مقايسة الوظيفية للفجوة صلي فحص. Electroporation للمن الخلايا الملتصقة على الإنديوم أكسيد القصدير

التثقيب الكهربائي هو تقنية يتم فيها تطبيق تيار كهربائي على الخلايا الحية من أجل فتح مسام عابرة على غشاء الخلية. من خلال هذه المسام ، يمكن للأصباغ والجزيئات الأخرى التي لا تعبر عادة غشاء الخلية أن تدخل الخلية ، وتغلق المسام بسرعة ، دون أي ضرر للخلية. سنصف كيف يمكن تزويد الخلايا الملتصقة بالكهرباء أثناء نموها على شريحة مطلية جزئيا بمادة موصلة للكهرباء وشفافة.

المادة عبارة عن أكسيد القصدير الإنديوم ، ولأنها توصل التيار الكهربائي ، فإنها تفتح المسام التي تسمح للصبغة بدخول الخلية. ثم من الممكن فحص ما إذا كانت الخلايا بها تقاطعات فجوة أم لا ، وعدد تقاطعات الفجوة هي قنوات صغيرة تربط الأجزاء الداخلية للخلايا المجاورة وتسمح بمرور الجزيئات الصغيرة. من المسلم به منذ فترة طويلة أن الاتصال الوصلي الفجوة له مجموعة متنوعة من الوظائف المهمة في الخلية ، بما في ذلك تحول الأورام والورم الخبيث.

مرحبا بكم في عرض مشاريع الخلية هذا حول كيفية إجراء التثقيب الكهربائي للخلايا الملتصقة باستخدام Insitu. تظهر هذه الصورة ، وهو ما سنكون قادرين على القيام به ، أن صبغة الفلورسنت فضفاضة للأصفر ، تم إدخالها في الخلايا التي تنمو على زجاج شفاف وموصل حتى هذا الخط ، يسهل رؤية الخط تحت تباين الطور.

ها هي ذا. يمكنك أن ترى أن الصبغة قد انتشرت من خلال تقاطعات الفجوة من الخلايا الموجودة على اليسار ، والتي تم تحميلها بالصبغة عن طريق التثقيب الكهربائي إلى الخلايا الموجودة على اليمين. مما يؤدي إلى هذا التدرج للخلايا المضان هي tryps.

Inized ثم يتم نقلها إلى أنبوب في جهاز الطرد المركزي. من المهم جدا أن تنتشر الخلايا جيدا أثناء نموها في الغرفة. لهذا السبب ، من الأفضل الطرد المركزي للخلايا لإزالة أي آثار للتربسين.

يتم شفط الوسط مع آثار التربسين من الخلايا في تقريبا واحد مليلتر من وسط النمو ، ثم يتم طلاؤه في الغرفة. تحتوي الماصة على معلق الخلية ، وإزالة الغطاء من الغرفة وإدخال الخلايا بالتنقيط في الغرفة لتسهيل حملها. توضع الغرفة في طبق بتري بطول ستة سنتيمترات.

الغرفة إلى الحاضنة لتنمو الخلايا. سوف تنتشر الخلايا المطلية جيدا وستنمو لتلمس بعضها البعض وتشكل تقاطعات فجوة. عندما تكون الخلايا جاهزة للعرض الكهربائي ، اضبط مولد النبض الموضعي على الظروف المرغوبة.

راجع الدليل للحصول على وصف لعملية الإعداد البسيطة. عند ضبط الجهد في الموقع ، سيتم تشغيل الضوء الأحمر على لوحة المفاتيح. خذ الزجاجتين الدافئتين من DMEM بدون الكالسيوم من الحمام المائي ، إحداهما DMEM بدون كالسيوم ، ولكن مع مصل غسيل الكلى ، والأخرى هي DMEM.

بدون الكالسيوم، اجعل الماصات جاهزة للتحميل بشكل أكثر مرونة لاللون الأصفر في الماصة. بدلا من التنهد ، أخرج الخلايا من الحاضنة. قم بإزالة الوسيط عن طريق قلبه في دورق الغسيل في البداية.

ثم ضعه على المنديل مرة واحدة باستخدام DMEM بدون الكالسيوم ، لا تحاول إزالة كل DMEM تماما لأن الخلايا قد تجف. أضف اللون الأصفر لوسيفر بعناية على الحاجز حتى لا تزعج الخلايا ولكن بسرعة كافية حتى لا تجف الخلايا. استخدم 200 ميكرولتر لكل نصف من الغرفة.

ضع الغطاء على الغرفة في الموقع ، ثم قم بتحميله في شريط التمرير. تأكد من أن علامات التبويب الطرفية للغرفة تتناسب مع فتحات شريط التمرير عن طريق الضغط على شريط التمرير. أدخل الغرفة في حامل الغرفة.

اضغط على زر النبض على لوحة مفاتيح مولد النبض. سيومض مؤشر LED الموجود على مولد النبض وعلى حامل الغرفة باللون الأحمر أثناء عملية التثقيب الكهربائي ثم يومض باللون الأخضر للإشارة إلى اكتمال دورة الدخول. اسحب شريط التمرير للخلف أسفل حامل الغرفة وقم بإزالة الغرفة.

استنشق معظم اللون الأصفر لوسيفر لاستخدامه مرة أخرى ، لكن احرص على عدم تجفيف الخلايا. أضف DMEM بدون كالسيوم. مع مصل غسيل الكلى ، يساعد المصل المسامية على إغلاق الغرفة والعودة إلى الحاضنة لنقل لوسيفر الأصفر من خلال تقاطعات الفجوة.

يجب أن يكون التوقيت متسقا من تجربة إلى أخرى. المعيار ثلاث دقائق. صب الوسط في دورق النفايات.

أضف 4٪ محلول تثبيت الفورمالديهايد مع عجينة أو ماصة ، انتظر في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين على الأقل. يسكب الفورمالديهايد ويشطف عدة مرات. باستخدام PBS ، يتم تثبيت الخلايا على الزجاج ، لذلك لا يوجد خطر كبير من انفصالها أثناء الغسيل.

لتتمكن من رؤية الخلايا تحت تباين الطور ، من المهم وضع زلة غطاء أعلى الغرفة. املأ الغرفة ب PBS لتشكيل الغضروف المفصلي الفخور. تجنب فقاعات الهواء ، ضع زلة الغطاء.

لا تقلق إذا كان PBS يفيض فقط امتصاص PBS الإضافي على الأنسجة. أنت بحاجة إلى مجهر فلوري مقلوب ، ويفضل أن يكون ذلك مع تباين الطور وكتلة مرشح لأصفر. تحت التباين المرحلي ، ابحث عن حافة المنطقة الكهربائية.

سترى سطرين تحت الخلايا الفلورية. على نصف الشريحة سوف يكون التألق بشكل مكثف. الخط الأقرب إلى الخلايا المتوهجة هو حافة المنطقة الكهربائية.

أي تألق يتجاوز ذلك يرجع إلى نقل اللون الأصفر من خلال تقاطعات الفجوة. على سبيل المثال ، تظهر هذه الصورة للخلايا الظهارية الخلايا التي كانت كهربائية على الجانب الأيسر من الصورة ، مما ينقل لوسيفر الأصفر إلى الخلايا المجاورة غير المثقبة بالكهرباء ، مما يخلق تدرجا للخلايا المتوهجة من حافة الطلاء الموصل باتجاه اليمين. تظهر هذه الصورة نفس إطار الخلايا تحت تباين الطور.

لاحظ أنه يمكنك رؤية الخط X بوضوح شديد. يمكن إجراء مقياس كمي لمقدار نقل تقاطع الفجوة الذي حدث يدويا من خلال العمل مع صور تباين الفلورسنت والطور للخلايا الكهربائية. تعتبر النجوم على طول حافة المنطقة الموصلة خلايا مانحة.

لقد تم تكوينها بالكهرباء وأخذها فضفاضة من أجل اللون الأصفر. يمررون لوك للأصفر إلى الخلايا المجاورة على اليمين ، والتي تمرره. لا يزال أبعد من ذلك بكميات متناقصة.

أن تنتج نسبة النقاط إلى النجوم 41 إلى ثمانية في هذه الحالة رقما لمقارنة مدى اتساع نطاق نقل تقاطع الفجوة في هذه الحالة. 5.1 هو مؤشر تقاطع الفجوة. بديل لوضع علامات يدويا على الخلايا وعدها هو استخدام برنامج تحليل الصور لقياس الكميات النسبية للتوهج على طول الجانب غير المنتخب لحدود الخلية الكهربائية.

هذه الخلايا ليس لها تقاطعات فجوة. ها هي الحافة اليمنى للمنطقة المثقبة بالكهرباء. لاحظ أنه لا يوجد تدرج في التألق ، مما يشير إلى عدم وجود تقاطعات فجوة تحت تباين الطور.

يمكنك رؤية جميع الخلايا بوضوح. لاحظ أن الخط X مرئي أيضا بوضوح. في هذا المثال.

تم تحفيز جميع الخلايا الموجودة في الغرفة باستخدام عامل نمو البشرة EGF ، وبعد 10 دقائق تم إصلاحها وفحصها بحثا عن قوس الفوسفو. لاحظ أن الخلايا الملطخة على اليمين لم يتم تثقيبها بالكهرباء ، وأن الخلايا الموجودة على اليسار حتى هذا الخط قد تم تثقيبها بالكهرباء. تظهر الخلايا غير المثقبة بالكهرباء تلطيخا بنيا بجسم مضاد فوسفو وبيروكسيداز مناعي.

لا تظهر الخلايا الكهربية أي تلطيخ لأن ببتيد الفوسفو الكهربائي قد منع مجال SSH الثاني من الاستيلاء الثاني ومنع فسفرة IRK ل EGF. لاحظ المنطقة التي يبلغ طولها من ثلاث إلى أربع خلايا على يمين الخط حيث لم تكن الخلايا كهربائية ولكنها لا تظهر تلطيخا. هذه هي الخلايا التي اكتسبت الببتيد المانع من جيرانها المثقفين بالكهرباء عبر تقاطعات الفجوة.

هذا هو أقوى دليل ممكن على أن تثبيط الإشارة يجب أن يكون بسبب الببتيد ولا يمكن أن يكون قطعة أثرية للتثقيب الكهربائي. نظرا لأن هذه الخلايا ليست كهربائية ، فهذا هو نفس الإطار الموضح تحت تباين الطور. لاحظ عدم وجود أي تغيير في التشكل بعد التثقيب الكهربائي.

مع بعض المرضى فجوة الاتصال الوصفي يمكن أن يكون كمية على وجه التحديد في مجموعة كبيرة ومتنوعة من الخلايا المستنبتة. يعد إدخال الببتيدات لمقاطعة مسارات إشارات محددة نهجا قويا لتقييم أهمية البروتين في الخلايا الحية ، وتفاعلات البروتين التي تم تحديدها مع البروتينات النقية. يمكن أن تكون هذه الخطوة الأولى المهمة في تطوير أدوية القبة الببتيدية.