متوسط ​​الفيروسية مغلف جلايكوبروتين المسامير من الكترون Cryotomography إعادة بناء باستخدام Jsubtomo

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة هياكل معقدات البروتينات السكرية الموجودة على أسطح الفيروسات الغشائية. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحديد مواقع الجسيمات الفيروسية في الأحجام التصويرية المقطعية التي تم حسابها مسبقاً من بيانات المجهر الإلكتروني المبرد. والخطوة الثانية هي إنشاء نموذجين أوليين مستقلين إحصائياً لمعقدات البروتينات السكرية باستخدام مجموعة فرعية محددة يدوياً من البيانات.

بعد ذلك، يتم تحسين هذه النماذج ثم استخدامها للكشف تلقائيًا عن جميع معقدات البروتينات السكرية على جزيئات الفيروس. وتتمثل الخطوة النهائية في تحسين بنية معقد البروتينات السكرية باستخدام مجموعة البيانات الكاملة. وفي النهاية، تُستخدم أدوات التصور الجزيئي لتفسير البنية النهائية.

يُعد التحليل البنيوي ثلاثي الأبعاد لهذه المسامير البروتينية السكرية ذا قيمة لا تقدر بثمن لفهم الإمراض الفيروسي وكذلك في تصميم الأدوية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل علم البلورات بالأشعة السينية، في أنها تسمح بتحديد البنى البروتينية لبروتينات الغشاء في بيئة الغشاء الطبيعية. ويمكن لهذه التقنية أن تساعد في معالجة موضوعات رئيسية في البيولوجيا البنيوية.

على سبيل المثال، بنية العديد من الفيروسات التي تحتوي على غشاء. وعلى الرغم من أن هذه التقنية يمكن أن توفر رؤية متعمقة حول معقدات البروتينات السكرية في هذه الفيروسات، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى مثل البروتينات الغشائية المدمجة في الليبوزومات. سيقوم عضوان من مجموعتي، سلي وديفيد بيتل، بتوضيح هذا الإجراء.

للبدء، افتح ملف التصوير الذاتي (autogram) في برنامج B show. قم باختيار الجسيمات الفيروسية يدويًا في الصور من خلال تحديد الإحداثي المركزي للجسيم الفيروسي باستخدام أداة اختيار الجسيمات. كرر هذه الخطوة حتى يتم معالجة جميع المتغيرات.

احفظ إحداثيات الفيروس في ملف star. استمر في تكرار هذه العملية لجميع الصور المقطعية (tomos). قم بعد ذلك بتشغيل J sub tomo py في وضع الاستخراج. لاستخراج الحجوم الفرعية المتباينة إلى ملفات حجم فردية، استخدم ملفات star المحفوظة كملفات إدخال لإنشاء نموذجين أوليين مستقلين.

أولاً، افتح ملف خريطة الحجم الفرعي للمبيض. اعرضه في B. اختر مجموعة فرعية من المسامير (spikes) في الأحجام الفرعية لـ Varian عن طريق تحديد إحداثية مركز المسمار باستخدام أداة اختيار الجسيمات المتاحة عبر نافذة صندوق الأدوات.

كرر هذه الخطوة حتى تتم معالجة جميع المسامير المتميزة بوضوح. احفظ إحداثيات المسامير في ملف star. كرر هذه الخطوة حتى تتم معالجة ما يقرب من 200 مسمار من البروتينات السكرية.

بعد تعيين طرق العرض (views) للمتغيرات كما هو موضح في البروتوكول النصي، قم بإنشاء قناع للفضاء الحقيقي باستخدام J sub tomo. Create mask py. ثم قم بتوليد قناع للفضاء المتبادل باستخدام J sub tomo create wedge mask py.

يُستخدم قناع الفضاء المتبادل (reciprocal space mask) لاستبعاد المناطق الواقعة ضمن منطقة الوتد المفقود (missing wedge region)، الناتجة عن جمع البيانات التصويرية المقطعية أحادية المحور. بعد ذلك، قم بإنشاء متوسطين أوليين باستخدام J.Sub tomo create averages. PY، مع استخدام ملف اختيار محفوظ كملف إدخال.

استخدم عملية الـ ization لتقليل الضوضاء في المتوسطات الأولية عبر محاذاة وتوسيط النموذجين اللذين تم إنشاؤهما سابقاً بشكل تكراري باستخدام J sub tomo iterate gold PY. يمكن العثور على تفاصيل كلا المرحلتين من هذه العملية في البروتوكول النصي. قم بتقييم درجة التماثل في البنية من خلال فحص ملف الخريطة الناتج عن تصفية الترددات المنخفضة (low-pass filtered map file) في kyira. على سبيل المثال، إذا كان البروتين الشوكي (spike) عبارة عن معقد ثلاثي القسيمات (trimeric complex)، فيجب أن يكون التماثل الثلاثي واضحاً.

استمر في تحسين البنية وفقًا لما هو مفصل في البروتوكول النصي. بعد ذلك، قم بتوليد بذور موزعة بالتساوي على سطح Varian للمطابقة مع القالب، وخصص متجه رؤية أولي للبذور عن طريق تشغيل JVs py. استخدم ملفات star التي تم إنشاؤها مسبقاً كملفات إدخال لتوليد بذور تزيد بنسبة 1.5 مرة تقريباً عن العدد المتوقع للمسامير (spikes).

يقرب متجه الرؤية هذا اتجاه البروتين الشوكي الأقرب إلى كل نقطة بذر. بعد ذلك، قم بإنشاء متوسطين مستقلين لسطح الفيروس كما سبق. ثم قم بتحسين موضع البذور وفقًا لما هو مفصل في البروتوكول النصي.

أخيراً، قم بتوليد ملفات علامات com لملفات seed star المنقحة باستخدام jvs.py. افحص البذور عن طريق فتح ملفات CMM وملفات خريطة virion المرتبطة بها. في kyira.

تأكد من محاذاة البذور المكررة بشكل صحيح بالنسبة لغشاء الفيروس. يمكن تلوين العلامات المكررة بناءً على معاملات الارتباط المتقاطع الخاصة بها. قم بتحديد جميع الأشواك في الأحجام الفرعية من المتغيرات تلقائيًا باستخدام مطابقة القوالب المحلية حول البذور المكررة، ثم قم بمحاذاة وتوسط الأشواك المحددة. استخدم المتوسطات الناتجة عن مجموعة فرعية من الأشواك المختارة يدويًا كقوالب أولية. يمكن العثور على تفاصيل إضافية لهذه العملية في نص البروتوكول. ولتصوير النتائج، افتح البنية المكررة للشوك في برنامج kyira للمعاينة البصرية.

باشر بملاءمة البنى الذرية. ثم أنشئ نموذجاً مركباً للجسيم الفيروسي باستخدام j Subo Create model DO py. وأخيراً، افتح النموذج المركب للتصور في kyira.

تم تحسين النموذج الأولي باستخدام 205 شوكة تم اختيارها يدويًا. كان التماثل ثلاثي الطيات للشوكة المركزية واضحًا دون تطبيق أي تماثل، وقد تم فرضه في جولات التحسين اللاحقة للكشف عن جميع الشوكات يدويًا على أسطح Varian. تم إنشاء 106 بذرة لكل vion عند نصف قطر قدره 43 nanometers وتباعد قدره 20 degrees، وتم تحسين مواقعها بشكل تكراري بالنسبة للغشاء.

استُخدمت رقع البروتين السكري الشوكي الأكثر ارتباطاً لحساب المتوسط النهائي. وتم تحليل المتوسط بدقة 35 angstrom. وقد كشف ذلك عن بنية شوكية ثلاثية في المنتصف، بالإضافة إلى مساهمة بعض الأشواك الستة المجاورة.

كشفت النماذج المركبة للـ varis، والتي تم حسابها عن طريق وضع البنية في المواضع المعروفة، عن توزيع المسامير على سطح Varian. وفي بعض الأحيان، كانت هناك رقع منظمة محلياً من المسامير واضحة. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم استخدام أفضل البيانات فقط ومراجعة جميع النتائج المتوسطة بدقة.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تركيب بنيات حيود الأشعة السينية (x-ray crystallography) ضمن المتوسط النهائي للحصول على رؤية أكثر دقة للتفاعلات بين البروتينات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية حساب متوسط بنيات البروتينات السكرية للغلاف الفيروسي باستخدام برنامج J Omo.