Name: مقايسة الوظيفية للفجوة صلي فحص. Electroporation للمن الخلايا الملتصقة على الإنديوم أكسيد القصدير (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: تعلم تقنية الكهربائية للخلايا الملتصقة لدراسة الاتصال بين الخلايا عبر الفجوات الصلي باستخدام أكسيد الإنديوم والقصدير الشفاف الموصل. هذه الطريقة تتيح تقييم وظيفة الفجوات الصلي في الخلايا الحية بدقة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر لويل كوكران على مساعدة الخبراء في تصوير الفيديو. يتم الاعتراف بامتنان بالمساعدة المالية المقدمة من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR) ، والمؤسسة الكندية لسرطان الثدي (CBCF ، فرع أونتاريو) ، ومجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC) ، والتحالف الكندي لأبحاث سرطان الثدي ، ومراكز أونتاريو للتميز ، وعمل سرطان الثدي في كينغستون ، وصندوق الوصية كلير نيلسون من خلال المنح المقدمة إلى LR. حصلت SG على طلاب NSERC. تم دعم MG من خلال زمالة ما بعد الدكتوراه من برنامج سرطان الثدي بالجيش الأمريكي ، ووزارة البحث والابتكار في مقاطعة أونتاريو ولجنة البحوث الاستشارية بجامعة كوينز.

1. طلاء الخلايا في Electroporation للغرف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غطاء الصفحي التدفق، يعرض للتريبسين الخلايا باستخدام تقنية معقمة كالمعتاد. ملاحظة: من المهم جدا للقضاء بواسطة الطرد المركزي كل آثار التربسين، لأنها قد تعيق انتشار الخلايا على الزجاج، وبالتالي تشكيل الملتصقة وتقاطعات الفجوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 1 مل من تعليق خلية في غرف Electroporation للالمعقمة المتوفرة مع electroporator في الموقع (الشكل 1)، ومكان في 37 درجة مئوية، CO 2 الحاضنة. يمكن تحسين التصاق الخلية بواسطة طلاء على فبرونيكتين، والكولاجين، بولي يسين أو الخلية والأنسجة لاصقة (انظر الجدول المواد): ملاحظة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما شكلت خلايا طبقة متموجة انهم مستعدون للفحص GJIC. </li></ol> 2. Electroporation للإجراء ويمكن إجراء فحص لElectroporation للGJIC خارج غطاء الصفحي التدفق،نظرا لأنه يستغرق سوى بضع دقائق. إذا كانت هناك حاجة مرات حضانة أطول لإجراء تجربة معينة، ومن ثم يمكن إجراء تماما في غطاء تدفق الصفحي. في جميع الحالات، يجب على الدوائر التي تزرع فيها الخلايا تكون عقيمة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 5 ملغ / مل حل لوسيفر الأصفر: يذاب 10 ملغ LY مسحوق (المتوفرة مع electroporator) في 2 مل خالية من الكالسيوم متوسطة النمو. للتجارب التي تتطلب مرات حضانة أطول، فلتر تعقيم الحل وتخزينها في 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسطة النمو وغسل الخلايا مع خالية من الكالسيوم المتوسطة، والحرص على عدم خدش أحادي الطبقة أو تجف الخلايا. إذا تجفف الخلايا التي عادة ما يكون نوى أكثر قتامة والتقاط LY دون Electroporation لل. وأثر هو أكثر وضوحا في منتصف الشريحة التي تتعرض أكثر إلى مسودات الهواء (الشكل 4F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع pipettor إيبندورف، ماصة محلول الصبغة إلى الخلايا (400 ميكرولتر للغرفة بأكملها)، على حافة الغرفة، بeing الحرص على عدم لمس طبقة الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع غرفة في حامل المرفق مع electroporator وتطبيق نبض لقوة المناسبة (انظر مناقشة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية بعض من الحل LY. ويمكن إعادة استخدامها مرة ثانية للتجارب أقل أهمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة خالية من الكالسيوم DMEM تحتوي على 10٪ مصل dialysed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 3-5 دقيقة في الحاضنة للسماح بنقل الصبغة من خلال تقاطعات الفجوة. ملاحظة: إدراج مصل dialysed في هذه المرحلة تساعد إغلاق المسام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الصبغة الفردية مع خالية من الكالسيوم DMEM للمراقبة الخلية الحية. بدلا من ذلك، وخلايا يمكن أن تكون ثابتة في هذه المرحلة، من خلال إضافة 4٪ فورمالدهايد إلى البئر، ثم تغسل مع PBS (الفوسفات مخزنة المالحة). في جميع الحالات يجب غسل إزالة كافة الخلفية. ملاحظة: في التجارب الأولية لتحديد الظروف المثلى، إذا كان الجهد منخفض جدا، فمن الممكن للسماح للخلايا التعافي في incubatoص لبضع دقائق وelectroporate نفس الشريحة للمرة الثانية، لتوفير في تكلفة الشرائح. </li></ol> 3. فحص مجهرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة الخلايا تحت إضاءة مضان، باستخدام مجهر مقلوب مجهزة المرشح المناسب للصبغة المستخدمة. لوسيفر الأصفر، الإثارة هو 423nm، 555nm الانبعاثات، فلتر WBV لمجهر نيكون IX70. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القضاء على الآثار الغضروف المفصلي عن طريق وضع غطاء زجاجي الانزلاق على رأس البلاستيك جيدا، بعد ملئه إلى الأعلى مع السائل، لدراسة مورفولوجيا الخلايا تحت النقيض من المرحلة. لأفضل الصور، وكذلك يمكن فصل من الشريحة، وساترة وضعت على الإطار. لخلايا ثابتة، وكذلك يمكن ملء مع الجلسرين للمراقبة مجهرية، في حين أن الخلايا الحية يجب أن تكون مليئة النمو المتوسطة. ملاحظة: الغسل والتصوير أسهل إذا تم إصلاح الخلايا مع الفورمالديهايد بعد نقل الصبغة (الخطوة 2.7 أعلاه). إذا كانت الخلايا لار الثابتة، ويتم القضاء على مضان من الخلايا داخل ما يقرب من 60 دقيقة وهذا يتوقف على نوع من الخلايا، والجهد وكمية LY أدخلت بينما في الخلايا الثابتة يتم الاحتفاظ مضان لعدة ساعات. ومع ذلك، يتلاشى مضان أو تبدد بعد O / N الحضانة، حتى في الخلايا الثابتة. لهذا السبب، يجب أن تؤخذ الصور قريبا بعد Electroporation لل(الشكل 2). </li></ol> 4. الكميات من الاتصالات بين الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصوير الخلايا مع الهدف 20X تحت مضان والنقيض من المرحلة (الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد ووضع علامة مع نجم الخلايا electroporated على الحدود مع المنطقة غير electroporated (الشكل 2، السهم، Electroporation للحافة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد ووضع علامة مع نقطة خلايا الاستشعاع على الجانب غير electroporated، حيث قامت بتحويل الصبغة من خلال تقاطعات الفجوة (أرقام 3A و 3B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم العدد الكلي للالاستشعاع الخلايا على منطقة غير electroporated من قبل عدد من خلايا electroporated على طول حافة (أرقام 3A و 3B). ملاحظة: يتم احتساب نقل من 200 على الأقل خلايا electroporated الحدود متجاورة لكل تجربة. عدد حصل هو القيمة GJIC. </li></ol>

<ol><li>Raptis, L., et al. Electroporation of Adherent Cells in Situ for the Study of Signal Transduction and Gap Junctional Communication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRaptis%2C+L+%22Electroporation+protocols%22">Electroporation protocols</a>. , The Humana Press Inc. edited by S Li 167-183 (2008).</li>
<li>Giorgetti-Peraldi, S., Ottinger, E., Wolf, G., Ye, B., Burke, T. R., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+effects+of+phosphotyrosine-binding+domain+inhibitors+on+insulin+receptor+signalling+and+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular effects of phosphotyrosine-binding domain inhibitors on insulin receptor signalling and trafficking.</a> Mol Cell Biol. 17, 1180-1188 (1997).</li>
<li>Boccaccio, C., Ando, M., Tamagnone, L., Bardelli, A., Michielli, P., Battistini, C., Comoglio, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+epithelial+tubules+by+growth+factor+HGF+depends+on+the+STAT+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of epithelial tubules by growth factor HGF depends on the STAT pathway.</a> Nature. 391, 285-288 (1998).</li>
<li>Bardelli, A., Longati, P., Gramaglia, D., Basilico, C., Tamagnone, L., Giordano, S., Ballinari, D., Michieli, P., Comoglio, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+signal+transducers+from+oncogenic+MET+mutants+abrogates+cell+transformation+and+inhibits+invasive+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Uncoupling signal transducers from oncogenic MET mutants abrogates cell transformation and inhibits invasive growth.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 95, 14379-14383 (1998).</li>
<li>Gambarotta, G., Boccaccio, C., Giordano, S., Ando, M., Stella, M. C., Comoglio, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ets+up-regulates+met+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Ets up-regulates met transcription.</a> Oncogene. 13, 1911-1917 (1996).</li>
<li>Arulanandam, R., Vultur, A., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+affecting+Stat3+activity+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques affecting Stat3 activity levels.</a> Anal Biochem. 338 (1), 83-89 (2005).</li>
<li>Boussiotis, V. A., Freeman, G. J., Berezovskaya, A., Barber, D. L., Nadler, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+human+T+cell+anergy%3A+blocking+of+IL-2+gene+transcription+by+activated+Rap1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Maintenance of human T cell anergy: blocking of IL-2 gene transcription by activated Rap1.</a> Science. 278 (5335), 124-128 (1997).</li>
<li>Brownell, H. L., Firth, K. L., Kawauchi, K., Delovitch, T. L., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+the+study+of+Ras+activation%3B+electroporation+of+%5Balpha-32%5DGTP%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel technique for the study of Ras activation; electroporation of [alpha-32]GTP.</a> DNA Cell Biol. 16, 103-110 (1997).</li>
<li>Tomai, E., Vultur, A., Balboa, V., Hsu, T., Brownell, H. L., Firth, K. L., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+electroporation+of+radioactive+compounds+into+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ electroporation of radioactive compounds into adherent cells.</a> DNA Cell Biol. 22, 339-346 (2003).</li>
<li>Raptis, L., Vultur, A., Tomai, E., Brownell, H. L., Firth, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+electroporation+of+radioactive+nucleotides%3A+assessment+of+Ras+activity+and+32P-labelling+of+cellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+A+Laboratory+Handbook%2C+Celis%2C+Ed%22%5BJournal%5D)">In situ electroporation of radioactive nucleotides: assessment of Ras activity and 32P-labelling of cellular proteins.</a> Cell Biology A Laboratory Handbook, Celis, Ed. 43, 329-339 (2006).</li>
<li>Nakashima, N., Rose, D., Xiao, S., Egawa, K., Martin, S., Haruta, T., Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+role+of+crk+II+in+actin+cytoskeleton+organization+and+mitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The functional role of crk II in actin cytoskeleton organization and mitogenesis.</a> J Biol Chem. 274, 3001-3008 (1999).</li>
<li>Raptis, L., Firth, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+adherent+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of adherent cells in situ.</a> DNA Cell Biol. 9, 615-621 (1990).</li>
<li>Marais, R., Spooner, R. A., Stribbling, S. M., Light, Y., Martin, J., Springer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+surface+tethered+enzyme+improves+efficiency+in+gene-directed+enzyme+prodrug+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A cell surface tethered enzyme improves efficiency in gene-directed enzyme prodrug therapy.</a> Nat Biotechnol. 15, 1373-1377 (1997).</li>
<li>Nielsen, M. S., Nygaard, A. L., Sorgen, P. L., Verma, V., Delmar, M., Holstein-Rathlou, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Compr+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gap junctions.</a> Compr Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).</li>
<li>Geletu, M., Trotman-Grant, A., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mind+the+gap%3B+regulation+of+gap+junctional%2C+intercellular+communication+by+the+SRC+oncogene+product+and+its+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mind the gap; regulation of gap junctional, intercellular communication by the SRC oncogene product and its effectors.</a> Anticancer Res. 32 (10), 4245-4250 (2012).</li>
<li>Vinken, M., Vanhaecke, T., Papeleu, P., Snykers, S., Henkens, T., Rogiers, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexins+and+their+channels+in+cell+growth+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Connexins and their channels in cell growth and cell death.</a> Cell Signal. 18 (5), 592-600 (2006).</li>
<li>Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrape-loading+and+dye+transfer%3A+A+rapid+and+simple+technique+to+study+gap+junctional+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Scrape-loading and dye transfer: A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication.</a> Exp Cell Res. 168, 430-442 (1987).</li>
<li>Raptis, L., Brownell, H. L., Firth, K. L., MacKenzie, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+the+study+of+intercellular%2C+junctional+communication%3B+electroporation+of+adherent+cells+on+a+partly+conductive+slide%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+%26+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel technique for the study of intercellular, junctional communication; electroporation of adherent cells on a partly conductive slide.</a> DNA & Cell Biol. 13, 963-975 (1994).</li>
<li>Anagnostopoulou, A., Cao, J., Vultur, A., Firth, K. L., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+gap+junctional%2C+intercellular+communication+by+in+situ+electroporation+on+two+co-planar+indium-tin+oxide+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Examination of gap junctional, intercellular communication by in situ electroporation on two co-planar indium-tin oxide electrodes.</a> Mol Oncol. 1, 226-231 (2007).</li>
<li>Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, S., Campling, B. G., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+assay+for+intercellular%2C+junctional+communication+in+cultured+human+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">A functional assay for intercellular, junctional communication in cultured human lung carcinoma cells.</a> Lab Invest. 78, 639-640 (1998).</li>
<li>Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctional+communication+in+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gap junctional communication in lung carcinoma cells.</a> Lung Cancer. 23, 223-231 (1999).</li>
<li>Geletu, M., Chaize, C., Arulanandam, R., Vultur, A., Kowolik, C., Anagnostopoulou, A., Jove, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat3+activity+is+required+for+gap+junctional+permeability+in+normal+epithelial+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stat3 activity is required for gap junctional permeability in normal epithelial cells and fibroblasts.</a> DNA Cell Biol. 28, 319-327 (2009).</li>
<li>Geletu, M., Arulanandam, R., Greer, S., Trotman-Grant, A., Tomai, E., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat3+is+a+positive+regulator+of+gap+junctional+intercellular+communication+in+cultured%2C+human+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Stat3 is a positive regulator of gap junctional intercellular communication in cultured, human lung carcinoma cells.</a> BMC Cancer. 12, 605(2012).</li>
<li>Brownell, H. L., Narsimhan, R., Corbley, M. J., Mann, V. M., Whitfield, J. F., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras+is+involved+in+gap+junction+closure+in+mouse+fibroblasts+or+preadipocytes+but+not+in+differentiated+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+%26+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ras is involved in gap junction closure in mouse fibroblasts or preadipocytes but not in differentiated adipocytes.</a> DNA & Cell Biol. 15, 443-451 (1996).</li>
<li>Weber, P. A., Chang, H. C., Spaeth, K. E., Nitsche, J. M., Nicholson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+permeability+of+gap+junction+channels+to+probes+of+different+size+is+dependent+on+connexin+composition+and+permeant-pore+affinities%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The permeability of gap junction channels to probes of different size is dependent on connexin composition and permeant-pore affinities.</a> Biophys J. 87 (2), 958-973 (2004).</li>
<li>Graham, F. L., vander Eb, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+the+assay+of+infectivity+of+human+Adenovirus+5+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">A new technique for the assay of infectivity of human Adenovirus 5 DNA.</a> Virology. 52, 456-467 (1973).</li>
<li>Arulanandam, R., Vultur, A., Cao, J., Carefoot, E., Truesdell, P., Elliott, B., Larue, L., Feracci, H., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherin-cadherin+engagement+promotes+survival+via+Rac%2FCdc42+and+Stat3%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res+7%22%5BJournal%5D)">Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3.</a> Mol Cancer Res 7. , 1310-1327 (2009).</li>
<li>Williams, E. J., Dunican, D. J., Green, P. J., Howell, F. V., Derossi, D., Walsh, F. S., Doherty, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+growth+factor-stimulated+mitogenesis+by+a+cell-permeable+Grb2-binding+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of growth factor-stimulated mitogenesis by a cell-permeable Grb2-binding peptide.</a> J. Biol. Chem. 272, 22349-22354 (1997).</li>
<li>Raptis, L., Brownell, H. L., Vultur, A. M., Ross, G., Tremblay, E., Elliott, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+of+Growth+Factor-stimulated+ERK1%2F2+activation+in+intact+cells+by+electroporation+of+a+Grb2-SH2+binding+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition of Growth Factor-stimulated ERK1/2 activation in intact cells by electroporation of a Grb2-SH2 binding peptide.</a> Cell Growth Differ. 11, 293-303 (2000).</li>
<li>Meda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+the+molecular+permeability+of+connexin+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assaying the molecular permeability of connexin channels.</a> Methods Mol Biol. 154, 201-224 (2001).</li>
<li>Hofgaard, J. P., Mollerup, S., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+gap+junctional+intercellular+communication+based+on+digital+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantification of gap junctional intercellular communication based on digital image analysis.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 297 (2), R243-R247 (2009).</li>
<li>Raptis, L., Lamfrom, H., Benjamin, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cellular+phenotype+and+expression+of+polyomavirus+middle+T+antigen+in+rat+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of cellular phenotype and expression of polyomavirus middle T antigen in rat fibroblasts.</a> Mol Cell Biol. 5, 2476-2486 (1985).</li>
<li>Raptis, L., Marcellus, R. C., Whitfield, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+membrane-associated+protein+kinase+C+activity+correlates+to+tumorigenicity+but+not+anchorage-independence+in+a+clone+of+mouse+NIH+3T3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">High membrane-associated protein kinase C activity correlates to tumorigenicity but not anchorage-independence in a clone of mouse NIH 3T3 cells.</a> Exp Cell Res. 207, 152-154 (1993).</li>
<li>Vultur, A., Cao, J., Arulanandam, R., Turkson, J., Jove, R., Greer, P., Craig, A., Elliott, B. E., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+to+cell+adhesion+modulates+Stat3+activity+in+normal+and+breast+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells.</a> Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).</li>
<li>Vultur, A., Arulanandam, R., Turkson, J., Niu, G., Jove, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat3+is+required+for+full+neoplastic+transformation+by+the+Simian+Virus+40+Large+Tumor+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Stat3 is required for full neoplastic transformation by the Simian Virus 40 Large Tumor antigen.</a> Mol Biol Cell. 16, 3832-3846 (2005).</li>
</ol>

المؤلف المقابل هو المخترع في براءة اختراع تحتفظ بها جامعة كوينز ، والتي تم ترخيصها لشركة Cell Projects Inc. لم يكن للشركة أو الجامعة أي تأثير على محتويات الورقة.

الخطوات الحاسمة في البروتوكول المواد Electroporated نقاء المواد التي سيتم electroporated مهم جدا. إذا كانت الخلايا مسطحة جدا، ثم تركيزات أعلى من تتبع صبغة يجب استخدام (تصل إلى 20 ملغ / مل لLY) وفي مثل هذه الحالات، والنقاء هو أكثر أهمية مما كانت عليه في الخلايا مع شكل أكثر كروية 1. إلى جانب LY وقد استخدمت مجموعة كبيرة ومتنوعة من الأصباغ الأخرى أو الجزيئات nonpermeant، مثل سلسلة من ...

تطبيق التيار الكهربائي إلى خلية يسبب تشكيل المسام على غشاء الخلية، من خلال عملية تسمى Electroporation لل. مسام تسمح بمرور مجموعة متنوعة من الجزيئات nonpermeant من خلال الغشاء. يمكن التحكم في المجال الكهربائي على وجه التحديد، بحيث المسام شكلت صغيرة جدا وreclose بسرعة، مع الحد الأدنى من اضطراب في الفيزيولوجيا الخلوية. ومن المثير للاهتمام، الخلايا الملتصقة يمكن زراعتها على شريحة زجاجية مغطاة موصل وشفافة أكسيد الإنديوم والقصدير (ايتو) وelectroporated في الموقع، وهذا هو على السطح حيث تنمو، دون أن يتم فصل electroporated في تعليق. خلايا يمكن أن تنمو بشكل جيد جدا على هذا السطح، وبما أنها تابعة والموسعة، الملاحظة المجهرية مفصلة ممكن. باستخدام هذه التقنية، جزيئات صغيرة nonpermeant يمكن إدخال الفور وبشكل أساسي إلى 100٪ من الخلايا، مما يجعل هذه التقنية مناسبة خاصة بالنسبة للدراسات حول تفعيل شركاتonents من مسار التالية التحفيز يجند لمستقبلات (مراجعة في 1). وقد استخدم Electroporation للفي الغالب لإدخال الحمض النووي (وتسمى أيضا electrotransfection). ومع ذلك، يمكن Electroporation للفي الموقع أن تكون ذات قيمة لإدخال مجموعة كبيرة ومتنوعة من الجزيئات، مثل الببتيدات 2-4، أليغنوكليوتيد]، مثل العقاقير RNA، المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي [أليغنوكليوتيد شرك لمنع عامل النسخ ملزمة، أو سيرنا 3،5، 6، 7-10 النيوكليوتيدات المشعة، والبروتينات 11 12 أو الموالية للمخدرات 13. بعد Electroporation لل، والخلايا هي lysed يمكن للالتحليلات الكيميائية الحيوية أو ثابتة وملطخة الأجسام المضادة. طلاء ايتو موصل رقيقة جدا، 800-1،000Å، بحيث لا تشعر بالانزعاج نمو الخلايا بواسطة الفرق في ارتفاع السطوح اثنين، كما تنمو الخلايا عبر حافة طلاء موصل. وهذا يوفر ميزة أنه غير electrop-خلايا orated يمكن زراعتها جنبا إلى جنب مع تلك electroporated، لتكون بمثابة الضوابط. يمكن استخدام نفس النهج لفحص موصلي الفجوة والاتصال بين الخلايا (GJIC)، كما هو موضح في الفيديو. تقاطعات الفجوة هي القنوات التي تربط الداخلية من الخلايا المجاورة 14. الفجوة موصلي والاتصال بين الخلايا تلعب دورا هاما في تشكيل الورم والانبثاث، في حين أن الجينات المسرطنة مثل SRC قمع GJIC 15،16. لدراسة GJIC صبغة الفلورسنت مثل لوسيفر الأصفر (LY) غالبا ما أدخلت الخلايا المستزرعة من خلال حقن مكروي أو كشط التحميل 17 و لوحظ انتشار الصبغة في الخلايا المجاورة مجهريا تحت إضاءة مضان. لكن هذه التقنيات دائما يسبب تلف الخلايا. وصفنا الآن تقنية حيث تزرع الخلايا على شريحة زجاجية التي وهي مغلفة جزئيا مع ايتو 18. تم تطبيق نبضة كهربائية في وجود LY (أو الأصباغ الأخرى) كاليفورنياباستخدام انتشارها في الخلايا المتزايد من جانب موصل من الشريحة، في حين صبغ الهجرة إلى الخلايا المجاورة، غير electroporated، وقد لوحظ من خلال المجهر مضان الإضاءة. لتجنب الخلايا الحساسة المزعجة التي قد تميل إلى فصل من أحادي الطبقة، جمعية صمم التي لا تتطلب إلكترود لتوضع على رأس من الخلايا لتطبيق الحالي 19 الكهربائي. يقدم هذا النهج القدرة ل quantitate GJIC في عدد كبير من الخلايا، ودون أي اضطراب يمكن كشفها لالأيض الخلوي، كما يدل على ذلك عدم وجود تأثير على طول المرحلة G1 التالية التحفيز المصل 12، وزيادة في مستويات منظمات المزارعين البروتين protooncogene (Raptis، غير منشورة) أو اثنين تحركات المرتبطة بالإجهاد الخلوي، خنزير P38 أو JNK / SAPK كيناز 1. هذا النهج جعل من الممكن فحص الارتباط بين مستويات الجين الورمي التعبير والتحول وGJIC 18، فضلا عن تأثير SRC وSTAT3 على GJIC في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، بما فيها الخلايا المستزرعة حديثا من عينات ورم الرئة 20-23. بالإضافة إلى ذلك، Electroporation للالموقعي مع الإعداد الذي وصفه تفتقر إلى القطب العلوي واستخدمت بنجاح لمظاهرة من إغلاق الفجوة تقاطع على التمايز adipocytic، على الرغم من التعلق الخلوي إلى الركيزة يتم تخفيض في تلك المرحلة في 19،24.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro http://www.cellgro.com/</td> <td>50-013-PB</td><td></td></tr><tr><td>DMEM بدون هيكلون الكالسيوم</td><td>(علمي حراري: http://www.thermoscientific.com)</td><td>SH30319-01</td><td></td></tr><tr><td>مصل العجل المتبرع &nbsp;</td><td>PAA: http://www.paa.com/</td> <td>Cat. # B15-008</td><td></td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنيني</td><td>PAA: http://www.paa.com/</td> <td>Cat. # A15-751</td><td></td></tr><tr><td>جهاز التثقيب الكهربائي</td><td>Cell Projects Ltd المملكة المتحدة: http://www.cellprojects.com/</td> <td>ACE-100</td><td></td></tr><tr><td>Chambers</td><td>Cell Projects Ltd المملكة المتحدة</td><td>ACE-04-CC</td><td>4-wells</td></tr><tr><td>Chambers</td><td>Cell Projects Ltd المملكة المتحدة</td><td>ACE-08-CC</td><td>8-wells</td></tr><tr><td>لوسيفر مشاريع الخلايا الصفراء</td><td>المحدودة المملكة المتحدة</td><td>ACE-25-LY</td><td>عالية النقاء</td></tr><tr><td>CelTak</td><td>BD Biosciences</td><td>354240</td><td>لاصق الخلايا والأنسجة</td></tr><tr><td>فيبرونيكتين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>كولاجين</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>بولي ليسين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>P8920</td><td></td></tr></tbody></table>

مقايسة الوظيفية للفجوة صلي فحص. electroporation للمن الخلايا الملتصقة على الإنديوم أكسيد القصدير

A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

في هذه التقنية ، يتم زراعة الخلايا على شريحة زجاجية مغلفة جزئيا بأكسيد الإنديوم والقصدير (ITO) ، وهي مادة شفافة موصلة للكهرباء. يمكن إدخال مجموعة متنوعة من الجزيئات ، مثل الببتيدات أو قليل النوكليوتيدات بشكل أساسي في 100٪ من الخلايا بطريقة غير مؤلمة. هنا ، نصف كيف يمكن استخدامه لدراسة الاتصال الوصلي بين الخلايا والفجوة. يخترق اللون الأصفر لوسيفر الخلايا عندما تتسبب نبضة كهربائية ، يتم تطبيقها على السطح الموصل الذي تنمو عليه ، في تكوين المسام من خلال غشاء الخلية. هذا هو التثقيب الكهربائي. الخلايا التي تنمو على سطح الزجاج غير الموصل المجاور مباشرة للمنطقة المثقبة بالكهرباء لا تمتص اللون الأصفر لوسيفر عن طريق التثقيب الكهربائي ولكنها تكتسب صبغة الفلورسنت أثناء تمريرها إليها عبر تقاطعات الفجوة التي تربطها بالخلايا الكهربائية. يمكن ملاحظة نتائج نقل الصبغة من خلية إلى أخرى مجهريا تحت إضاءة الفلورة. تسمح هذه التقنية بالقياس الكمي الدقيق للاتصال الوصلي الفجوة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدامه لإدخال الببتيدات أو الجزيئات الأخرى غير المنفردة ، كما أن نقل الببتيدات الصغيرة المكهربة عبر تقاطعات الفجوة لتثبيط الإشارة في الخلايا المجاورة غير المثقبة بالكهرباء هو دليل قوي على تثبيط الإشارة.

ويبين الشكل 2 كبد الفئران خلايا الظهارية T51B 22، electroporated مع LY وتصويرها تحت مضان (لوحة A و B)، أو على النقيض من المرحلة (C) الإضاءة، وبعد التثبيت والغسيل. في لوحة A، يتم وضع علامة على حافة منطقة الجزاء electroporated باللون الأحمر. التدرج من مضان على يمين الخط الأحمر يدل نقل من خلال تقاطعات الفجوة. في الشكل 3A و 3B، يظهر الكميات التواصل الفجوة موصلي: تم تحديد الخلايا عند حافة المنطقة electroporated ووضع علامة مع...

يوضح هذا العرض التقديمي طريقة يتم من خلالها استخدام التثقيب الكهربائي للخلايا الملتصقة والمزروعة لدراسة الاتصال بين الخلايا والوصلات ، بينما تنمو الخلايا على شريحة مغلفة بأكسيد القصدير الإنديوم الموصل والشفاف.

مقايسة الوظيفية للفجوة صلي فحص. Electroporation للمن الخلايا الملتصقة على الإنديوم أكسيد القصدير

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. ...

التثقيب الكهربائي هو تقنية يتم فيها تطبيق تيار كهربائي على خلايا حية من أجل فتح مسام مؤقتة في غشاء الخلية. ومن خلال هذه المسام، يمكن للأصباغ والجزيئات الأخرى التي لا تعبر غشاء الخلية في الحالة العادية أن تدخل إلى الخلية، ثم تغلق هذه المسام بسرعة دون إلحاق ضرر بالخلية. سنقوم بشرح كيفية إجراء التثقيب الكهربائي للخلايا الملتصقة أثناء نموها على شريحة مغطاة جزئياً بمادة شفافة وموصلة للكهرباء.المادة المستخدمة هي أكسيد indium tin oxide، ونظراً لقدرتها على توصيل التيار الكهربائي، فإنها تفتح مساماً تسمح للصبغة بالدخول إلى الخلية. ومن ثم يصبح من الممكن فحص ما إذا كانت الخلايا تحتوي على فجوات اتصالية أم لا، وعدد هذه الفجوات الاتصالية التي تمثل قنوات صغيرة تربط الأجزاء الداخلية للخلايا المتجاورة وتسمح بمرور الجزيئات الصغيرة. ومن المعروف منذ فترة طويلة أن التواصل عبر الفجوات الاتصالية يؤدي مجموعة متنوعة من الوظائف المهمة في الخلية، بما في ذلك التحول الورمي والانتقال السرطاني.أهلاً بكم في هذا العرض التقديمي حول مشاريع الخلايا، والذي يتناول كيفية إجراء عملية التثقيب الكهربائي للخلايا الملتصقة باستخدام جهاز Insitu. تُظهر هذه الصورة، وهو ما سنتمكن من تحقيقه، إدخال صبغة فلورية صفراء في خلايا تنمو على زجاج شفاف وموصل. وصولاً إلى هذا الخط، حيث يسهل رؤية الخط تحت مجهر تباين الأطوار.إليك النتيجة. يمكنك أن ترى أن الصبغة قد انتشرت عبر الوصلات الفجوية من الخلايا الموجودة على اليسار، والتي تم تحميلها بالصبغة عن طريق التثقيب الكهربائي، إلى الخلايا الموجودة على اليمين. مما أدى إلى هذا التدرج في تألق الخلايا.يتم تحضيرها ثم نقلها إلى أنبوب في جهاز الطرد المركزي. من المهم جداً أن تكون الخلايا موزعة بشكل جيد أثناء نموها في الغرفة. لهذا السبب، يفضل إجراء عملية الطرد المركزي للخلايا لإزالة أي آثار للـ trypsin.يتم سحب الوسط الذي يحتوي على آثار من التربسين، ثم يُعاد تعليق الخلايا في حوالي واحد ملي لتر من وسط النمو، وبعد ذلك تُوضع في الغرفة. تحتوي الماصة على معلق الخلايا؛ لذا يتم إزالة الغطاء عن الغرفة وسحب الخلايا بواسطة الماصة وإضافتها قطرة بقطرة إلى الغرفة لتسهيل عملية نقلها. تُوضع الغرفة في طبق بتري بقطر ستة سنتيمتر.تُعاد الحجرة إلى الحاضنة لنمو الخلايا. ستنتشر الخلايا المزرعة بشكل جيد وتنمو حتى تلامس بعضها البعض وتُشكل وصلات فجوية. عندما تصبح الخلايا جاهزة لإجراء عملية الترحيل الكهربائي، يتم ضبط مولد النبضات الموضعي (insitu pulse generator) وفقاً للشروط المطلوبة.يرجى الرجوع إلى الدليل للحصول على وصف لعملية الإعداد البسيطة. عند ضبط الجهد الكهربائي في جهاز insitu، سيضيء الضوء الأحمر في لوحة المفاتيح. أخرج زجاجتي DMEM الخاليتين من الكالسيوم والمدفأتین من الحمام المائي؛ إحداهما تحتوي على DMEM خالية من الكالسيوم ولكن مع مصل منقى بالديال، والأخرى تحتوي على DMEM.في غياب الكالسيوم، قم بتجهيز الماصات وتحميل المحلول الأصفر في الماصة الآلية. بدلاً من التنهد، أخرج الخلايا من الحاضنة. قم بإزالة الوسط عن طريق قلبه في بيكر الغسيل في البداية.ثم يتم تجفيفها برفق على منديل ورقي، وغسلها مرة واحدة باستخدام DMEM خالي من الكالسيوم؛ ولا تحاول إزالة كل كمية DMEM تماماً لأن الخلايا قد تجف. أضف Lucifer yellow بعناية فوق الحاجز (Barrier) بحيث لا تضطرب الخلايا، ولكن بسرعة كافية لضمان عدم جفاف الخلايا. استخدم 200 µL لكل نصف من الغرفة.ضع الغطاء على حجرة التثبيت في الموقع (insitu chamber)، ثم قم بتحميلها في المنزلق. تأكد من استقرار ألسنة نهاية الحجرة في فتحات المنزلق عن طريق دفع المنزلق. أدخل الحجرة في حامل الحجرة.اضغط على زر النبض (pulse) في لوحة مفاتيح مولد النبضات. سيومض مؤشر LED الموجود على مولد النبضات وعلى حامل الغرفة باللون الأحمر أثناء عملية التثقيب الكهربائي، ثم يومض باللون الأخضر للإشارة إلى اكتمال دورة البدء. اسحب المنزلق للخلف أسفل حامل الغرفة ثم قم بإزالة الغرفة.قم بشفط معظم صبغة Lucifer yellow لإعادة استخدامها، مع الحرص على عدم تجفيف الخلايا. أضف وسط DMEM الخالي من الكالسيوم. ومع استخدام المصل الميُسر، يساعد المصل في إغلاق المسام لتعود الغرفة إلى الحاضنة لكي يتم انتقال Lucifer yellow عبر الفجوات التواصلية.يجب أن يكون التوقيت متسقاً من تجربة إلى أخرى. المعيار هو ثلاث دقائق. صب الوسط في الكأس المخصص للنفايات.أضف محلول التثبيت فورمالديهايد بتركيز 4% باستخدام معجون أو ماصة، وانتظر في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين على الأقل. صب الفورمالديهايد واشطف عدة مرات باستخدام PBS؛ حيث تكون الخلايا مثبتة على الزجاج، لذا فإن خطر انفصالها أثناء الغسيل ضئيل.لكي يتمكن الباحث من رؤية الخلايا باستخدام تباين الأطوار، من المهم وضع شريحة غطاء فوق الحجرة. املأ الحجرة بمحلول PBS بحيث يتشكل سطح مقعر محدب. ضع شريحة الغطاء مع تجنب تكون فقاعات الهواء.لا تقلق إذا فاض محلول PBS، فقط قم بامتصاص الكمية الزائدة من PBS باستخدام منديل ورقي. ستحتاج إلى مجهر فلوري مقلوب، ويفضل أن يكون مزوداً بتباين طوري ووحدة تصفية لـ Lucifer yellow. ابحث عن حافة المنطقة التي خضعت للتثقيب الكهربائي تحت وضع التباين الطوري.ستلاحظ وجود خطين تحت الخلايا الفلورية. حيث سيظهر نصف الشريحة بفلورة شديدة. والخط الأقرب إلى الخلايا المتوهجة هو حافة المنطقة التي تعرضت للتثقيب الكهربائي.وأي فلورة تتجاوز ذلك تعود إلى انتقال صبغة Lucifer yellow عبر الموصلات الفجوية. فعلى سبيل المثال، تُظهر هذه الصورة لخلايا ظهارية خلايا خضعت للتثقيب الكهربائي على الجانب الأيسر من الصورة، حيث تنقل Lucifer yellow إلى الخلايا المجاورة غير المثقبة كهربائيًا، مما يؤدي إلى تكوين تدرج من الخلايا المتوهجة من حافة الطلاء الموصل باتجاه اليمين. وتُظهر هذه الصورة الإطار ذاته من الخلايا تحت تباين الطور.لاحظ أنه يمكنك رؤية الخط X بوضوح شديد. يمكن إجراء قياس كمي لمقدار الانتقال عبر الموصلات الفجوية يدوياً من خلال العمل على الصور الفلورية وصور تباين الطور للخلايا التي خضعت للتثقيب الكهربائي. وتُعتبر النجوم الموجودة على طول حافة المنطقة الموصلة خلايا مانحة.تم إجراء عملية التثقيب الكهربائي لها، وامتصت بروتين luc باللون الأصفر. وهي تنقل luc الأصفر إلى الخلايا المجاورة جهة اليمين، والتي تقوم بدورها بنقله. ويستمر ذلك لمسافات أبعد بكميات متناقصة.يمكن أن تؤدي نسبة النقاط إلى النجوم، وهي 41 إلى ثمانية في هذه الحالة، إلى استخراج قيمة لمقارنة مدى اتساع انتقال الوصلات الفجوية في هذه الحالة. تبلغ قيمة مؤشر الوصلات الفجوية 5.1. وبديلاً عن تحديد الخلايا وعدّها يدوياً، يمكن استخدام برنامج لتحليل الصور لقياس الكميات النسبية للتوهج على الجانب غير المختار من حدود خلية خضعت للتثقيب الكهربائي.لا تمتلك هذه الخلايا روابط فجوية. هنا تظهر الحافة اليمنى للمنطقة التي خضعت للتثقيب الكهربائي. لاحظ عدم وجود تدرج في الفلورة، مما يشير إلى غياب الروابط الفجوية تحت مجهر تباين الأطوار.يمكنك رؤية جميع الخلايا بوضوح. لاحظ أن الخط X مرئي بوضوح أيضاً في هذا المثال.تم تحفيز جميع الخلايا في الحجرة باستخدام عامل نمو البشرة EGF، وبعد مرور 10 دقائق تم تثبيتها وفحصها للكشف عن phospho arc. لاحظ أن الخلايا المصبوغة على اليمين لم يتم تعريضها للتثقيب الكهربائي، بينما الخلايا على اليسار وصولاً إلى هذا الخط قد خضعت للتثقيب الكهربائي. تظهر الخلايا غير المثقبة كهربائياً تصبغاً بنياً باستخدام جسم مضاد لـ phospho irk والبيروكسيداز المناعي.لا تظهر الخلايا التي خضعت للتثقيب الكهربائي أي صبغ، حيث قام الببتيد الفسفوري الذي تم إدخاله عبر التثقيب الكهربائي بحجب نطاق SSH two لبروتين grab two وتثبيط فسفرة irk لـ EGF. لاحظ المنطقة التي يبلغ طولها من ثلاث إلى أربع خلايا إلى يمين الخط، حيث لا تظهر الخلايا التي لم يتم تثقيبها كهربائياً أي صبغ. هذه هي الخلايا التي اكتسبت الببتيد الحاجب من جيرانها الذين خضعوا للتثقيب الكهربائي عبر الموصلات الفجوية.هذا هو أقوى برهان ممكن على أن تثبيط الإشارة يجب أن يكون ناتجاً عن الببتيد ولا يمكن أن يكون أثراً جانبياً لعملية التثقيب الكهربائي. وبما أن هذه الخلايا لم تخضع للتثقيب الكهربائي، فإن هذا هو الإطار ذاته الذي ظهر تحت تباين الطور. لاحظ عدم وجود أي تغيير في المورفولوجيا بعد التثقيب الكهربائي.يمكن قياس التواصل عبر الموصلات الفجوية بدقة كمية في مجموعة كبيرة ومتنوعة من الخلايا المستزرعة. ويعد إدخال الببتيدات لتعطيل مسارات تأشير محددة نهجاً قوياً لتقييم أهمية التفاعلات البروتينية-البروتينية التي تم تحديدها باستخدام بروتينات منقاة في الخلايا الحية. ويمكن أن تكون هذه هي الخطوة الأولى والمهمة في تطوير الأدوية الببتيدية.

a-functional-assay-for-gap-junctional-examination-electroporation

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

سوف نقوم شرح كيفية دراسة تأثير طفرة نقطة واحدة على وظيفة قناة أيون.

الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات

طريقة موثوقة ذات كفاءة...

الاستراتيجية الأمثل للتعبير وترنسفكأيشن تسجيل الكهربية المؤتلف من القنوات ايون الجهد بوابات - 293T كلوة الجنين البشري في خلايا

يوصف لفحص لقياس التردد التصاق حركية التفاعل مستقبلات يجند عندما ترسو على حد سواء الجزيئات على أسطح الخلايا المتفاعلة. ويتمثل هذا الاختبار القائم على ميكانيكيا باستخدام micropipette مضغوطة الإنسان خلايا الدم الحمراء وأجهزة الاستشعار والتصاق αLβ2 إنتغرين وبين الخلايا جزيء التصاق - 1 والتفاعل ومستقبلات يغاندس.

التصاق الفحص عن التردد في الموقع تحليل حركية عبر صلي التفاعلات الجزيئية في خلية واجهة سيل

نحن هنا وصف كيفية إجراء حقن مكروي وحيدة الخلية لوسيفر الأصفر لتصور الاتصالات الخلوية عبر الفجوة تقاطعات في الخلايا الحية، وتقديم بعض النصائح المفيدة. ونحن نتوقع أن هذه الورقة سوف تساعد الجميع لتقييم درجة اقتران الخلوية بسبب تقاطعات الفجوة الوظيفية. كل شيء الموصوفة هنا يمكن أن يكون، من حيث المبدأ، وتكييفها لالأصباغ الفلورية الأخرى مع الوزن الجزيئي أقل من 1000 دالتون.

حقن مكروي وحيدة الخلية لتحليل الاتصالات خلية

يستعرض هذا البروتوكول الكهربائية الخلوي الركيزة مقاومة الاستشعار، وهي طريقة لتسجيل وتحليل الطيف مقاومة من الخلايا الملتصقة لتقدير حجم مرفق الخلية، والانتشار، حركية، والاستجابات الخلوية للمؤثرات الدوائية والسمية. وأكد الكشف عن نفاذية البطانية وتقييم خلية خلية وخلية الركيزة الاتصالات.

الكهربائية الخلوي الركيزة مقاومة استشعار لتقدير حجم انتشار غشائي، الحاجز وظيفة، والحركة

يصف هذا البروتوكول مشرط التحميل الفلورسنت صبغة تقنية نقل الذي يقيس الاتصالات بين الخلايا من خلال القنوات الفجوة تقاطع. فجوة الاتصال بين الخلايا وصلي هو عملية الخلوية الرئيسية التي يتم من خلالها الحفاظ على توازن الأنسجة وتعطيل هذه الإشارات الخلوية له تأثيرات صحية سلبية.

الفجوة صلي بين الخلايا الاتصالات: العلامات البيولوجية الوظيفية لتقييم التأثيرات السلبية للالسميات والسموم، والصحة فوائد المنتجات الطبيعية

&lt; p class = 'jove_content'&gt; قمنا بتكييف غشاء صغير يسهل اختراقه لتقليد البيئة المكروية للورم (TME). يتكون النموذج من ثقافة خلايا مختلطة ، ويسمح بتوليد مبسط لمجموعات الخلايا الفردية عالية الإثراء دون استخدام علامات الفلورسنت أو فرز الخلايا ، ويسمح بدراسة الاتصال بين الخلايا داخل TME في ظل الظروف العادية أو الإجهاد.

وتقليد من المكروية ورم: طريقة بسيطة لتوليد بالسكان خلية المخصب والتحقيق بين الخلايا الاتصالات

نقدم هنا، بروتوكولا مقايسة اتصالات بين الخلايا مفرق فجوة رواية المصممة للفرز الفائق الفجوة تقاطع تحوير المواد الكيميائية لاكتشاف المخدرات وتقييم السمية.

مقايسة اتصالات بين الخلايا مفرق الأصفر يوديد فلورسنت بروتين-الفجوة

الظهارة المعوية لا تمنح امتصاص العناصر الغذائية فحسب ، بل الحماية من المواد الضارة. ينظم التقاطع بين الخلايا القمي الأكثر ظهارة ، أي التقاطع الضيق ، المذاب شبه الخلوي ونفاذية الأيونات. هنا ، يتم وصف بروتوكول لإعداد صفائح الغشاء المخاطي وتقييم انتقائية الأيونات للتقاطعات الضيقة باستخدام تقنية غرفة Ussing.

التقييم الوظيفي لحاجز الوصلة الضيق المعوي ونفاذية الأيونات في الأنسجة الأصلية باستخدام تقنية الغرفة

نقدم هنا بروتوكولا للتعبير عن بروتينات تقاطع الفجوة في بويضات Xenopus وتسجيل تيار التقاطع بين بويضتين محددتين باستخدام مكبر صوت تجاري مصمم لتسجيل مشبك جهد البويضة المزدوج في وضع قياس التيار الجانبي العالي.

تسجيل فجوة تقاطع التيار من البويضات Xenopus

أزواج التثقيب الكهربائي للركيزة المسامية (PSEP) توصيل متسق وعالي الإنتاجية مع قابلية عالية للخلية. يوفر إدخال قياسات المعاوقة الكهربائية عبر الظهارة (TEEI) نظرة ثاقبة للعمليات الوسيطة ل PSEP ويسمح بالتسليم بدون ملصقات. تتناول هذه المقالة طريقة لإجراء تجارب تسليم PSEP وتحليل قياس TEEI في وقت واحد.

التثقيب الكهربائي القائم على الركيزة المسامية مع مراقبة المعاوقة الكهربائية عبر الظهارة

تعلم تقنية الكهربائية للخلايا الملتصقة لدراسة الاتصال بين الخلايا عبر الفجوات الصلي باستخدام أكسيد الإنديوم والقصدير الشفاف الموصل. هذه الطريقة تتيح تقييم وظيفة الفجوات الصلي في الخلايا الحية بدقة.

مقايسة الوظيفية للفجوة صلي فحص. Electroporation للمن الخلايا الملتصقة على الإنديوم أكسيد القصدير

استكشف المزيد من الفيديوهات