Name: بروتوكول لتصيب انواع معينة ايليجانس مع السالمونيلا التيفية الفأرية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: تعلم بروتوكول إصابة C. elegans بـ Salmonella typhimurium لدراسة تفاعلات المضيف والممرض باستخدام تداخل الحمض النووي الريبوزي. تساعد هذه الطريقة الباحثين على تحديد الجينات الأساسية للحماية ضد العدوى.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر الدكتورة ديان Baronas-ويل لقراءة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل وحدة التحليل المالي تشارلز إي شميت كلية العلوم غرانت البذور ومنحة الشيخوخة من مؤسسة إليسون الطبية لKJ

1. لوحات XLD (الزيلوز يسين Desoxycholate) آجار XLD أجار هو وسيلة النمو الانتقائي لالسالمونيلا، والذي يظهر كما مستعمرات سوداء على لوحات أجار XLD. ومع ذلك، إذا كان هناك أي مخاوف من التلوث، ويمكن أن تكون بديلا لوحة LB العادية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن 5.5 غرام من XLD أجار وresuspend في 5 مل من الماء منزوع الأيونات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخلط جيدا حتى كل أجار هو الرطب. إضافة 95 مل منزوع الأيونات الماء حتى تختفي جميع الكتل والمتوسطة معلق تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغلي على المديين المتوسط ​​وتذوب تماما (لا الأوتوكلاف). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبريد المتوسطة في درجة حرارة الغرفة إلى 50 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب 25 مل أجار في كل 95 × 15 ملم (قطر × الارتفاع) لوحة (لوحات مختومة مع parafilm يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر). </li></ol> 2. النيماتودا نمو متوسط ​​(NGM) رني تغذية لوحات إعداد C. وقد وصفت لوحات ايليجانس NGM سابقا 1<html> 9. هنا يوصف إجراء لفترة وجيزة لإضافة الأمبيسلين المضادات الحيوية ورني محفز كيميائية الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) في وسائل الإعلام NGM لجعل لوحات التغذية رني. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 3 غرام كلوريد الصوديوم و 2.5 جرام Bacto ببتون في 1 لتر منزوع الأيونات الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 17 غرام Bacto أجار في وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأوتوكلاف وسائل الإعلام لمدة 45 دقيقة وتبريد وسائل الإعلام إلى 50 درجة مئوية في حمام مائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الحلول التالية: 1 مل الكولسترول (5 ملغ / مل في 95٪ من الإيثانول)، 1 مل 1 M و CaCl 2، 1 مل 1 M MgSO 4، و 25 مل 1 M العازلة فوسفات البوتاسيوم (الرقم الهيدروجيني 6.0). تخلط جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل 1 M IPTG و 500 ميكرولتر الأمبيسلين (100 ملغ / مل في الماء المعقم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج الحل جيدا وتصب 60 × 15 ملم (قطر × الارتفاع) لوحات بتري باستخدام المعونة الماصة و 25 مل ماصة المصلية التالية الإجراءات العقيمة. ملء كل لوحة مع 12 مل أجار. ويمكن تخزين لوحات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر. </li></ol>&quot;jove_title&quot;&gt; 3. إعداد الحيوانات المعالجة رني للعدوى الجينات الالتهام الذاتي الأساسية تيرو-1 يستخدم كمثال لفحص وظيفة الجين في الدفاع المضيف ضد عدوى السالمونيلا. ويوضح الإجراءات التجريبية في الشكل 1 والجدول 1. بروتوكول لإعداد الحيوانات رني المعاملة للعدوى يلي، مع اليوم كل خطوة تجريبية نظرا بين قوسين. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم تيرو-1 التغذية رني والسيطرة على ناقلات الفارغة L4440 رني تغذية البكتيريا عن طريق وضع رقائق من -80 درجة مئوية البكتيريا المجمدة في 2 مل LB المتوسطة تستكمل مع 100 ملغ / مل الأمبيسلين (يوم 1). كرر هذه الخطوة مرة واحدة في الأسبوع خلال التجربة بأكملها لديها البكتيريا رني الطازجة. تخزين الثقافة في 4 ° C الثلاجة عندما لا تستخدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور 100 مل من ثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها رني على لوحات رني. إعداد ثلاثة تيرو-1 رني وثلاثة السيطرة الخامس فارغةector لوحات رني. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية خلال الليل (اليوم 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحات رني من الحاضنة 37 درجة مئوية، والسماح لهم ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة على مقاعد البدلاء. التقاط تغذية جيدة L4 النوع البري المنحرفين N2 ونقلها إلى تيرو-1 رني والسيطرة فارغة لوحات رني ناقلات. وضع ثلاثة الديدان في لوحة، وعلى لوحات ثلاث نسخ. في نفس اليوم، وإعداد لوحات رني كما هو موضح في الخطوة 3.2 (اليوم 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات رني مع الديدان في الحاضنة 20 درجة مئوية لمدة 36-40 ساعة، ونقل الديدان لوحات رني المقابلة الطازجة المعدة في الخطوة 3.3. بعد أن يتم نقل الديدان، واحتضان لوحات في 20 درجة مئوية لمدة 64 ساعة حاضنة (يوم 4). </li></ol> 4. إعداد السالمونيلا للعدوى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خط السالمونيلا -80 ° C الأسهم المجمدة في 1 XLD أجار لوحة واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية خلال الليل (اليوم 5 </stرونغ&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار معزولة جيدا مستعمرة السالمونيلا والأسود تطعيم في 2 مل LB المتوسطة عند 37 درجة مئوية مع الهز بين عشية وضحاها (اليوم 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور 80 مل السالمونيلا الثقافة بين عشية وضحاها في 1 C. ايليجانس 60 × 15 ملم (قطر × الارتفاع) لوحة NGM آغار وإعداد 6 لوحات في المجموع. احتضان لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 6 ساعة. ثقافة البكتيرية يجب أن تجف وتشكيل العشب على لوحة (يوم 7). </li></ol> 5. الديدان تصيب رني تعامل مع السالمونيلا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تيرو-1 والسيطرة فارغة ناقلات المعالجة رني المنحرفين L4 N2 (ذرية من الديدان التي أنشئت في الخطوة 3) لوحات السالمونيلا المعالجة رني. وضع الديدان في 40 لوحة في 3 لوحات لكل مجموعة. احتضان لوحات دودة عند 20 درجة مئوية لمدة 48 ساعة (يوم 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مجموعة واحدة من لوحات رني جديدة كما هو موضح في الخطوات 3.1 و 3.2 (يوم واحد 7 و <stroنانوغرام&gt; يوم 8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 48 ساعة العدوى، ونقل الديدان المصابة السالمونيلا إلى لوحات رني المقابلة أعدت في الخطوة 5.2 واحتضان عند 20 درجة مئوية (يوم 9). </li></ol> 6. البقاء على قيد الحياة الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسجل بقاء الديدان اليومية ونقل الديدان لوحات رني المقابلة الطازجة خلال فترة وضع البيض. إعداد مجموعة من لوحات رني الطازجة قبل كل نقل دودة كما هو موضح في الخطوات 3.1 و 3.2. لمس جسم الدودة (الرأس، والجزء الأوسط والذيل) بلطف مع سلك البلاتين بالارض نهاية. يتم احتسابه دودة في عداد الموتى إذا لوحظ أي حركة للجسم الدودة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسجل بقاء الديدان يوميا أو مرة كل يومين، ونقل الديدان لوحات رني المقابلة الطازجة مرتين في الاسبوع بعد وقف الديدان وضع البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد موت جميع الديدان، وتجميع البيانات من البقاء على قيد الحياة لوحات ثلاث نسخ كما مجموعة بيانات واحدة. إدخال البيانات بقاء كل مجموعة في صناعة البرمجيات الإحصائية المناسبة مثل GraphPad Prism لتوليد منحنيات البقاء على قيد الحياة وأداء كابلان ماير تحليل البقاء على قيد الحياة. يتم تكرار التجربة بأكملها مرة واحدة على الأقل للتأكد من النتيجة. </li></ol>

<ol><li>Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRiddle%2C+DL+%22C.+elegans+II%22">C. elegans II</a>. , (1997).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Aballay, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+host+for+the+study+of+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a host for the study of host-pathogen interactions.</a> Curr Opin Microbiol. 5, 97-101 (2002).</li>
<li>Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans%3A+an+emerging+genetic+model+for+the+study+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans: an emerging genetic model for the study of innate immunity.</a> Nat Rev Genet. 4, 380-390 (2003).</li>
<li>Mylonakis, E., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worms+and+flies+as+genetically+tractable+animal+models+to+study+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions.</a> Infection and Immunity. 73, 3833-3841 (2005).</li>
<li>Ford, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+descriptive+study+of+human+Salmonella+serotype+typhimurium+infections+reported+in+Ontario+from+1990+to+1997%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">A descriptive study of human Salmonella serotype typhimurium infections reported in Ontario from 1990 to 1997.</a> Can J Infect Dis. 14, 267-273 (2003).</li>
<li>Voetsch, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoodNet+estimate+of+the+burden+of+illness+caused+by+nontyphoidal+Salmonella+infections+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">FoodNet estimate of the burden of illness caused by nontyphoidal Salmonella infections in the United States.</a> Clin Infect Dis. 38 Suppl 3, (2004).</li>
<li>Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+proliferates+and+establishes+a+persistent+infection+in+the+intestine+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 10, 1539-1542 (2000).</li>
<li>Alegado, R. A., Tan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+antimicrobial+peptides+contributes+to+persistence+of+Salmonella+typhimurium+in+the+C.+elegans+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Resistance to antimicrobial peptides contributes to persistence of Salmonella typhimurium in the C. elegans intestine.</a> Cell Microbiol. 10, 1259-1273 (2008).</li>
<li>Jia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+genes+protect+against+Salmonella+typhimurium+infection+and+mediate+insulin+signaling-regulated+pathogen+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Autophagy genes protect against Salmonella typhimurium infection and mediate insulin signaling-regulated pathogen resistance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14564-14569 (2009).</li>
<li>Tenor, J. L., McCormick, B. A., Ausubel, F. M., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans-based+screen+identifies+Salmonella+virulence+factors+required+for+conserved+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans-based screen identifies Salmonella virulence factors required for conserved host-pathogen interactions.</a> Curr Biol. 14, 1018-1024 (2004).</li>
<li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+by+self-digestion%3A+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).</li>
<li>Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+controls+Salmonella+infection+in+response+to+damage+to+the+Salmonella-containing+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole.</a> J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+Sequencing+Consortium.+Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans%3A+a+platform+for+investigating+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282, 2012-2018 (1998).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 2, 1-10 (2001).</li>
<li>Liang, J., Xiong, S., Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+RNA-mediated+interference+feeding+strategy+to+screen+for+genes+involved+in+body+size+regulation+in+the+nematode+C+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Using RNA-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode C elegans.</a> J. Vis. Exp. (72), (2013).</li>
<li>Fraser, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+chromosome+I+by+systematic+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference.</a> Nature. 408, 325-330 (2000).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+online+review+of+C+elegans+biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Aballay, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+mediated+by+ced-3+and+ced-4+protects+Caenorhabditis+elegans+from+Salmonella+typhimurium-mediated+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death mediated by ced-3 and ced-4 protects Caenorhabditis elegans from Salmonella typhimurium-mediated killing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 2735-2739 (2001).</li>
<li>Melendez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+genes+are+essential+for+dauer+development+and+lifespan+extension+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Autophagy genes are essential for dauer development and lifespan extension in C. elegans.</a> Science. 301, 1387-1391 (2003).</li>
</ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

C. ايليجانس هو كائن نموذج الوراثية بسيط هو أن يأكل البكتيريا كمصدر المغذيات فيها. وبالتالي، فمن السهل أن تحل محل المواد الغذائية البكتيرية العادية مع الممرض الأمعاء للتحقيق في التفاعلات بين C. ايليجانس والممرض الذي تم اختياره. هنا يوصف بروتوكول لعدوى السالمونيلا والجمع بين C. ايليجانس رني تغذية العلاج لدراسة دور الجينات المضيف في الدفاع ضد العدوى السالمونيلا. بروتوكولات الإصابة السابقة فضح C. الديدان ايليجانس إلى البكت...

الديدان الخيطية التربة الحرة الحية انواع معينة ايليجانس هو كائن نموذج بسيط ولين العريكة وراثيا تستخدم لدراسة العديد من الأسئلة البيولوجية. C. ايليجانس موجود يغلب كما المنحرفين-التسميد الذاتي. يتم إنشاؤها من قبل الذكور بشكل عفوي غير انفصال للكروموسوم X أثناء عملية تكوين الأمشاج 1،2. في ظل وجود وفرة من المواد الغذائية، C. ايليجانس تطوير مستمر من خلال أربع مراحل اليرقات إلى الكبار. درجة الحرارة يؤثر أيضا C. التنمية ايليجانس؛ لوحظ تطور أسرع عند ارتفاع درجات الحرارة. في المختبر، C. ايليجانس هو مثقف في درجة حرارة قياسية من 20 درجة مئوية على لوحات أجار مع المصنف القولونية بكتيريا الإشريكية (سلالة OP50) كغذاء 1،2. في العقد الماضي، C. برز ايليجانس كما كائن حي اللافقارية لدراسة التفاعلات المضيف الممرض 3-5. في الطبيعة، C. ايليجانس يأكل البكتيريا كما nutrien لهار المصدر 1،2. العادية الطعام المختبر الجرثومي، OP50، يمكن أن تكون بديلا بسهولة مع مسببات الأمراض الأخرى لدراسة التفاعلات بين C. ايليجانس وأي الممرض الذي تم اختياره. في ظل هذه الظروف، الأمعاء هو الموقع الرئيسي للعدوى. في الواقع، وقد تبين مجموعة واسعة من مسببات الأمراض البكتيرية للإصابة قاتلة C. ايليجانس 3-5. بكتيريا السالمونيلا سالبة الجرام هو الممرض الجهاز الهضمي التي تسبب الأمراض التي تنقلها الأغذية الإنسان في العالم 6،7. C. ايليجانس هو المضيف نموذجا جيدا للالسالمونيلا التيفية الفأرية كما يعيد هذه البكتيريا والالتهابات المعوية يسلك المستمرة 8-10. C. وقد استخدم ايليجانس لتحديد كل من الرواية والعوامل المعروفة سابقا الفوعة السالمونيلا 11. ومن المثير للاهتمام، وC. الجهاز المناعي ايليجانس يحد بنجاح تكرار السالمونيلا. وقد أفيد في وقت سابق ان inhibition الجينات الالتهام الذاتي يجعل زيادة تكرار السالمونيلا في C. ايليجانس، مما أدى إلى وفاة مبكرة من الديدان المصابة 10. Macroautophagy (المشار إليها هنا الالتهام الذاتي) هو عملية دينامية تنطوي على إعادة ترتيب الأغشية التحت خلوية لعزل السيتوبلازم والعضيات للتسليم إلى يحلول لتدهور 12. وقد تم الإبلاغ عن الالتهام الذاتي للحد من تكرار السالمونيلا في C. ايليجانس و10،13 في الثدييات. وC. كان ايليجانس الجينوم أول جينوم حقيقية النواة متعددة الخلايا متسلسلة؛ هو استجابة للعلاج رني 14-16. علاوة على ذلك، رني يمكن إدارتها بفعالية بإخضاع الديدان لاستيعاب البكتيريا التي تحتوي على الحمض النووي الريبي مزدوج الخيط من الجين المستهدف، والمعروفة باسم رني تغذية 16،17. تم إنشاؤها الجينوم المكتبات التغذية رني كامل لالجينوم على نطاق رني الفرز 16،18. هنا، والسالمونيلا العدوى المواليةويقترن tocol مع رني تغذية للسماح اختبار C. الجينات ايليجانس الاهتمام لقدرتها على حماية ضد عدوى السالمونيلا.

<table><tbody><tr><td>LB مرق</td><td>فيشر</td><td>BP9723-500</td><td></td></tr><tr><td>XLD أجار</td><td>EMD للكيماويات</td><td>1.05287.0500</td><td></td></tr><tr><td>باكتو أجار</td><td>فيشر</td><td>DF0140-01-0</td><td></td></tr><tr><td>ببتون</td><td>فيشر</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم</td><td>فيشر</td><td>S671-500</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الكالسيوم</td><td>فيشر</td><td>C69-500</td><td></td></tr><tr><td>كبريتات المغنيسيوم</td><td>فيشر</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>التكنولوجيا الحيوية الذهبية</td><td>12481C50</td><td></td></tr><tr><td>الكوليسترول</td><td>سيجما</td><td>C8667-25G</td><td></td></tr><tr><td>أمبيسلين</td><td>فيشر</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>السالمونيلا التيفيموريوم</td><td>ATCC</td><td>ATCC14028</td><td></td></tr><tr><td>طبق بتري 95 × 15 مم</td><td>فيشر</td><td>FB0875714G</td><td></td></tr><tr><td>صحن بتري 60 × 15 مم&nbsp;</td><td>فيشر</td><td>08-757-13A</td><td></td></tr><tr><td>فالكون ماصة مصلية</td><td>فيشر</td><td>13-668-2</td><td></td></tr><tr><td>فالكون اكسبرس بيبيت إيد</td><td>فيشر</td><td>13-675-42</td><td></td></tr><tr><td>ماكس Q6000 حاضنة اهتزاز &nbsp;</td>حاضنة <td>ثرمو ساینتيك</td><td>SHKE6000-7</td><td></td></tr><tr><td></td><td>بيرسيفال</td><td>I-36DL</td><td></td></tr></tbody></table>

بروتوكول لتصيب<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; مع<em&gt; السالمونيلا التيفية الفأرية</em

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

في العقد الماضي، C. برز ايليجانس كما كائن حي اللافقارية لدراسة التفاعلات بين المضيفين ومسببات الأمراض، بما في ذلك الدفاع المضيف ضد البكتيريا سالبة الجرام السالمونيلا التيفية الفأرية السالمونيلا يحدد العدوى المستمرة في الأمعاء من C. ايليجانس والنتائج في الموت المبكر من الحيوانات المصابة. وقد تم تحديد عدد من الآليات الحصانة في C. ايليجانس للدفاع ضد العدوى السالمونيلا. الالتهام الذاتي، والحفاظ تطويريا تدهور الليزوزومية المسار، وقد تبين للحد من تكرار السالمونيلا في C. وايليجانس في الثدييات. هنا، يوصف بروتوكول لتصيب C. ايليجانس مع السالمونيلا التيفية الفأرية، الذي يتعرض لالسالمونيلا الديدان لفترة زمنية محدودة، على غرار عدوى السالمونيلا في البشر. يقصر عدوى السالمونيلا بشكل كبير من عمر C. ايليجانس &lt;م /&gt;. الالتهام الذاتي باستخدام الجينات الأساسية تيرو-1 كمثال على ذلك، ونحن معا هذه الطريقة الإصابة بفيروس C. ايليجانس رني تغذية النهج وأظهر هذا البروتوكول يمكن استخدامها لدراسة وظيفة C. ايليجانس الجينات المضيف في الدفاع ضد العدوى السالمونيلا. منذ C. ايليجانس الجينوم هي المكتبات رني كله المتاحة، هذا البروتوكول يجعل من الممكن لفحص شامل لC. الجينات ايليجانس التي تحمي ضد السالمونيلا ومسببات الأمراض المعوية الأخرى باستخدام المكتبات رني على نطاق الجينوم.

عند 20 درجة مئوية، ومتوسط ​​عمر من النوع البري الديدان N2 هو 17 يوما (الشكل 2A والجدول 2). يقلل الإصابة السالمونيلا بشكل كبير من متوسط ​​عمر الديدان N2 إلى 10.5 يوما (ع = 0.0002، اختبار تسجيل رتبة) (الشكل 2A ). إذا C. ايليجانس الجينات تلعب دورا هاما في الدفاع ضد العدوى السالمونيلا، ومن المتوقع أن تثبيط لها سوف تضفي القابلية للعدوى السالمونيلا. ...

وقد برزت C. ايليجانس نموذجا وراثية جديدة لدراسة التفاعلات المضيف الممرض. نحن هنا وصف بروتوكول لتصيب C. ايليجانس مع السالمونيلا التيفية الفأرية إلى جانب تقنية التدخل رني المزدوج حبلا لدراسة دور الجينات المضيف في الدفاع ضد العدوى السالمونيلا.

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو إصابة ديدان elegance ببكتيريا salmonella لفحص التفاعلات بين المضيف والممرض. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تثبيط تعبير جين المضيف باستخدام تقنية RNAi. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في إصابة الديدان المعالجة بـ RNA eye ببكتيريا salmonella.يتم إيقاف العدوى عن طريق نقل الديدان المصابة إلى أطباق تغذية rna غير ممرضة. وتتمثل الخطوات النهائية في تسجيل معدل بقاء الديدان المصابة على قيد الحياة. قم بحساب نسبة البقاء من هذه البيانات، وفي النهاية تحديد الجينات الأساسية للحماية ضد salmonella.ستقوم جولي جون، وهي فنية مختبر، باستعراض هذا الإجراء. ابدأ بتجهيز أطباق المزرعة المطلوبة. أولاً، قم بتحضير أطباق agar XLD.تتميز هذه الأوساط بأنها انتقائية لبكتيريا السالمونيلا، والتي تظهر كـمستعمرات سوداء على هذه الأطباق. تأكد من إعادة تعليق آجار XLD في الماء بمعدل جرام واحد لكل ملليلتر قبل خلطه في الحجم الكامل من الماء. لا تستخدم جهاز التعقيم البخاري (autoclave).تم تسخين هذا الآغار للتو باستخدام لوح تسخين. ابدأ في تحضير أطباق XLD بقطر 95 مليمتر، مع إضافة 25 مليلتر من الآغار لكل طبق. لتحضير أطباق تغذية NGM مع RNAI لإنشاء ما يسمى بأطباق RNAI، استخدم الطرق القياسية؛ باختصار، أضف الأمبيسيلين والمحفز الكيميائي لـ RNAi، وهو IPTG، إلى الوسط بعد تعقيمه بجهاز الأوتوكلاف.بمجرد أن تبرد، يتم ملء أطباق بقطر 60 millimeter بـ 12 milliliters من الآجار، وتظل هذه الأطباق صالحة لمدة تصل إلى شهر عند تخزينها في درجة حرارة 4 °C قبل استخدامها. يتم تحضينها أولاً مع البكتيريا. في هذا المثال، يمثل Beck one الجين المستهدف نظراً لكونه أساسياً للدفاع ضد salmonella.ابدأ بتجهيز مزارع RNAI ومزارع الضبط. أضف رقاقة من البكتيريا المجمدة من وحدة التخزين عند -80 °C إلى 2 mL من وسط lb المحتوي على ampicillin. يجب أن تعبر البكتيريا عن RNAi أو لا تعبر عنه، ولكن مع الاحتفاظ بناقل فارغ في كلتا الحالتين.انقل هاتين المزرعتين إلى الحاضنة واتركهما للنمو طوال الليل. يجب القيام بذلك بشكل أسبوعي لضمان توفر البكتيريا دائمًا في اليوم التالي. استزرع 100 µL من المزرعة في أطباق RNA eye.قم بإعداد ثلاث مكررات على الأقل من كل نوع من الأطباق، بحيث تشمل مجموعات تجريبية ومجموعات ضابطة. يتم تحضين هذه الأطباق عند 37 درجة مئوية طوال الليل. وفي اليوم التالي، تُترك الأطباق لتصل إلى درجة حرارة الغرفة.بعد ذلك، يتم نقل ديدان من النوع البري N two الخنثى في المرحلة L four المُغذاة جيداً إلى الأطباق. ويكفي وضع ثلاث ديدان في كل طبق. تُحضن هذه الأطباق عند 20 درجة مئوية في اليوم ذاته.قم بتحضير المزيد من أطباق RNAi التي تحتوي على بكتيريا مستزرعة. وبعد مرور 36 إلى 40 ساعة عند درجة حرارة 20 degrees Celsius، انقل الديدان من أطباق RNAi الأولى إلى أطباق RNAi الجديدة. ثم أعدها إلى درجة حرارة 20 degrees Celsius لمدة 64 ساعة أخرى.ابدأ بتخطيط مخزون السلمونيلا (Salmonella) من المجمد عند درجة حرارة 80- درجة مئوية على طبق XLD. يتم تحضين الطبق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل. في اليوم التالي، اختر مستعمرة سوداء معزولة من الطبق ولقح بها 2 mL من وسط lb.اضبط الجهاز للاهتزاز طوال الليل عند 37 درجة مئوية، وفي صباح اليوم التالي، استخدم وسط LB الملقح لتلقيح ستة أطباق NGM. ضع 80 µL في كل طبق؛ وبعد ست ساعات في درجة حرارة الغرفة، يجب أن تكون المزرعة البكتيرية قد جفت وستشكل نمواً كثيفاً (lawn) على أطباق NGM.بعد ذلك، انقل الديدان المعالجة بـ RNAi والديدان الضابطة المعالجة إلى الأطباق الستة. ضع 40 دودة في كل طبق واتركها لتحضن عند 20 degrees Celsius لمدة 48 ساعة. ابدأ في تحضير أطباق RNAi جديدة يوميًا بدءًا من هذه المرحلة.يتم ذلك لضمان جاهزيتها خلال يومين وكل يوم يليه لإجراء مقايسة البقاء على قيد الحياة. بعد 48 ساعة، انقل الديدان المصابة مرة أخرى إلى أطباق RNAi محضرة حديثاً أو إلى أطباق التحكم بالناقل الفارغ. بعد ذلك، أعد هذه الأطباق إلى الحاضنة عند درجة حرارة 20 degree Celsius يومياً في وقت وضع البيض التقريبي.سجّل معدل بقاء الديدان وانقل الناجيات إلى أطباق RNA عينية جديدة لتقييم البقاء. انقر على الدودة بلطف باستخدام سلك بلاتيني مسطح. إذا لم تظهر أي استجابة، فإن الدودة ميتة.خلال فترة وضع البيض، يجب تحديد الديدان ثم القضاء عليها من خلال النظافة الداخلية. وينبغي إزالة هذه الديدان في الوقت المناسب.ستكون البيانات منظمة بشكل كبير إذا تم حساب ديدان البروتين هذه بشكل متميز كديدان تجريبية. وبمجرد أن تتوقف الديدان عن وضع البيض، يكون من الضروري فقط نقلها إلى أطباق RNAI جديدة مرتين في الأسبوع. وبمجرد نفوق المجموعات، يتم تجميع بياناتها ورسم منحنيات البقاء على شكل منحنيات Kaplan-Meier.أياً كانت النتيجة، قم بإجراء التجربة مرتين على الأقل للتأكد. عند درجة حرارة 20 °C، يبلغ متوسط عمر ديدان N two من النوع البري 17 يوماً. وتؤدي عدوى Salmonella إلى خفض متوسط عمر ديدان N two بشكل ملحوظ إلى 10.5 يوماً، كما هو متوقع عند المعالجة بـ Beck one RNAi.انخفاض معدل البقاء على قيد الحياة بعد العدوى ببكتيريا السالمونيلا. حيث انخفض متوسط العمر من 10.5 إلى تسعة أيام، كما كان الحد الأقصى للعمر أقصر بشكل ملحوظ أيضاً. وهذا يدعم دور Beck one في دفاع sea elegance ضد العدوى.الحيوانات التي عولجت بـ Beck one RNAi، ولكن لم تعالج بالسالمونيلا، لم يطرأ عليها تغير ملموس في طول العمر. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنفيذ نهج RNA وبروتوكول العد لفحص دور جين المضيف في الدفاع ضد عدوى السالمونيلا.

a-protocol-to-infect-caenorhabditis-elegans-with-salmonella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

المصدر: تشين، ي.، وآخرون. تقييم ضراوة ومسببات عدوى إيروموناس في نموذج التهاب الكاينورهابديتس الأمريكي . J. Vis. Exp. (2018)يوضح هذا الفيديو اختبار البقاء باستخدام C. elegans لنمذجة مرض Aeromonas ، حيث يؤدي تناول البكتيريا عن طريق الفم إلى عدوى معوية ووفيات، مما يمكن من تقييم كمية لضراوة البكتيريا في نظام العائل الحي.

نمذجة أمراض إيروموناس في C. elegans باستخدام اختبار البقاء

وwormsorter يسهل شاشات الوراثية في انواع معينة ايليجانس عن طريق الفرز الديدان وفقا لتعبير عن صحفيين الفلورسنت. هنا، نحن تصف استخدام جديدة: الفرز وفقا لاستعمار من قبل الممرض، معربا عن GFP، ونحن نوظف ذلك لدراسة دور غير مفهومة الاعتراف الممرض في الشروع في الاستجابات المناعية.

الفصل الآلي لل<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; المستعمرة بنسب مختلفة من قبل الممرض الجرثومي

عادة ما يزرع C. ايليجانس على لوحات أجار الصلبة أو السائلة في الثقافات المصنف مع E. القولونية. لمنع المنتجات الثانوية البكتيرية من التباس الدراسات السمية والغذائية، ونحن تستخدم وسيلة السائل ممحوضة، CeHR، لتنمو ومزامنة عدد كبير من الديدان لمجموعة من التطبيقات المصب.

زراعة انواع معينة ايليجانس في ممحوضة السائل وسائل الإعلام وإنشاء المعدلة وراثيا الديدان عن طريق قصف Microparticle

نقدم هنا، ديدان أسطوانية ايليجانس كاينورهابديتيس كنموذج مضيف تنوعاً لدراسة التفاعل الميكروبية.

ايليجانس كاينورهابديتيس السلكية-نموذج تنوعاً في فيفو لدراسة التفاعلات بين الميكروبات والمضيف

أصبحت الزرد (دانيو rerio) نموذج حيوانات الفقارية المستخدمة على نطاق واسع للاستعمار الميكروبي والمرضية. ويصف هذا البروتوكول استخدام بروتوزوا caudatum براميسيوم كوسيلة للعدوى المنقولة عن طريق الأغذية في اليرقات الزرد. كوداتوم P. الزاجرة البكتيريا بسهولة والحصول على تناول الزرد اليرقات من خلال سلوك الضحية الطبيعية.

استخدام البرزي caudatum براميسيوم كوسيلة للأمراض المنقولة بالأغذية في "اليرقات الزرد"

يصف هذا البروتوكول نموذج الماوس من التليف المعوي الذي يحركه السالمونيلا الذي يشبه السمات المرضية الرئيسية لمرض كرون بما في ذلك التهاب عبر الجدارية والتليف. يمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم العوامل المضيفة التي تغير النتائج الليفية باستخدام الفئران المتحولة التي تم الحفاظ عليها على خلفية وراثية C57Bl/6.

عدوى السالمونيلا المزمنة الناجمة عن التليف المعوي

يصف البروتوكول التالي تطوير وتحسين سير عمل عالي الإنتاجية لزراعة الديدان والتصوير الفلوري ومعالجة الصور الآلية لتحديد كمام البولي جلوتامين كميا كتقييم للتغيرات في البروتيوستاسيس.

أتمتة القياس الكمي الكلي في Caenorhabditis elegans

إن عدوى Caenorhabditis elegans بواسطة الطفيلي المجهري Nematocida parisii تمكن الديدان من إنتاج ذرية شديدة المقاومة لنفس العامل الممرض. هذا مثال على المناعة الموروثة ، وهي ظاهرة جينية غير مفهومة جيدا. يصف هذا البروتوكول دراسة المناعة الموروثة في نموذج دودة قابلة للسحب وراثيا.

دراسة المناعة الموروثة في نموذج Caenorhabditis elegans لعدوى Microsporidia

قد تؤثر ميكروبات الأمعاء بشكل إيجابي أو سلبي على صحة مضيفها من خلال آليات محددة أو محفوظة. Caenorhabditis elegans هي منصة ملائمة لفحص مثل هذه الميكروبات. يصف البروتوكول الحالي الفحص عالي الإنتاجية ل 48 عزلة بكتيرية للتأثير على مقاومة إجهاد الديدان الخيطية ، ويستخدم كبديل لصحة الديدان.

فحص عالي الإنتاجية للعزلات الميكروبية مع التأثير على صحة Caenorhabditis elegans

يصف هذا البروتوكول اضطرابا في 96 بئرا من Caenorhabditis elegans المستعمر بكتيريا فرديا بعد الشلل البارد وتبييض السطح لإزالة البكتيريا الخارجية. يتم طلاء التعليق الناتج على ألواح أجار للسماح بتحديد كمي دقيق ومتوسط الإنتاجية للحمل البكتيري في أعداد كبيرة من الديدان الفردية.

استخدام بيانات الدودة المفردة لقياس عدم التجانس في التفاعلات البكتيرية Caenorhabditis elegans

تعلم بروتوكول إصابة C. elegans بـ Salmonella typhimurium لدراسة تفاعلات المضيف والممرض باستخدام تداخل الحمض النووي الريبوزي. تساعد هذه الطريقة الباحثين على تحديد الجينات الأساسية للحماية ضد العدوى.

بروتوكول لتصيب

استكشف المزيد من الفيديوهات