ماركر الخلايا السطحية تنقية بوساطة من الجذع الوسطيات خلية من نموذج قابل للبرمجة ماوس
September 6th, 2014
يمكن إعادة برمجة الخلايا الليفية الجنينية للفأر إلى خلايا جذعية مستحثة متعددة القدرات بكفاءة منخفضة عن طريق التعبير القسري عن عوامل النسخ Oct-4 و Sox-2 و Klf-4 و c-Myc. المواد الوسيطة النادرة لتفاعل إعادة البرمجة هي FACS معزولة عن طريق وضع العلامات بالأجسام المضادة ضد صانعي سطح الخلية Thy-1.2 و Ssea-1 و Epcam.
الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل المواد الوسيطة النادرة لإعادة البرمجة عن مزارع إعادة برمجة الخلايا الليفية الجنينية للفأر. يتم تحقيق ذلك عن طريق اشتقاق الخلايا الليفية الجنينية للفأر أولا من أجنة E 13.5 من سلالة فأر قابلة لإعادة البرمجة. في الخطوة الثانية ، يتم زرع الخلايا الليفية الجنينية للفأر ذات الممر المنخفض في وسائط خلوية جذعية مستحثة متعددة القدرات أو IPS مكملة بالدوكسيسيكلين لبدء عملية إعادة البرمجة.
بعد ذلك ، يتم حصاد الخلايا في نقاط زمنية محددة أثناء إعادة البرمجة وتصنيفها بأجسام مضادة مقابل علامات سطح خلية معينة. في النهاية ، يمكن عزل المواد الوسيطة النادرة لإعادة البرمجة بالحقائق لمزيد من التحليل التجريبي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية للطرق الحالية هي أنه يمكن إجراء دراسات ميكانيكية على المواد الوسيطة النادرة لإعادة البرمجة في حالة عدم وجود خلايا مقاومة لعملية إعادة البرمجة ، والتي تشكل الجزء الأكبر من السكان لتوليد الخلايا الجنينية أو الخلايا الليفية أو mes تبدأ بنقل قرن رحم جنيني 13.5 إلى طبق زراعة أنسجة 10 سم يحتوي على 10 مل من PBS المعقم.
ثم استخدم مقصا جراحيا معقما لتقطيع القرن إلى قطع فردية تحتوي كل منها على جنين واحد. بعد ذلك ، تحت مجهر تشريح في غطاء مزرعة الأنسجة ، استخدم ملقطا معقما لإزالة غلاف الرحم والغشاء الجنيني الإضافي المحيط بكل جنين بعناية ونقل كل جنين منزع الكرين إلى أطباق فردية بطول 10 سم مع 10 ملليلتر من PBS الطازج. ثم استمر في إزالة رأس كل جنين وأطرافه وذيله وأعضائه الداخلية بالملقط.
قم بتجميد الرؤوس في أنابيب فردية سعة 1.5 مليلتر للتنميط الجيني حسب الضرورة. انقل كل جذع إلى ألواح فردية جديدة بحجم 10 سنتيمترات واستخدم شفرتين جراحيتين لفرم كل جنين لمدة دقيقتين. هضم قطع المناديل في 200 ميكرولتر من التربسين EDTA لمدة ثلاث إلى خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، متبوعة بدقيقتين إضافيتين من الفرم.
ثم قم بتعطيل الترين باستخدام ملليلترين من وسائط الميثامفيتامين وانقل ملاط الخلية إلى أنبوب سعة 15 مليلتر باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر. قم أيضا بفصل الأنسجة ميكانيكيا باستخدام ماصة لطيفة ثم انقل محلول الخلية إلى طبق مغلف بالجيلاتين بطول 10 سنتيمترات. أضف 10 ملليلتر إضافي من وسائط الميثامفيتامين إلى الثقافة.
بعد 24 إلى 48 ساعة ، يجب تغطية اللوحة بكثافة ب MEFs لإعادة برمجة MEFs أولا لإذابة مزرعة الميثامفيتامين المجمدة ذات الممر المنخفض في حمام مائي 37 درجة مئوية ، ثم نقل المحتويات إلى أنبوب يحتوي على 10 ملليلتر من وسائط الميثامفيتامين الدافئة. بعد تدوير الخلايا ، أعد تعليق الحبيبات في 12 مل من وسائط الميثامفيتامين الطازجة وانقل تعليق الخلية إلى وعاء ثقافة T 75 مطلي بالجيلاتين. بعد فترة نقاهة من 24 إلى 48 ساعة ، اغسل MEFs باستخدام PBS ثم افصل الخلايا بثلاثة ملليلتر من التربسين EDTA لمدة ثلاث إلى خمس دقائق عند 37 درجة مئوية.
ثم أوقف الهضم الأنزيمي بخمسة ملليلتر من وسائط الميثامفيتامين وقم بفصل الخلايا عن طريق الخلط اللطيف مع ماصة سعة 10 ملليلتر. بعد ذلك ، أعد برمجة mets عن طريق زرع الخلايا على جيلاتين جديد ، قارورة T 75 مطلية بمعدل 6.7 في 10 إلى الخلايا الثالثة لكل سنتيمتر مربع في 12 مل من وسائط IPSC التي تحتوي على ميكروغرامين لكل مليلتر من الدوكسيسيكلين خلال الأيام الستة الأولى. استبدل الوسائط كل يومين بوسائط IPSE الطازجة المكملة بالدوكسيسيكلين التي تحصد المواد الوسيطة المعاد برمجتها في النقاط الزمنية المطلوبة عن طريق انفصال التربسين EDTA كما هو موضح للتو لكل معلق وسيط محصود.
اغسل الخلايا في PBS. ثم resus. قم بتعليق الكريات في وسائط الفاكس لوضع العلامات على الأجسام المضادة لإنشاء مزارع IPSC معاد برمجتها بالكامل.
قم بزراعة الخلايا في وسائط IPSC الخالية من الدوكسيسيكلين لمدة أربعة إلى سبعة أيام أخرى لتسمية الخلايا المعاد برمجتها. قم بتسمية المواد الوسيطة المحصودة بالأجسام المضادة المناسبة ذات الأهمية. بعد 10 دقائق ، اضغط برفق على الأنابيب لإعادة تعليق الخلايا ثم ضع الأنابيب على الجليد لمدة 10 دقائق إضافية.
بعد الحضانة الثانية ، اغسل الخلايا في 10 ملليلتر من PBS البارد لكل أنبوب. ثم قم بشفط المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الكريات في حجم مناسب من وسائط الملصقات المكملة بدبوس الشرير P بحجم سبعة على الجليد. بعد 20 دقيقة ، اغسل الخلايا في 10 أخرى من PBS البارد وأعد تعليق كريات الخلية في وسائط الملصقات المكملة بيوديد البروبيديوم.
قم بتصفية أي كتل خلوية عن طريق تمرير المعلق عبر مصفاة 70 ميكرومتر ثم انقل الخلايا إلى أنابيب الفاكس المناسبة على الجليد. لضوابط التعويض. يقوم Resus بتعليق قارورة التبريد من خلايا IPS المحفوظة على mes مشعة في 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت لوضع العلامات.
تخصيص 200 ميكرولتر من الخلايا للتحكم في التحكم غير المسمى. ثم قم بتقسيم تعليق الخلية المتبقي بين ثلاثة أنابيب سعة 15 مليلتر لعناصر التحكم في اللون الفردي وقم بتسمية العينات كما هو موضح للتو لتحليل المواد الوسيطة عن طريق قياس التدفق الخلوي. ابدأ بوضع بوابة في مخطط التشتت الأمامي لاستبعاد الحطام.
ثم استخدم ارتفاع التشتت الأمامي مقابل منطقة التشتت الأمامية لاستبعاد التجميعات وقناة PI مقابل الانتثار الأمامي. للبوابة على الخلايا الحية السالبة PI. استخدم الخلايا غير المسماة لضبط الفولتية لقنوات FITC و PSI السبع الزرقاء في المحيط الهادئ.
وضع مجموعةالخلايا بشكل مثالي في الطرف السفلي من القناة المعنية. بعد ذلك ، قم بتعيين البوابات مع خلايا التحكم غير المسماة لتقسيم ثقافات إعادة البرمجة إلى اليوم الثالث والسادس والتاسع. مجموعات SSEA واحدة سلبية TH 1.2 خلايا إيجابية SSEA واحدة سلبية TH 1.2 خلايا سلبية وإعادة برمجة الخلايا الوسيطة SSEA واحدة إيجابية TH 1.2 خلايا سلبية.
ثم قم بتقسيم اليوم التاسع SSEA واحدا إيجابيا TH 1.2 كسرا سلبيا مع مخطط SSEA واحد مقابل EPAM. باستخدام بوابات ارسم عنصر التحكم غير المسمى حول الخلايا الموجبة ل EPAM والخلايا السالبة EPAM كما هو موضح هنا. أخيرا ، اجمع الخلايا في واحد إلى ملليلتر من وسائط خلية IPS.
عند تحريض الدوكسيسيكلين ، تخضع أساطير إعادة البرمجة لتغييرات مورفولوجية مميزة في اليوم السادس. تبدأ المستعمرات المبكرة مثل البقع في الظهور والتي تستمر في النمو في الحجم عند مزيد من الثقافة. ستؤدي تجربة إعادة البرمجة الجيدة إلى أكثر من 500 مستعمرة لكل T 75 تم زرعها في البداية بخمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الخامسة وستمتلك ثقافات IPS المنشأة مستعمرات مميزة على شكل قبة وتكون في الغالب خالية من الخلايا المتمايزة.
تنعكس التغيرات المورفولوجية والجزيئية أثناء إعادة البرمجة في التغيرات في التعبير عن سطح الخلية للفخذ 1.2 SSEA واحد ، وفي النهاية epca. في حين أن MES إيجابية في الغالب للفخذ 1.2 وسلبية للعلامات الأخرى ، بحلول اليوم الثالث ، بدأت نسبة كبيرة من الخلايا في تنظيم التعبير عن الفخذ 1.2 ، وأصبحت مجموعة فرعية صغيرة جدا SSEA واحدة إيجابية. يمكن اكتشاف إعادة البرمجة الوسيطة الفعلية لهذه النقطة الزمنية في اليومين السادس والتاسع ، وهي نسبة مئوية متزايدة من الخلايا الموجبة الواحدة ، وعادة ما تكون أعلى بكثير من 10٪ بحلول اليوم 12 تقريبا.
يمكن اكتشاف مجموعة فرعية من الخلايا الإيجابية للخلايا الإيجابية أيضا. لبرنامج epca. ستكون مزارع خلايا IPS الراسخة إيجابية بقوة.
بالنسبة إلى SSEA one و EPCA أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر فقط استخدام خرائط المرور المنخفضة التي تم تنميطها بشكل صحيح مسبقا.
نظرة عامة
تحدد هذه الدراسة إجراءً لعزل الوسائط النادرة لإعادة البرمجة من الخلايا الليفية الجنينية الفأرية (MEFs) أثناء تحويلها إلى خلايا جذعية متعددة القدرات مستحثة (iPSCs). يتضمن العملية استخدام عوامل نسخ محددة وتمييز الأجسام المضادة لتسهيل تحديد هذه الوسائط النادرة وعزلها.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الخلايا الجذعية
- إعادة برمجة الخلايا
- قياس التدفق الخلوي
الخلفية
- يمكن إنشاء الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSCs) من الخلايا الجسدية.
- تعمل الخلايا الليفية الجنينية الفأرية (MEFs) كنموذج لدراسة إعادة البرمجة.
- عوامل النسخ Oct-4, Sox-2, Klf-4, وc-Myc ضرورية لإعادة البرمجة.
- يسمح عزل الوسائط النادرة لإعادة البرمجة بدراسات ميكانيكية.
غرض الدراسة
- لعزل الوسائط النادرة لإعادة البرمجة من MEFs.
- لتحليل هذه الوسائط النادرة لفهم أفضل لعملية إعادة البرمجة.
- لتحسين كفاءة إنشاء iPSCs.
الطرق المستخدمة
- اشتقاق MEFs من أجنة E 13.5.
- زرع MEFs في وسط iPSCs مضافًا إليه دوكسيسيكلين.
- حصاد الخلايا في نقاط زمنية محددة وتمييزها بالأجسام المضادة.
- عزل الوسائط النادرة عن طريق قياس التدفق الخلوي.
النتائج الرئيسية
- العزل الناجح للوسائط النادرة لإعادة البرمجة باستخدام علامات محددة.
- تحديد مجموعات مميزة من الخلايا في مراحل مختلفة من إعادة البرمجة.
- تأييد القدرة على إجراء دراسات ميكانيكية على الوسائط النادرة المعزولة.
- فهم محسن لديناميكيات إعادة البرمجة في MEFs.
الاستنتاجات
- تسمح الطريقة بعزل فعال للوسائط النادرة لإعادة البرمجة.
- الرؤى المكتسبة يمكن أن تزيد من كفاءة إنشاء iPSCs.
- تستطيع الدراسات المستقبلية الاستفادة من هذه الوسائط النادرة للحصول على رؤى ميكانيكية أعمق.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Purification of iPS cell intermediates using cell surface markers enables mechanistic de-risking of reprogramming workflows, addressing a key bottleneck in stem cell-based discovery. This approach enhances predictive confidence in early-stage cell fate decisions and supports robust target validation for regenerative medicine and disease modeling portfolios. Isolating rare intermediates allows for precise interrogation of reprogramming dynamics, informing risk-adjusted advancement in cell therapy pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic studies on reprogramming intermediates free from refractory cell populations.
- Supports functional validation of pluripotency-associated markers during cell fate transitions.
- Facilitates pathway clarification by tracking marker expression changes over time.
- Improves predictive confidence in selecting reprogramming factors and conditions.
Screening & Assay Development
- Provides validated cell populations for downstream phenotypic screening and assay development.
- Standardizes isolation of defined intermediates, enhancing reproducibility across experiments.
- Generates quantitative outputs via flow cytometry for robust assay readouts.
- Enables scalable preparation of intermediates for compound evaluation or genetic perturbation studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns reprogramming intermediates with disease-relevant cell states for translational modeling.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic studies on defined cell populations.
- Reduces biological ambiguity in preclinical models by isolating homogeneous cell states.
Pipeline & Workflow Integration
This cell surface marker-based purification method integrates at the interface of early discovery and preclinical research, bridging mechanistic studies with translational applications.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on reprogramming efficiency and marker dynamics.
- Screening: Delivers reproducible, marker-defined cell populations for assay readiness and quantitative analysis.
- Analytics: Provides flow cytometry-based measurements to compare reprogramming stages and conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment of in vitro intermediates with in vivo disease or developmental states.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for isolating rare cell populations across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell reprogramming studies.
- Operational Value: Standardizes cell isolation and improves reproducibility across R&D teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by enabling robust target validation and pathway analysis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of cell-based therapeutic and modeling programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry and cell surface marker selection.
- Demands access to high-quality antibodies and analytical instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of gating strategies and marker panels.
- May require adaptation for different cell types or reprogramming systems.
- Dependent on availability of isogenic, well-characterized starting cell populations.
