز أو أكثر لبدء التصوير كما كان من قبل بالنقر فوق زر البدء والبرنامج الموضح.

بمجرد اكتمال التصوير، قم بإجراء القتل الرحيم بالماوس كما هو مفصل في بروتوكول النص. يسمح حامل الماوس عالي الدقة المصنوع خصيصا ، بما في ذلك نافذة تصوير الكالفاريوم ، بالتصوير المطول لأجهزة الكمبيوتر HS المسماة التي تم حقنها في الفئران المستقبلة المعرضة للإشعاع المميت الموضحة هنا هي شرائح ثنائية الأبعاد من أكوام ثلاثية الأبعاد ذات دقة خلية واحدة من HSPC تحتوي على مناطق نخاع العظام بسمك 90 إلى 120 ميكرومتر تقريبا من الكولاجين. يظهر العظام في الخلايا البيضاء المسماة DID باللون الأحمر.

تظهر الخلايا الفلورية الذاتية باللون الأصفر وتظهر الخلايا العظمية باللون الأخضر. يظهر هنا فيلم بفاصل زمني 40 لأجهزة الكمبيوتر HS التي تم تحديدها تظهر علامة HSC باللون الأحمر ، وتهاجر بالقرب من خلايا بانيات العظم باللون الأخضر بمجرد إتقانها. يجب أن تكون هذه التقنية قابلة للتنفيذ في غضون ساعة تقريبا للجراحة والتصوير الأولي متبوعا بالوقت المناسب للتصوير بفاصل زمني.

بمجرد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون واثقا تماما من قدرتك على إعداد تصوير عجل الماوس والنظر إلى أجهزة كمبيوتر HS متعددة بمرور الوقت.