مقاربة الرواية تسليخ مجهري ليتعافى السل المتفطرة نصوص محددة من الفورمالين الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين الرئة أورام حبيبية

وقد استخدمت على نطاق واسع تسليخ مجهري لفحص الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، والبروتينات داخل الأنسجة. القبض على الليزر المجهري (LCM) هو الأسلوب الأكثر شيوعا، ولكن تقنية الطحن الجديدة، mesodissection، وهو متاح في الآونة الأخيرة. ونحن لشرح استخراج الحمض النووي الريبي من mesodissected الفورمالين الثابتة البارافين جزءا لا يتجزأ من النسيج الشرائح حبيبية المتفطرة السلية.

الهدف العام من هذا الإجراء هو التقطيع الدقيق للأنسجة من شرائح البارافين الرسمية والثابتة. يتم تحقيق ذلك عن طريق إنشاء صورة مرجعية أولا من شريحة صبغة Hematin و Eoin التمثيلية. تتمثل الخطوة الثانية في وضع شريحة البارافين الرسمية والثابتة المقابلة غير الملوثة على مرحلة الأداة ومحاذاة منطقة التشريح المطلوبة مع الصورة المرجعية.

بعد ذلك ، يتم شرح منطقة التشريح ويتم تحميل بت ذكر قابل للاستهلاك بمخزن مؤقت وتحميله في الأداة. الخطوة الأخيرة هي تشريح الأنسجة المشروحة. في النهاية ، يتم استخدام مزيج من تضخيم استخراج الحمض النووي الريبي و R-T-P-C-R لإظهار كيف يمكن استخدام الأنسجة المقطوعة لتحليل التعبير الجيني العالمي لبكتيريا السل الفطرية داخل الأورام الحبيبية الرئوية من ريس ماكا المصابة.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث السل ، مثل هوية الجينات التي تعبر عنها المتفطرة السلية داخل منافذ شبيهة بالإنسان في الجسم الحي خلال حالات السل المصابة المختلفة. علاوة على ذلك ، ستساعد هذه البيانات في تفسير تنظيم مسببات الأمراض والاختلافات الأيضية والفسيولوجية داخل هذه الحالات المرضية المتميزة. وبالتالي توليد أهداف دوائية محددة.

تم تجهيز أداة تشريح الميزو بالمجهر الرقمي المدمج مع برنامجي تصوير الهوية وعصا التحكم للتحكم في مواضع مرحلة XY. قبل البدء في هذا الإجراء ، قم بمعايرة الجهاز باستخدام برنامج التصوير كما هو موضح في المخطوطة المصاحبة لإنشاء صورة مرجعية. ضع أولا الهيماتين و eoin ملطخا أو h و e على المسرح وضع غطاء معتما أعلى الشريحة.

ثم قم بقيادة الأداة عن طريق تحريك عصا التحكم إلى المنطقة المرغوبة من الشريحة h و d. احفظ الصورة التي تم إنشاؤها باستخدام علامة التبويب مرجع الالتقاط لمحاذاة الأنسجة المراد تشريحها. انقر فوق خيار تشريح الأنسجة على الشاشة الرئيسية.

في علامة تبويب الإعداد ، املأ رقم انضمام تشريح المشغل ، ورقم الانضمام المرجعي exci أو سائل تشريح رقم الباركود ، وحجم الدفعة والوصف. انقر فوق علامة التبويب البحث عن المناديل. استيراد الصورة المرجعية المحفوظة مسبقا.

ضع البارافين الرسمي والثابت غير الملوثة أو FFPE. حرك سمك خمسة ميكرون على المسرح. انقل المرحلة إلى نفس المنطقة الموضحة في الصورة المرجعية.

انقر فوق علامة التبويب محاذاة. استخدم الماوس والأسهم المرتبطة به لمحاذاة الصورة المرجعية مع الصورة غير الملطخة. أخيرا ، قم بالتعليق على الشريحة بالنقر فوق علامة التبويب التعليق التوضيحي.

استخدم الماوس لرسم دائرة حول المنطقة المطلوبة من الشريحة التي سيتم تشريحها بشكل دقيق. ابدأ هذا الإجراء بملء بت البريد القابل للاستهلاك بالمخزن المؤقت المطلوب في هذا المثال PKD Buffer عن طريق سحب المكبس لأعلى ولأسفل في حركة سلسة عدة مرات. تأكد من استبعاد فقاعات الهواء.

ارفع المحور Z بالضغط على زر المحور Z. قم بتحميل لقمة البريد المستهلكة في الأداة. حرك لقمة الذكر المستهلكة في الجزء العلوي من الماكينة بحيث يصطف الخط الأبيض على الأداة مع الخط الأسود على الجزء الذكر القابل للاستهلاك.

اضغط على زر إعادة ضبط الشفط للسماح بإنزال المكبس إلى الموضع الصحيح. اخفض المحور Z بالضغط على زر المحور Z مرة أخرى لبدء تشريح الأنسجة أولا ، وافتح علامة تبويب التشريح. بعد ذلك ، قم بتحويل المحرك وسرعات الشفط إلى واحدة.

ضع علامة في مربع تتبع العرض. يسمح ذلك للمستخدم بتصور المنطقة التي تم تشريحها أثناء عملية التشريح للتشريح. اضغط مع الاستمرار على زر التعشيق بالإضافة إلى زر الشفط أثناء تحريك عصا التحكم في عكس اتجاه عقارب الساعة.

استمر في التشريح في عكس اتجاه عقارب الساعة حتى تمتلئ الشفط وتتحول علامة التبويب إلى اللون الأحمر. لجمع العينة التي تم تشريحها أولا ، اضغط على زر المحور Z لرفع المحور ، ثم ضع أنبوب fuge صغير سعة 0.5 ميكرولتر تحت طرف البت الذكري القابل للاستهلاك ، واضغط على قضيب التحكم في الشفط بسرعة لإخراج العينة إلى أنبوب الطرد الصغير. سيتم الآن احتواء جزء الأنسجة داخل أنبوب fuge الصغير.

اضغط على قضيب التحكم في الشفط بقوة متزايدة لإخراج البت الاستهلاكي المستخدم. تم استخدام البروتوكول الموضح في هذا الفيديو لفحص الأورام الحبيبية الرئوية من Resus Maca المصابة بالمتفطرة السلية أو MTB في مراحل عدوى مختلفة. تظهر الصورة المرجعية ورم حبيبي ملطخ h و D من الماكا العصبية النشطة مع منطقة الاهتمام المراد تشريحها الموضحة باللون الأخضر.

تظهر الصورة الوسطى شريحة FFPE غير الملوثة المقابلة بسماكة خمسة ميكرون قبل التشريح. تمت محاذاة المناطق باستخدام البرنامج ، وتم تحديد مجال الاهتمام المرتبط باللون الأخضر. تصور الصورة الموجودة على اليمين نفس تشريح منشور الشريحة FFPE غير الملوثة مع تشريح المنطقة الممثلة باللون الأزرق.

تم استخراج الحمض النووي الريبي لاحقا من الأورام الحبيبية الميزية التشريح في كل حالة معدية ، ويوضح هذا الجدول النتائج. تم الحصول على تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام NanoDrop. ثم تم تضخيم الحمض النووي الريبي وتنقيته ونسخه العكسي إلى CD N-A-R-T-P-C-R فيما يتعلق بالوحدة الفرعية الريبوسومية 16 ثانية تؤكد وجود الوحدة الفرعية الريبوزومية MTB 16 ثانية وبالتالي MTB.

في عينات الحمض النووي الجيني الدقيقة من سلالة CDC 1551 ، تم استخدام MTB كمعيار باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل D-N-A-R-N-A واستخراج البروتين من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول علم الجينوم والنسخ والبروتينات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التقطيع الدقيق لعينات FFPE من الأورام الحبيبية الرئوية.

لا يقتصر هذا الإجراء فقط على الورم الحبيبي الرئوي المصابة ب MTB ، ولكن يمكن تطبيقه على الآفات من مسببات الأمراض الأخرى أيضا.