والفحص السلوكية بسيطة لاختبار وظيفة البصرية في

الهدف العام من هذا الإجراء هو اختبار الوظيفة البصرية لشرغوف الضفادع عن طريق تسجيل مقدار الوقت الذي يقضيه الحيوان في نصف خزان الاختبار المغطى باللون الأسود. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تربية الشراغيف حتى تصل إلى المراحل من 45 إلى 50. وتتمثل الخطوة الثانية في تجهيز خزان نصفه أسود ونصفه أبيض، بالإضافة إلى كاميرا لإجراء مقايسة السلوك.

بعد ذلك، ضع خزانًا ثانيًا يحتوي على شرغوف داخل الخزان الخارجي. قم بتسجيل السلوك الموجه بالرؤية لكل شرغوف مع تغيير الخلفية في بيئته. وتتمثل الخطوة النهائية في إجراء عملية استئصال للشبكية للشرغوفيات ثم تكرار اختبار السلوك.

في النهاية، تُستخدم البيانات المستمدة من هذا المقايسة البسيطة وغير المكلفة لإظهار أن لدى الشراغيف تفضيلاً للسباحة في جانب واحد من الحوض على الجانب الآخر، وذلك تحت اختبارات الرؤية الضوئية الموضعية. وتتمثل الميزة الرئيسية لاستخدام هذه الطريقة مقارنة بالتقنيات الأخرى، مثل استجابة الحركة البصرية أو مقايسة قلب الذيل، في كونها طريقة بسيطة وغير مكلفة تستخدم معدات متوفرة بسهولة في معظم مختبرات opus. ولتجهيز الشراغيف، يتم أولاً الحصول على أجنة xenopus مخصبة، ووضع mark's، أو محلول ringers المعدل، أو MMR المخفف بمعامل 10 في أطباق بتري سعة 60 millimeter بتركيز 50 micrograms per milliliter.

ضع الأجنة في مرحلة البلاستولا إلى مرحلة الصفيحة العصبية في مضاد حيوي جينتاميسين. المراحل من 2 إلى 15 عند درجة حرارة 18 درجة Celsius في أطباق بتري. وبمجرد أن تصل الأجنة إلى مرحلة الكأس العصبي في حدود 27 إلى 30، يتم نقلها إلى وسط 0.1 XMMR خالي من المضادات الحيوية للسماح بنمو بكتيريا الأمعاء.

عندما تصل الشراغيف إلى مرحلة التغذية حوالي المرحلة 45، انقلها إلى أطباق بيتري بحجم 100 millimeter تحتوي على 0.1 XMMR. وفي اليوم التالي، قم بتغذيتها بمرق مسحوق القراص. وبعد مرور أسبوع في طبق بيتري بحجم 100 millimeter، املأ حوضاً بسعة نصف جالون بماء الضفادع.

انقل الحيوانات إلى الحوض واستمر في جدول تغذية الراشح من مسحوق القراص، ولكن قم بتغيير الماء من مرتين إلى ثلاث مرات فقط في الأسبوع. عند وضع الحيوانات في أحواض سعة نصف غالون، حافظ عليها في دورة ضوئية تتكون من 12 ساعة ضوء و12 ساعة ظلام، مع تشغيل الأضواء في الساعة 6:00 صباحاً. قبل إجراء الاختبار، ضع الحوض سعة نصف الغالون الذي يحتوي على عينات الاختبار على سطح أبيض طوال الليل لمدة 12 ساعة على الأقل قبل البدء. يجب إجراء اختبار السلوك في منطقة هادئة وقليلة الحركة مع إضاءة فلورسنت قياسية.

قم بتجهيز خزانين للاختبار سعة نصف جالون يتداخلان في الزوايا الخارجية لما سيكون الخزان الداخلي. استخدم قلم Sharpie لتحديد خط مستوى الماء على ارتفاع 5 cm فوق القاع. بالنسبة للخزان الداخلي أيضاً، حدد أي منخفضات في الجزء الداخلي منه.

املأ هذه الفراغات بمركب خامل لمنع الشراغف من البقاء فيها. الآن وجه الانتباه إلى الخزان الخارجي الثاني. وفي الخطوة التالية، أحضر شريطًا لاصقًا كهربائيًا أسود وورق مناديل أبيض.

استخدم الشريط اللاصق لتغطية الجزء الخارجي من نصف واحد من الخزان، وورق المناديل لتغطية الجزء الخارجي من النصف الآخر كما هو موضح هنا. وبمجرد تجهيز الخزانات، قم بإعداد قرص دوار للتلقيح وضع الخزانات المتداخلة عليه. ثبّت حاملاً ثلاثياً وكاميرا ويب بحيث تتمكن الكاميرا من تصوير الجزء الداخلي للخزانات من الأعلى.

قم بتوصيل كاميرا الويب بجهاز كمبيوتر مزود ببرنامج لالتقاط الفيديو وتشغيله. قم بتشغيل الكاميرا واستعد لبدء تسجيل فيديو جديد. بعد ذلك، قم بتغطية الكاميرا والخزانات بقطعة قماش قطنية خفيفة الوزن.

لتقليل المؤثرات الخارجية على الشراغيف، استخدم مقياس السطوع وتأكد من أن السطوع تحت القماش يتراوح بين 35 إلى 50 شمعة لكل متر مربع. ابدأ اختبار السلوك باستخراج حوض الاختبار الداخلي، ثم املأه بماء الضفادع حتى علامة 5 cm.

استخدم شبكة لنقل الحيوان من الحاوية التي سعتها نصف غالون إلى حوض الاختبار الداخلي الموجود عند الكمبيوتر. تأكد من أن برنامج التسجيل مفتوح ويقوم بتسجيل منطقة الاختبار لغرض التوثيق. اكتب اسم الحيوان، والتاريخ، والوقت على ورقة.

ضع هذا تحت الكاميرا للتسجيل. بعد الانتهاء من ذلك، اضبط مؤقتاً لمدة دقيقتين. بعد ذلك، وجّه الخزان الخارجي على القرص الدوار، بحيث يكون الجانب الأسود على اليمين.

ضع الآن خزان الاختبار داخل الخزان الخارجي. في منطقة التسجيل، أغلق الستارة واستخدم شاشة الكمبيوتر للتأكد من توجيه الخزان الخارجي. تأكد من تسجيل الفيديو وقم بتشغيل المؤقت.

عندما يصدر المؤقت صوت التنبيه، حافظ على وضعية الغطاء وأخرج خزان الاختبار الداخلي. بعد ذلك، قم بتدوير الخزان الخارجي بمقدار 180 درجة بحيث يصبح الجانب الأسود الآن على اليسار. أعد خزان الاختبار إلى الخزان الخارجي وشغل المؤقت لمدة دقيقتين.

مرة أخرى، قم بإزالة الخزان الداخلي. أدر الخزان الخارجي بمقدار 180 درجة، واستبدل الخزان الداخلي كل دقيقتين لمدة إجمالية تصل إلى 10 مرات. عند الانتهاء، أوقف تسجيل الفيديو.

أعد الشرغوف إلى خزانه الذي تبلغ سعته نصف جالون. قم بتجهيز المجهر لإجراء عملية استئصال الشبكية. املأ طبق بتري بقطر 60 مليمتر بنسبة 1% من agarose مذاب في 0.1 XMMR واتركه ليتصلب.

قم بإزالة قطعة مستطيلة صغيرة من الـ aros بحجم الشرغوف. وعندما تكون مستعداً للمتابعة، استخرج الحيوان المختبر وضعه في 0.02%Trica. استمر في العملية عندما يصبح الحيوان غير مستجيب لقرص الذيل باستخدام ملقط رقم ثلاثة.

ثم انقل الحيوان إلى الطبق. استمر بتثبيت طبق بتري على المجهر. استعد لتثبيت الحيوان باستخدام الملاقط من أحد الجانبين.

من الجانب المقابل، استخدم إبرة قياس 25 gauge لثقب الجلد خلف المنطقة الظهرية للعين بزاوية 45 درجة، ثم ادخل بحذر في الثقب باستخدام ملقط رقم 5 واقطع العصب البصري مع تجنب الوريد المجاور له. أزِح العصب بعيداً ثم اسحب الملقط بعد الجراحة. قم باستعادة وعي الحيوان عن طريق وضعه في طبق بتري قطر 100 millimeter يحتوي على 0.7 XMMR و50 micrograms per milliliter.

الجنتاميسين لمدة 20 minutes. بعد ذلك، انقل الشرغوف إلى خزان استشفاء يحتوي على مياه الضفادع. ضع الخزان على سطح أبيض استعداداً للاختبار.

اترك الحيوان ليرتاح طوال الليل. وفي الصباح التالي، استخدم المقايسة السلوكية لاختبار الوظيفة البصرية. يعرض هذا المقطع بيانات نموذجية للتجربة.

تظهر الحيوانات على اليسار قبل الجراحة، وعلى اليمين تظهر الحيوانات نفسها بعد قطع المحاور الشبكية في كلتا العينين. ويشير إلى ذلك المخطط الموجود في الزوايا السفلية. لقد تم تحريك المياه لإظهار عدم إضافة أي شيء لطرد الحيوانات من الجانب الأسود أو جذبها إلى الجانب الأبيض.

تستجيب شرغوفات ما قبل الجراحة للون الخلفية في أقل من 30 ثانية، بينما تسبح الشرغوفات العمياء بشكل عشوائي في الحوض. يوضح هذا المخطط النسبة المئوية للوقت الذي قضاه حيوان واحد في المنطقتين البيضاء والسوداء تحت ثلاثة ظروف. أولاً، تمت ملاحظة الحيوان قبل إجراء أي جراحة باستخدام المقايسة.

في يومين متتاليين بعد قطع العصب البصري الأيمن، تمت مراقبة سلوكه على مدار يومين من الاختبار. وأخيراً، بعد قطع كلا العصبين البصريين، تلا ذلك يومان إضافيان من الملاحظة باستخدام المقايسة. وقد قضى الحيوان أياماً أكثر في الجانب الأبيض من الحوض عندما كان عصب بصري واحد على الأقل سليماً.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية اختبار رؤية شرغوف الضفدع باستخدام كواشف ومعدات بسيطة توجد في معظم مختبرات الضفادع. حظاً موفقاً في تجاربك.