تطوير جهاز 3D الجرافين الكهربائي Dielectrophoretic

يوضح هذا البروتوكول إجراءات تصنيع ورق غرافين رقائقي ثلاثي الأبعاد، وجهاز قطب كهربائي دقيق، والطرق التجريبية للتحكم في الخرزات البوليمرية النجمية أو الخلايا البيولوجية عن طريق الرحلان الكهربائي العازل أو DEP داخل الجهاز. ومن هذه النقطة فصاعداً، سنشير إلى الرحلان الكهربائي العازل باسم DEP. يتم تصنيع الأجهزة عن طريق تكديس طبقات متبادلة أولاً من ورق غرافين بسمك 50 micron وN ناقص طبقة واحدة من شريط بوليمر حساس للضغط بسمك 100 micron، مما ينتج عنه نصف أقطاب إشارة ونصف أقطاب أرضية.

تُضغط الطبقات معاً، ثم تُقص، وبعد ذلك يتم حفر البئر الدقيق عبر الهيكل. وأخيراً، يتم توصيل سلكين نحاسيين بطرفي الجهاز باستخدام إيبوكسي الفضة. تتمثل الخطوة الثانية في تحضير وسط DEP بالموصلية المطلوبة.

بعد ذلك، يتم تعليق خرزات Poly starring في هذا المحلول الوسطي بنسبة حجمية محددة. وتتمثل الخطوة الثالثة والأخيرة في تحميل الجهاز بتعليق الخرزات المُحضّر، وتثبيته على منصة المجهر، وتوصيل الجهاز بمولد دالات، ومن ثم بدء عملية DEP. وفي النهاية، يُستخدم المجهر لتسجيل استجابات DEP ودراسة خصائص الخلايا أو الجسيمات من خلال المزيد من التحليل.

يُعد الغرافين مادة متعددة الاستخدامات تُوظف لقوتها بالإضافة إلى خصائصها الحرارية والكهربائية. يستخدم هذا البروتوكول ورق غرافين منخفض التكلفة كطبقة قطب كهربائي موصلة في جهاز ميكروي ثلاثي الأبعاد يعمل بتقنية الرحلان الكهربائي العازل، وهو قادر على تمييز الجسيمات والخلايا لتطبيقات مثل تحديد فصائل الدم أو التشخيص الطبي للخلايا المرضية. وتشمل مزايا هذا الجهاز الميكروي ذو القطب الكهربائي المصنوع من ورق الغرافين سهولة التصنيع، وزيادة الإنتاجية العلاجية للعينة، والمرونة الهندسية.

يمكن لمجال الانتخاب ثلاثي الأبعاد غير المنتظم التحكم في أحجام عينات كبيرة باستخدام قوى استقطاب (DP) فريدة في قدرتها على تمييز الجسيمات والخلايا القابلة للاستقطاب بناءً على خصائصها الكيميائية والمورفولوجية الجوهرية. قم بتجميع الجهاز الرقائقي باستخدام ورق الغرافين والشريط اللاصق. نستخدم هنا ورق غرافين كاره للماء بسمك 75 micron من شركة تجارية، وشريطاً لاصقاً مزدوج الوجه حساساً للضغط بسمك 100 micron.

أولاً، يتم قص ورق الجرافين باستخدام شفرة جراحية ومسطرة ذات حافة مستقيمة إلى مستطيلات بأبعاد 6.7 centimeters في 1.5 centimeter، واستخدام مقص لقص شريط لاصق حساس للضغط مزدوج الوجه إلى خمس شرائح بأبعاد 1.3 centimeters في خمس centimeter تقريباً. ضع الطبقة الأولى من ورق الجرافين على شريحة زجاجية نظيفة. غطِّ أحد طرفي ورق الجرافين ببطء باستخدام شريحة واحدة من الشريط اللاصق، مع ترك هامش قدره two millimeter تقريباً لضمان العزل بين أي طبقتين متجاورتين من ورق الجرافين.

ضع الطبقة الثانية من ورق الغرافين فوق الشريط اللاصق. قم بإزاحتها بالنسبة للطبقة الأولى من ورق الغرافين. طبق ضغطاً متوسطاً في الأعلى لضمان إحكام الختم بين الطبقات.

كرر الخطوتين السابقتين للطبقات المتبقية، مع التأكد من أن الطبقتين العليا والسفلى من ورق الجرافين. استخدم مقصاً لإزالة الشريط الزائد من حواف الجهاز مع ترك هامش صغير يبلغ حوالي واحد مليمتر لضمان العزل المحكم بين طبقات ورق الجرافين. أجرِ اختبار عزل سريع باستخدام المقياس المتعدد (multimeter) عن طريق وضع المسبارين الموجب والسالب على التوصيلات الكهربائية في جانبين متقابلين من الجهاز.

تشير المقاومة العالية التي تبلغ تقريباً مئات الكيلو أوم إلى وجود عزل جيد بين الطبقات. الآن أصبح الهيكل المصفح جاهزاً لحفر البئر الدقيقة. نستخدم مثقاباً دقيقاً لحفر بئر دقيقة في الهيكل المصفح.

نستخدم هنا مثقاباً دقيقاً (micro drill) بقطر 700 micron وطول شق يقارب 2.1 millimeter. وقد تم اختيار المثقاب الدقيق بناءً على قطر البئر الدقيقة وسُمك الجهاز. يتم تثبيت الهيكل المصفح على منصة الحفر الدقيق باستخدام مشابك، ثم يتم وضع رأس المثقاب بدقة فوق الهيكل باستخدام عناصر التحكم المحوسبة، مع توجيه هواء مضغوط فوق الجهاز. يبدأ تدوير رأس المثقاب ثم يتم خفضه ببطء داخل وعبر مركز الهيكل المصفح.

توقف عند مسافة أكبر قليلاً من عمق الهيكل الرقائقي لضمان الإزالة الكاملة للحطام من الثقب الجديد. حرك لقمة التفريز (end mill) لأعلى ولأسفل عدة مرات عبر البئر الدقيقة لتنعيم الجدار الداخلي.

يجب أن يكون السطح الداخلي للبئر الدقيق عموديًا ونظيفًا قدر الإمكان. ولتحقيق تدرجات مثالية للمجال الكهربائي ونفاذ الضوء عبر البئر الدقيق، قم بقص أسلاك نحاسية قياسية عيار 32 إلى قطعتين بطول 3 cm، ثم قم بثنيهما بزاويتين قائمتين عند مسافة 2 cm. امزج يدويًا ما يقرب من 0.75 mm من الجزء A وما يقرب من 0.75 mm من الجزء B من الإيبوكسي الفضي الموصل.

في حاوية صغيرة، قم بتوصيل الأسلاك عن طريق وضع إيبوكسي الفضة بعناية على أطراف وبين طبقات ورق الجرافين الثلاث جميعها لضمان تلامس جيد بين الطبقات. بعد ذلك، ضع السلك الذي يبلغ طوله واحد سنتيمتر بين أي طبقتين، واضغط على الطبقات برفق لإزالة الإيبوكسي الزائد وضمان التلامس الكهربائي الجيد. كرر العملية للجانب الآخر من الهيكل المصفح.

ضع الجهاز بالكامل على رف وفي فرن للتجفيف طوال الليل عند 70 درجة Celsius وتحت ضغط جوي واحد. أخرج الجهاز من الفرن وتحقق من العزل الكهربائي بين وصلات القطب الكهربائي. نقوم هنا بتحضير وسائط محاليل ذات نطاق من الموصلية عن طريق خلط نسب مختلفة من محلول minol جاهز بتركيز 290 milli osmolar per liter وPBS.

هذه محاليل بسيطة تم اختيارها لمحاكاة منظمات المزارع الخلوية بشكل تقريبي. يوجد ارتباط خطي بين نسبة حجم هذين المحلولين وموصلية المحلول الناتج؛ لذا يتم خلط حبيبات polystar أو الخلايا البيولوجية مع أوساط الموصلية المُحضرة بنسبة حجمية تبلغ 1 إلى 100، وذلك عن طريق سحب 10 µL من حبيبات polystar و1 mL من محلول الوسط إلى أنبوب عينة.

امزج العينة جيداً باستخدام جهاز Vortex. ثبّت الجهاز على شريحة زجاجية بضغط متوسط باستخدام مشابك ورقية معدلة أو ما يعادلها. يجب أن تكون القاعدة قريبة بما يكفي من البئر الدقيق لإحكام غلق الهيكل الرقائقي على الشريحة الزجاجية لمنع أي تسرب للعينة.

يجب التحكم في إحكام الربط بالمشبك لتجنب تشويه الجهاز، مما قد يؤثر سلبًا على هندسة البئر ومسار الضوء. استخدم شريحة زجاجية مغطاة بسمك 0.5 millimeter مع قاطع زجاج ذي رأس ماسي واسع بما يكفي لتغطية البئر المجهرية فقط، ثم قم بقص الغطاء الزجاجي وفقًا للحجم المطلوب واتركه جانبًا. باستخدام هذه المحقنة المجهرية، احقن ببطء حوالي 1 microliter من معلق خرزات البوليسترين داخل البئر المجهرية. ولتجنب إدخال أي فقاعات، كرر عملية الحقن في حال ظهور فقاعات، مع الحرص على عدم إتلاف جدران البئر المجهرية باستخدام الإبرة الحادة. قم بملء البئر المجهرية بشكل زائد قليلاً، ثم قم على الفور بتمرير الغطاء الزجاجي المُجهز فوق البئر المجهرية لإزالة السوائل الزائدة ومنع التبخر وضمان أحجام قابلة للتكرار.

لكل تجربة، ثبّت الجهاز الميكروي المصفح الكامل على منصة المجهر وقم بتوصيل مولد دالات. استخدم مشابك التمساح لتوصيل الأجهزة بالأسلاك النحاسية، ثم استخدم برنامج المجهر لضبط التركيز لرؤية البئر الميكروي بوضوح. في منتصف الشاشة هنا، من 100 هرتز إلى 10 ميجاهرتز و15 فولت.

تم تطبيق إشارات قمة التوب (Peak tope) على الجهاز. لوحظ وجود الخرزات في البئر الدقيق بتكبير 10x على ارتفاع يتراوح من 1 إلى 200 ميكرون فوق سطح الشريحة الزجاجية. انقر على الزر لبدء تسجيل الكاميرا والالتقاط.

قم بتشغيل إشارة مولد الدوال بعد ثانيتين من بدء تسجيل الكاميرا. تُحفظ الصور رقمياً بمعدل يتراوح من إطار واحد إلى خمسة إطارات في الثانية لمدة خمس دقائق تقريباً لتحليل الكثافة لاحقاً. عند اكتمال التجربة، قم بإزالة الجهاز وفك المشابك.

نظف كلًا من الشريحة الزجاجية والجهاز باستخدام الماء والصابون، ثم اشطفهما جيدًا. في غياب المجال الكهربائي، تترسب الجسيمات فقط في قاع الجهاز بفعل الجاذبية. أما عند تطبيق مجالات كهربائية بتردد حوالي واحد كيلوهرتز، فيظهر سلوك DEP إيجابي يتمثل في تحرك الجسيمات صعودًا مع تدرج المجال لتصبح أقرب إلى ورق الجرافين.

يُلاحظ وجود الأقطاب الكهربائية عند حواف الآبار الدقيقة في مجالات كهربائية تتجاوز 100 kilohertz وصولاً إلى نطاق megahertz. كما لوحظ حدوث DEP سلبي، والذي تم الاستدلال عليه من خلال حركة الخرزات لأسفل تدرج المجال الكهربائي باتجاه مركز البئر الدقيقة. وقد حقق هذا الجهاز الدقيق ذو القطب الكهربائي المصنوع من ورق الجرافين ثلاثي الأبعاد نتائج تجريبية تتوافق بشكل وثيق مع كل من السلوك التنبؤي النظري والنتائج التجريبية المسجلة سابقاً.

تتميز عملية تصنيع الأجهزة بمرونة عالية للغاية، حيث يمكن تكييف البروتوكولات المقدمة بسهولة لتناسب أجهزة تحتوي على طبقات أكثر أو مواد أخرى. يفصل هذا الفيديو طريقة تصنيع جهاز DEP ثلاثي الأبعاد بنظام الدفعات.

ومع ذلك، في التطبيقات المستقبلية، يمكن تدفق معلقات الجسيمات أو الخلايا باستمرار عبر البئر الدقيق للجهاز لتحقيق إنتاجية أعلى. ومن أمثلة تعدد استخدامات فرز DEP أن ورق الغرافين الممتص للماء يمكن أن يعمل في آن واحد كقطب كهربائي ومرشح لمركزات الجسيمات أو الخلايا، أو حتى كحساسات كيميائية حيوية كهروميكانيكية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لدى المشاهدين فهم جيد لكيفية تصنيع جهاز دقيق بقطب كهربائي من ورق الغرافين متعدد الطبقات، بالإضافة إلى كيفية تشغيل الجهاز لإجراء تجارب الجسيمات أو الخلايا.