العناصر الفنية الأساسية من تجميد كسر / تجميد حفر في البيولوجية المجهر الإلكتروني

يهدف التجربة التالية إلى إنشاء نسخة طبق الأصل من الكربون والبلاتين لعينة من مواد بيولوجية أو مواد أخرى لفحصها بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ. ولتحقيق ذلك، يتم إخضاع العينات التي تم تحضيرها كنسخ طبق الأصل مزدوجة أو مفردة لمعدلات تجميد فائقة السرعة للحد من تكوين بلورات الجليد. بعد ذلك، يتم كسر العينة المجمدة بواسطة تحكم عن بعد في درجات حرارة النيتروجين السائل تحت فراغ عالٍ، مما يؤدي إلى شطر الغشاء عبر الطبقة الدهنية المزدوجة، مما ينتج وجهاً خارج الخلية ووجهاً قريباً من الجانب السيتوبلازمي.

كخطوة إضافية اختيارية، يمكن الكشف عن الميزات الأساسية عن طريق نقش الماء من سطح العينة المكسورة من خلال وضع ذراع الميكروتوم المبرد فوق منصة العينة لإحداث فرق في درجات الحرارة، مما يؤدي إلى تسامي الماء من السطح. بعد ذلك، يتم إنشاء نسخة طبق الأصل عن طريق تبخير الكربون والبلاتين فوق السطح المكسور.

يتم هضم العينة الأصلية من النسخة المماثلة، والتي يتم استعادتها على شبكة عينات المجهر الإلكتروني النافذ. وفي النهاية، تُستخدم تقنية الكسر بالتجميد والحت بالتجميد لإظهار التفاصيل الهيكلية ثلاثية الأبعاد للأغشية الخلوية، والمصفوفات الجزيئية، والمواد النانوية عند الفحص بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل فحص المقاطع فائقة الرقة، في إمكانية عرض الأجسام محل الدراسة في ثلاثة أبعاد بدقة المجهر الإلكتروني.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجالات بيولوجيا الخلية والبيولوجيا الجزيئية وتكنولوجيا النانو، مثل الخصائص البعدية والهيكلية للأغشية الخلوية وتنظيم المصفوفات الجزيئية ومواد النانو. لقد خطرت لي فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أدركت أن دراسات مماثلة قد أُجريت على الطلائعيات حقيقية النواة وأسفرت عن اكتشافات مهمة، ولكن لم يتم إيلاء اهتمام كافٍ للموضوعات ذات الصلة بالصحة البشرية. ابدأ هذا الإجراء بتحضير العينات البيولوجية لتقنية الكسر بالتجميد والنسخ بالتجميد (freeze fracture freeze edge)، كما هو موضح في البروتوكول النصي.

اختر قواعد عينات ذهبية أو نحاسية ذات حجم وشكل مناسبين للعينة الجاري معالجتها باستخدام ملاقط دقيقة و/أو إبر حقن ذات قياس صغير. ضع قطعًا صغيرة من العينة على الجزء العلوي من قاعدة العينة المعدنية. قلل المحتوى السائل للعينة لتصبح ذات قوام لزج يشبه الغراء قليلاً عن طريق سحب السائل من حافة القاعدة باستخدام ورق ترشيح بالنسبة للنسخ المتماثلة المفردة.

استخدم إبر سرنجات ذات عيار صغير لإنشاء كومة من النسيج على القاعدة في حالة النسخ المزدوجة. اقلب قاعدة أخرى، وضعها بدقة فوق القاعدة الأولى، ثم ضعها بخفة على سطح العينة، بحيث يتم إنشاء ما يشبه الشطيرة.

لا تضغط على العينة لإخراجها من بين الدعامتين. بعد ذلك، املأ وعاءين ثنائيين معزولين بالنيتروجين السائل. يستوعب الوعاء الأول عموداً معدنياً يحتوي على بئر صغيرة، والتي تُستخدم لإسالة حجم صغير من غاز البروبان من أسطوانة متوفرة تجارياً.

الوعاء الثاني هو وعاء تخزين مقسم للحفاظ على العينات المجمدة لفترة وجيزة تحت النيتروجين السائل. استخدم البروبان فقط داخل غطاء كيميائي معتمد لهذا الغرض. احرص على تجنب مصادر الاشتعال الخارجية، واستخدم ملابس واقية من درجات الحرارة المنخفضة، وحافظ على تهوية كافية لأن البروبان مادة متفجرة.

قد يسبب إصابة بالتجميد عند الملامسة وهو مادة مسببة للاختناق. باستخدام فوهة الأسطوانة الموضوعة في البروبان، افتح صمام الأسطوانة جيداً واسمح للغاز بالتدفق إلى بئر الوعاء الأول حيث سيتسيل في أسرع وقت ممكن. التقط حامل العينة باستخدام ملقط دقيق واغمره في الغاز المسال في الوعاء الأول لعدة ثوانٍ.

ثم انقلها بسرعة إلى وعاء الاحتفاظ الثاني الذي يحتوي على النيتروجين السائل. وبمجرد تجميد العينات، تُخزن تحت النيتروجين السائل حتى تصبح جاهزة للنقل إلى وحدة الكسر بالتجميد. قم بتحميل قواعد العينات الذهبية في حامل عينات من النوع الكتيب ذي النسخ المزدوجة أو في جهاز تثبيت تحت النيتروجين السائل، وحافظ عليها هناك حتى يحين وقت وضعها في غرفة العينات.

عندما تصل الحجرة إلى فراغ عالٍ ويتم تبريد المنصة إلى درجة حرارة النيتروجين السائل، أوقف تشغيل المضخة، وقم بتنفيس الحجرة، وضع قواعد العينات المثبتة على طاولة العينات بأسرع ما يمكن. بعد ذلك، قم بتشغيل المضخة لإعادة إنشاء الفراغ العالي، واستخدم ضوابط درجة حرارة المنصة والذراع الإلكترونية لضبط درجة حرارة طاولة العينات إلى 100- °C. قم أيضاً بتوجيه النيتروجين السائل إلى ذراع الميكروتوم لتبريدها إلى درجة حرارة النيتروجين السائل.

عند تحقيق فراغ عالٍ، ووصول درجة حرارة المنصة إلى 100- درجة Celsius وذراع الميكروتوم إلى درجة حرارة النيتروجين السائل، يتم فتح حامل العينات المزدوج عن بُعد، مما يؤدي إلى كسر العينات المثبتة على قواعد العينات. كخطوة إضافية اختيارية، يمكن إجراء عملية نقش للعينات للكشف عن السمات الكامنة بعد الكسر. ولتحقيق ذلك، استخدم شفرة حلاقة مثبتة في مشبك على ذراع الميكروتوم لكشط سطح العينات. ضع ذراع الميكروتوم المبردة فوق الأسطح المكسورة لمدة تتراوح من دقيقة واحدة إلى عدة دقائق لتسامي الماء من أجل الكشف عن أسطح الخلايا الحقيقية، والمطرس خارج الخلوي، و/أو التجمعات الجزيئية.

بعد ذلك، قم بتنشيط مدفع البلاتين والكربون الإلكتروني أو مدفع المقاومة، واتركه يبخر طبقة رقيقة من البلاتين والكربون فوق السطح المكسور بزاوية تتراوح من 30 درجة إلى 45 درجة. يتطلب هذا عادةً ما يقرب من 15 إلى 20 ثانية، ثم قم بتنشيط مدفع الكربون الإلكتروني أو مدفع المقاومة بالطريقة نفسها، وبخّر طبقة رقيقة من الكربون على سطح العينة المكسورة من الأعلى مباشرة بزاوية 90 درجة لتوفير الدعم للنسخة المطابقة. يتطلب هذا أيضاً عادةً ما يقرب من 15 إلى 20 ثانية عند الانتهاء من عملية النسخ والتظليل وتثبيت الكربون.

أوقف تشغيل مضخة التفريغ والغرفة، ثم أخرج حامل العينة من الجهاز. باستخدام ملقط دقيق، أخرج كل قاعدة عينة ذهبية من مشبك كتيب النسخ المزدوج واتركها لتذوب لبضع ثوانٍ قبل خفض القاعدة برفق على سطح الماء في لوحة تنقيط. قم بتحريك النسخ باستخدام إما حلقة سلكية دقيقة أو شبكة مجهر إلكتروني نحاسية تقليدية تُمسك بملقط دقيق، وانقلها إلى لوحة تنقيط أخرى تحتوي على 5% sodium dichromate في 50% sulfuric acid لمدة تتراوح من ساعة واحدة إلى عدة ساعات. يعمل هذا الحمام على هضم مادة العينة البيولوجية الفعلية من النسخة.

عند اكتمال عملية الهضم، انقل النسخة المطابقة (replica) مرة أخرى إلى سطح مياه نظيفة، ثم استخرجها وضعها على شبكة مجهر إلكتروني نحاسية قياسية. تُخزن الشبكات الداعمة للنسخ المطابقة في صناديق شبكات متوفرة تجارياً، حيث تظل مستقرة لسنوات. ومع المناولة اللطيفة أو الفحص البنيوي الدقيق للكسر بالتجميد أو النسخ المحفورة، يتم فحص النسخ المطابقة باستخدام مجهر إلكتروني نافذ عند جهد تسريع يتراوح عادةً من 50 إلى 80 kilovolts.

سجل الصور ذات الصلة على فيلم TEM قياسي أو باستخدام كاميرا رقمية عالية الدقة موجودة في الغشاء الخلوي عند قاعدة كل خلية حقيقية النواة. يعتبر الهدب والسوط مصفوفة من الجسيمات المرتبطة بالغشاء والمنظمة في خيوط ENC تحيط بعمود الهدب وتعرف باسم القلادة الهدبية. تظهر مصفوفات جسيمات غشائية متخصصة على الحدود اللمعية للخلايا الظهارية التي تمر بعملية Clio Genesis.

تمثل هذه المصفوفات الجسيمية القلائد الهدبية الناشئة، والتي تقع عند قاعدة الأهداب الناشئة والناضجة. وتكشف دراسات التكسير بالتجميد في أنسجة ظهارية متنوعة عن تنظيم معقد من هياكل الخيوط والأثلام المتشابكة التي تحيط بالجانب القمي للحدود القاعدية الجانبية. ويكشف التكسير عبر أغشية الخلايا الظهارية عن أوجه تكسير بلازمية للوصلات المحكمة تظهر على شكل خيوط، بينما تظهر أوجه التكسير خارج الخلوية أثلاماً مكملة لها.

تظهر الموصلات الفجوية (Gap junctions) في تحضيرات الكسر بالتجميد لمجموعة متنوعة من الأنسجة، وتتمثل في مصفوفات كثيفة من الجسيمات على أوجه كسر الغشاء البلازمي، وتقابلها فجوات متممة على وجه الكسر خارج الخلوي. تظهر الأوجه هنا كمثال على التجميد السريع مع النقش العميق والتظليل الدوار. لقد تم كسر الخلية الظهارية عبر السيتوبلازم، ويظهر وجه كسر الغشاء البلازمي بوضوح خلف رؤوس السهام.

يتم الكشف عن سطح الخلية الحقيقي من خلال عملية النقش اللاحقة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في دورة تستغرق ثلاث ساعات تقريباً، وتنتج من واحدة إلى ثلاث عينات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر أن الخطوات الفردية مترابطة للغاية، وأن أي خطأ في خطوة واحدة قد يجعل النتيجة غير مناسبة للفحص والتقييم بعد عملية التحميض.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلية والبيولوجيا الجزيئية لاستكشاف كيف تؤدي الطفرات الجينية إلى حدوث تشوهات هيكلية في الخلايا، بطرق تحفز ظهور الحالات المرضية والأمراض.