في المختبر البنكرياس توالد من تفرقوا الجنينية الماوس أسلاف

طريقة ثقافة ثلاثية الأبعاد الموصوفة في هذا البروتوكول يلخص التنمية البنكرياس من الأسلاف المتفرقة الجنينية الماوس البنكرياس، بما في ذلك توسعها الكبير، والتمايز والتشكل في هيئة متفرعة. هذا الأسلوب هو قابل للتصوير، والتدخل الوظيفية والتلاعب في مكانه.

الهدف العام من هذا الإجراء هو توسيع أسلاف البنكرياس متعددة القدرات المرتبطة في سقالة Matrigel ثلاثية الأبعاد حيث يمكنهم التمييز والتنظيم الذاتي. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل البنكرياس أولا عن أجنة الفأر في اليوم الجنيني 10.5. الخطوة الثانية هي إزالة اللحمة المتوسطة وفصل الظهارة إلى خلايا مفردة وكتل صغيرة.

الخطوة الأخيرة هي تعليق الخلايا في ماتريجيل واحتضان الجل المبلمر للتوسع. في النهاية ، يؤدي هذا إلى عضيات البنكرياس المتفرعة ذاتية التنظيم ، على غرار البنكرياس الجنيني للفأر الذي يمكن تصوره على الهواء مباشرة أو في نقطة النهاية عن طريق الفحص المجهري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل جميع البنكرياس ، هي أن المرء يبدأ من مجموعة خلايا محددة جيدا وأقل تعقيدا.

يتم الحفاظ على أسلاف البنكرياس بشكل أفضل في 3D مقارنة بمزارع الخلايا ثنائية الأبعاد. يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على بعض الأسئلة المهمة في هذا المجال ، مثل تفاعل الخلية أو تفاعل الخلية مع المصفوفة. سيؤدي هذا في النهاية إلى فهم كيفية ظهور الاستقطاب ، وبالتالي أيضا كيفية ظهور تنوع الخلايا.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج مرض السكري بعد التكيف في الإنسان ، لأنه يمكننا توسيع البنكرياس الذي سيؤدي إلى ظهور خلايا أفضل تنتج الأنسولين. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تنفيذ خطوة إزالة الوقت المذهل وخطوة التفكك مهمة لتكوين العضوية في الأعضاء. للبدء ، ضع جنين الفأر الذي تم عزله سابقا في اليوم الجنيني 10.5 في طبق بتري نظيف مقاس 35 ملم في PBS.

بعد ذلك ، استخدم ملقطا رفيعا بعرض 0.05 ملم تقريبا لإزالة الطرف الأمامي. أدخل الملقط برفق في الفتحة لفصل الجهاز الهضمي عن منطقة الحبل الشوكي. حدد موقع المعدة والكبد والأمعاء على الجنين.

ثم استخدم الإبر لعزل الجهاز الهضمي من المعدة إلى الأمعاء. ضع الجهاز الهضمي في DMM بارد على الثلج. كرر الخطوة السابقة لعزل كل جهاز هضمي على حدة.

احتفظ بالجهاز الهضمي الفردي في آبار مختلفة. في صفيحة 24 بئر مع DMM بارد على الجليد ، من الضروري فقط إبقائها منفصلة إذا كان النمط الجيني ذا أهمية. ضع جهازا هضميا واحدا في طبق بتري نظيف مقاس 33 ملم في PBS بارد وتخيله على مجهر تشريح باستخدام الإضاءة من الأسفل كمجال ساطع.

بمجرد أن يصبح الجهاز الهضمي في بؤرة التركيز ، قم بتشريح برعم البنكرياس الظهري باستخدام ألسنة حادة كهربائيا بدلا من الإبر أو إبر الحقنة قياس 20. اعزل برعم البنكرياس بأقل قدر ممكن من اللحمة المتوسطة حول الظهارة. ضع البرعم المعزول في طبق بتري واحتضانه في نقطة واحدة باردة 25 ملليغرام لكل مليلتر لمحلول الفضاء لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق.

من هذه النقطة عند نقل البرعم ، استخدم شعريا زجاجيا مسحوبا باللهب سعة 50 ميكرولتر متصل بأنبوب مرن يتم التحكم فيه عن طريق الفم. ضع البرعم في المحلول أثناء التحكم المجهري. ضع برعم البنكرياس مرة أخرى في PBS.

ثم نظف برعم البنكرياس المعزول من اللحمة المتوسطة باستخدام الإبر والشفط اللطيف باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية. بمجرد إزالة اللحمة المتوسطة بالكامل ، اشطف برعم البنكرياس في PBS البارد وانقل كل برعم إلى آبار فردية. في صفيحة 60 بئر تحتوي على 10 ميكرولتر من DMM البارد لكل بئر.

لشطف براعم البنكرياس التي تم تشريحها ، قم بتقطيع كل برعم في آبار مخروطية فردية وصينية صغيرة سعة 60 بئرا تحتوي على 10 ميكرولتر من PBS لكل منهم. حسنا ، انقل برعم البنكرياس إلى بئر يحتوي على 10 ميكرولتر من 0.05٪ تريبسين واحتضنه لمدة أربع دقائق. عند 37 درجة مئوية ، قم بتعطيل التربسين عن طريق نقل البرعم إلى بئر يحتوي على 10 ميكرولتر من DMM مع 10٪ من مصل ربلة الساق الجنينية ، وتعليق الخلية من خلال شعيرات دموية رقيقة يتم سحبها باستخدام مجتذب ماصة لفصل الخلايا.

يوصى بالتفكك الجزئي لأن عضيات البنكرياس تبدأ على النحو الأمثل من مجموعات صغيرة من خمس إلى 15 خلية. قم بتجميع الخلايا من عدة أجنة في أنبوب einor لتقليل الاختلافات الناتجة عن المعالجة الفردية. تمييع معلق الخلية بنسبة واحد إلى ثلاثة في ماتريجيل المبرد.

Aliquot معلق الخلية المخفف في لوحة أربعة آبار ، أو لوحة 96 بئر عن طريق سحب العينات. ثمانية ميكرولتر لكل بئر. احتضن اللوحة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق للسماح لجل ماتري بالتكاثف.

املأ البئر الصغير بوسط الاستزراع وضع اللوحة في بيئة رطبة عند 37 درجة مئوية تحتوي على 5٪ CO2 و 95٪ هواء. استبدل الوسط كل أربعة أيام وراقب مستعمرات البنكرياس النامية يوميا. توثيق عملية النمو باستخدام الفحص المجهري بفاصل زمني ، والخلايا السلفية للبنكرياس الظهرية من الفئران في الجنين.

أظهر اليوم 10.5 ، الذي نما في وسط عضوي ، توسعا في مجموعات الخلايا طوال فترة الاستزراع لمدة سبعة أيام وبدأ في التفرع بعد أربعة أيام. لم تتوسع الخلايا المفردة وفقدت PDX تعبيرا واحدا. بينما احتفظت المجموعات الكبيرة ب pdx.

تعبير واحد ، خلايا سلف البنكرياس تنمو في الكرة. توسع الوسط بشكل متكرر أكثر من العضوية. بالإضافة إلى ذلك ، تم اكتشاف Illumina في اليوم الثاني إلى الثالث وأدى التوسع الإضافي إلى مجالات مجوفة أحادية الطبقات مع مناطق محلية متعددة الطبقات في بعض الأحيان.

تم تحديد التحليل النسيجي للتركيبة العضوية المؤكدة لمدة سبعة أيام لأسلاف البنكرياس كما هو موضح من خلال التلوين الإيجابي ل H NF و B واحد و PDX ، كما تم تحديد الخلايا المتمايزة عن طريق تلطيخ علامة الأميليز الخارجية والأنسولين المميز الغدد الصماء. عبر عن المجالات أكثر تجانسا. علامات سلف البنكرياس hnf واحد B و PDX واحد وتمايزت أقل من العضيات.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر عدم فصل الخلايا تماما باتباع هذا الإجراء. يمكنك علاج هذه العضيات تماما كما كانت عضوا صغيرا. لذلك ، يمكنك إجراء QPCR العادي.

يمكنك إجراء QPCR أحادي الخلية ، والقيام بالتصوير المباشر. يمكنك القيام بالكيمياء المناعية ، ومن خلال القيام بكل هذه الطرق ، يمكنك الحصول على فهم للديناميكيات الخلوية التي تحدث في هذا ، في هذا العضو الصغير مثل الهيكل ، يمكنك احتضان مواد كيميائية صغيرة وبالتالي التفاعل مع المسارات المختلفة ذات الأهمية. ستمهد هذه التقنية الطريق للباحثين لتحديد آليات تطور البنكرياس وتكوين الخلايا بشكل أفضل في الوقت الحالي في الفأر ، ولكن في المستقبل ، بدءا من ESLs البشرية أو خلايا IP S.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية صنع بنكرياس صغير يحاكي تطور البنكرياس الطبيعي من عدد قليل من الأسلاف في بيئة ثقافية ثلاثية الأبعاد.