تنقية الحمض النووي تقارب رقاقة (DAP رقاقة) طريقة لتحديد الأهداف الجيني للبكتيريا نظامان التنظيمية المكون

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد مواقع الارتباط الجينومي لمنظمات الاستجابة ثنائية المكونات البكتيرية باستخدام مقايسة تعتمد على المصفوفات الدقيقة في المختبر. ويتحقق ذلك من خلال استنساخ وتنقية بروتين منظم استجابة مُوسوم، وتنشيطه عن طريق الفسفرة في المختبر، وتحديد هدف جيني واحد باستخدام مقايسات إزاحة الحركية الكهربائية لاستخدامه كضابط موجب لخطوات المصفوفات الدقيقة اللاحقة. وفي خطوة ثانية، يتم خلط بروتين منظم الاستجابة المنقى مع DNA الجينومي، مما يسمح بفصل DNA المرتبط بالبروتين عن DNA المدخل باستخدام التنقية التقاربية.

بعد ذلك، يتم تضخيم الحمض النووي المرتبط بالبروتين والحمض النووي المدخل، والتحقق منهما بواسطة QPCR للتأكد من إثراء الجين المستهدف للضابط الموجب في الجزء المرتبط بالبروتين، ثم يتم وسمهما فلورياً، وتجميعهما وتهجينهما باستخدام مصفوفة دقيقة مبلطة (tiling microarray). ومن أجل تحديد مواقع الارتباط الجينومية لمنظم الاستجابة، تظهر النتائج الجينات الأكثر احتمالاً لأن يتم تنظيمها بواسطة منظم الاستجابة قيد الدراسة، ويمكن التحقق من النتائج بشكل أكبر باستخدام مقايسات إزاحة الحركية الكهربائية (electrophoretic mobility shift assays). وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الأخرى مثل in vivo chip chip، في إمكانية استخدامها حتى لو كانت إشارات التنشيط والظروف غير معروفة لأنظمة المكونين.

تكتسب هذه الطريقة أهمية كبيرة في مجال الإشارات البكتيرية، حيث إن الغالبية العظمى من منظمات الاستجابة لها أهداف جينية غير معروفة، وتساعد هذه الطريقة في كشف الشبكات التنظيمية المعقدة. ستقوم إيمي تشن، وهي مساعدة باحث من مختبري، بتوضيح هذا الإجراء قبل البدء في تنفيذه.

قم بتنقية rr، وتحديداً بروتين DVU 3 0 2 3 المُعبَّر عنه من مزيج جينات DVU 3 0 2 3 المستنسخة. أضف 0.5 picomoles من بروتين DVU 3 0 2 3 مع 100 fent moles من ركيزة DNA المفسفرة المُحضرة مسبقاً بواسطة at في محلول منظم ليصل الحجم الإجمالي إلى 20 microliters. بعد إعداد تفاعل بدون أي بروتين كعينة ضابطة، قم بتحضين التفاعلات في درجة حرارة الغرفة على طاولة المختبر لمدة 20 دقيقة.

بعد فترة التحضين، أضف 5 µL من محلول تحميل (loading buffer) بتركيز 5x إلى تفاعلات الربط. قم بتحميل 18 µL من كل تفاعل على هلام بولي أكريلاميد (poly acrylamide) بتركيز 6% من نوع mini تم تحضيره مسبقاً في محلول 0.5 XTBE، وقم بتشغيله بجهد 100 فولت لمدة ساعتين. بعد انتهاء تشغيل الهلام، قص غشاء نايلون مشحوناً بحجم الهلام وانقعه في محلول 0.5 XTBE لمدة 10 دقائق على الأقل. ثم أخرج الهلام من الكاسيت.

قم بقص أي حواف بارزة من الهلام، ثم ضع الهلام والغشاء بين ورقتي ترشيح سميكتين مغمورتين في 0.5 XTBE. ضع الهلام والغشاء داخل جهاز لطخة نصف جافة (semi-dry blotting apparatus) وقم بتشغيله بجهد 20 فولت لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، ضع الغشاء داخل جهاز ربط متصالب بالأشعة فوق البنفسجية (UV light crosslinker) واضبط الوقت على ثلاث دقائق بعد تحميض اللطخة باستخدام مجموعة كشف بالتلألؤ الكيميائي (chemiluminescent detection kit)، ثم قم بتصويرها باستخدام جهاز كمبيوتر متصل بكاميرا مجهزة بمستشعر CCD.

ابحث عن إزاحة في حركية ركيزة DNA في وجود rr، وهو ما يشير إلى أن RR يرتبط بـ DNA الذي يتم اختباره. بعد ذلك، اخلط من اثنين إلى ثلاثة ميكروغرام من genomic DNA المشترك مع 0.5 بيكومول من DVU 3 0 2 3 في محلول منظم. وبعد تحضين التفاعل عند 25 °C لمدة 30 دقيقة، انقل 10 µL منه إلى أنبوب سعة 1.5 mL وقم بتمييزه على أنه input DNA.

أضف 30 µL من راتنج nickel NTA aros إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.6 mL. قم بطرد العينة مركزياً عند 100 ×g لمدة دقيقة واحدة لتجميع الراتنج في قاع الأنبوب بعد عملية الطرد المركزي. قم بإزالة الطافي عند هذه النقطة.

أضف 100 µL من محلول الغسيل المنظم وقم بنقر الأنبوب لخلط المحتويات. بعد الطرد المركزي، أضف 100 Gs لمدة دقيقتين ثم تخلص من السائل الطافي. أضف الـ 90 µL المتبقية من تفاعل الارتباط إلى راتنج nickel NTA المغسول.

بعد ذلك، يتم تحضين العينة في هزاز دوراني لمدة 30 دقيقة. وعند الانتهاء، تُطرد العينة مركزياً عند 100 Gs لمدة دقيقتين. وبعد إزالة الطافي، تُكرر خطوات الغسيل ثلاث مرات إضافية.

بعد ذلك، أضف 35 µL من محلول الاستخلاص (elution buffer) إلى الراتنج وامزجه باستخدام جهاز الرج (vortexing). حضّن العينة على سطح المختبر في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. وبعد طرد العينة مركزياً، انقل supernatant إلى أنبوب جديد سعة 1.5 mL وقم بتسميته كجزء DNA المرتبط بالبروتين.

ثم أضف 35 µL من محلول الاستخلاص (elucian buffer) إلى الحمض النووي المدخل بعد تنقية أجزاء الحمض النووي المدخل والحمض النووي المرتبط بالبروتين. أضف 10 µL من كل منهما إلى أنابيب PCR منفصلة. بعد ذلك، أضف 1 µL من محلول التجزئة المنظم بتركيز 10x (10 x fragmentation buffer)، و 2 µL من محلول تحضير المكتبة (library preparation buffer)، و 1 µL من محلول تثبيت المكتبة (library stabilization solution) إلى كل عينة، ثم اخلط العينات جيداً باستخدام جهاز المزيج الدوامي (vortexing).

قم بتحضين العينات في جهاز التدوير الحراري عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين. وعند الانتهاء، قم بتبريد العينات على الثلج. بعد ذلك، أضف 1 µL من إنزيم تحضير المكتبة إلى العينات واخلط المحتويات عن طريق الماصة.

قم بحضن العينات في جهاز التدوير الحراري. بعد الحضن، أضف 47.5 µL من الماء، و7.5 µL من المزيج الرئيسي للتضخيم بتركيز 10x، وخمسة µL من البوليميراز إلى كل أنبوب. وبمجرد خلط العينات، قم بتسخينها في جهاز التدوير الحراري.

قم بإعداد تفاعلات QPCR ثلاثية لكل قالب DNA عن طريق تحضير مزيج رئيسي (master mix) بتركيز 1x لكل مجموعة من البادئات المصممة مسبقاً، ثم وزع 18 µL من المزيج الرئيسي في كل بئر من طبق PCR ذي 96 بئراً. قم بتخفيف عينات DNA المدخلة والمطهرة والمضخمة، وكذلك عينات DNA المرتبطة بالبروتين، باستخدام الماء لتصل إلى تركيز 5 ng/µL، وأضف 2 µL من كل عينة إلى الآبار. بعد ذلك، قم بإغلاق الطبق باستخدام غشاء ختم UltraClear QPCR.

قم بطرد الطبق مركزياً في جهاز طرد مركزي عند 200 GS لمدة دقيقة واحدة. بعد وضع الطبق في جهاز QPCR في الوقت الحقيقي، وباستخدام الظروف التالية لوسم DNA المدخل بـ s si three وDNA المخصب بـ sci five، اخلط 1 µg من DNA مع 40 µL من S3 SCI-FI labeled nine mers، واضبط الحجم إلى 80 µL باستخدام الماء. قم بمسخ العينات عند 98 °C لمدة 10 دقائق في الظلام باستخدام جهاز التدوير الحراري.

عند الانتهاء، قم بتبريد العينات سريعاً على الثلج لمدة دقيقتين، ثم أضف إلى كل تفاعل 2 µL من 3 prime, 5 prime exo polymerase، و 5 mM من deoxy nucleotide tric phosphates، و 8 µL من الماء. بعد الخلط، قم بحضن التفاعلات عند 37 °C لمدة ساعتين في الظلام باستخدام جهاز التدوير الحراري. عند هذه النقطة، أضف EDTA ليصل التركيز إلى 50 mM لإيقاف التفاعلات، ومحلول sodium chloride ليصل التركيز إلى 0.5 M.

ثم انقل المحتويات إلى أنابيب سعة 1.5 milliliter تحتوي على 0.9 حجم من isopropanol بعد الحضن في الظلام لمدة 10 دقائق. قم بطرد العينات مركزياً عند 12,000 GS لمدة 10 دقائق. اجمع 6 micrograms من كل من DNA المسمى بـ S3 و sci-fi معاً في أنبوب سعة 1.5 milliliter، ثم جففها بالتفريغ في جهاز طرد مركزي على حرارة منخفضة في الظلام عن طريق تغطية غطاء جهاز الطرد المركزي إذا كان شفافاً.

بمجرد جفاف الكريات، نقوم بتعليقها في 5 µL من الماء. ثم نضيف 13 µL من مزيج رئيسي لمحلول التهجين بتركيز 1x مُحضّر مسبقاً إلى العينات بعد الرج بجهاز الفورتيكس لمدة 15 ثانية، ونحضن العينات عند 95 °C في حمام جاف لمدة خمس دقائق. نُخرج العينات من الحمام الجاف ونضعها في نظام تهجين عند 42 °C حتى تصبح جاهزة للتحميل.

بعد ذلك، ضع مجموعة شريحة الخلط التي تم تحضيرها مسبقاً داخل نظام التهجين. قم بتحميل 16 µL من العينة في فتحة التعبئة. ثم أغلق الفتحات بغشاء لاصق وقم بتفعيل عملية الخلط في النظام، وبعد التهجين لمدة تتراوح من 16 إلى 20 ساعة عند 42 °C.

قم بتمرير الشريحة المخلوطة في أداة التفكيك وضعها داخل طبق يحتوي على محلول منظم دافئ. أولاً، قم بنزع الخليط من على الشريحة مع هز أداة التفكيك بقوة. ضع الشريحة في وعاء يحتوي على 50 milliliters من محلول الغسيل المنظم الأول وقم بالرج بقوة لمدة دقيقتين.

بعد ذلك، كرر الخطوة السابقة باستخدام 50 milliliters من محلول الغسيل الثاني و50 milliliters من محلول الغسيل الثالث RRR DVU 3 0 2 3 shifted. وأظهر تحليل QPCR للمنطقة العلوية من DVU 3 0 2 5 أن المنطقة العلوية لـ DVU 3 0 2 5 مخصبة في الجزء المرتبط بالبروتين مقارنةً بالـ DNA المدخل، مما يشير إلى أن ظروف الارتباط كانت مناسبة لـ DVU 3 0 2 3. وكان DVU 0 0 1 3 بمثابة ضابط سلبي. وقد تم اختيار أعلى أربع قمم تم الحصول عليها بعد تحليل DAP chipp على أنها الأهداف الأكثر احتمالاً لـ DV 3 0 2 3.

كان الهدف الإيجابي DVU 3 0 2 5 هو أول قمة تم الحصول عليها بأعلى درجة. وهدفان جينيان عبارة عن اثنين آخرين من إنزيم lactate permease المشفر بشكل مستقل. أما الهدف الجيني الرابع فلا يقع في منطقة المنبع (upstream region)، بل في المنطقة البينية (intergenic region) بين جينين يتم نسخهما بشكل متقارب باستخدام مناطق المنبع للأهداف التي تم الحصول عليها بواسطة DAP chip، وقد استُخدم meme للتنبؤ بنمط موقع الارتباط (binding site motif).

تم التحقق من صحة التتابع الزخرفي (motif) بشكل أكبر عن طريق إجراء استبدالات في القواعد المحفوظة داخل هذا التتابع، مما أدى إلى إلغاء إزاحة الارتباط. واستُخدم التتابع الزخرفي الذي تم التحقق منه لمسح جينومات بكتيريا أخرى مختزلة للكبريت تحتوي على مواقع متناظرة لـ DVU 3 0 2 3، حيث تم اختيار هذه المواقع كأهداف جينية محتملة عندما وُجد التتابع الزخرفي في المناطق الواقعة في الاتجاه العلوي (upstream) من أطر القراءة المفتوحة باستخدام تتابعات زخرفية متوقعة لـ rs ذاتية المنشأ. وتم توليد تتابع زخرفي لموقع ارتباط توافقي، والذي كان يشبه إلى حد كبير التتابع الخاص بـ Divo Garris Hilton Burrow.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية استخدام طريقة Daptive لتحديد الأهداف الجينية للبروتينات التنظيمية. يمكن توظيف هذه الطريقة لتحليل حجم الارتباط لأي بروتين تنظيمي، شريطة أن يكون من الممكن تنقية البروتين وأن يكون تسلسل الجينوم معروفاً.