توجه الدوبامين العصبية التمايز من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحفيز تمايز الخلايا العصبية الدوبامينية عالية الكفاءة. في المختبر. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير ثقافة التصاق خلية واحدة للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات.

في الخطوة الثانية ، يتم تحويل وسائط زراعة الخلية إلى وسائط تحريض الخلايا العصبية لحث أسلاف صفيحة الأرضية. بعد ذلك ، يتم زراعة الخلايا العصبية الدوبامين في وسط النضج. ثم أخيرا ، يتم زراعة أسلاف الخلايا العصبية الدوبامينية أحادية الخلية على ألواح فيبرونيكتين صفحية بولي L أورنيثين ، ووسائط النضج لمدة 30 يوما.

في النهاية ، يمكن استخدام الفحص المجهري المناعي لتقييم التعبير عن علامات الخلايا العصبية الدوبامينية المهمة. تتمتع هذه التقنية بميزة أكبر على المجال العصبي الموجود في بروتوكول حمض الأعصاب. يمكن أن يولد مجموعة عصبية مزدوجة أكثر تجانسا بكفاءة أعلى.

بعد أربعة أيام من المرور ، استنشق الوسط من مزارع الخلايا. افصل الخلايا بملليلتر واحد من Accutane لكل بئر واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. أثناء الحضانة ، أضف ملليلترا واحدا من الجيلاتين إلى كل بئر من ستة ألواح بستة آبار ، ثم ضع الطبق مع ألواح مطلية بجل ماتري محضرة حديثا في الحاضنة.

عندما تصبح الخلايا شبه عائمة ، قم بتسخينها لأعلى ولأسفل عدة مرات لعمل معلق خلية واحدة. ثم اسحب الخلايا إلى أنبوب سعة 15 مليلتر وقم بطردها لمدة ثلاث دقائق. عند 258 جي ثانية ودرجة حرارة الغرفة ، أعد تعليق الحبيبات في الكمية المناسبة من وسط زراعة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات المكملة بالمصل وأضف هذا الفيفين إلى التركيز النهائي البالغ ملليمولار.

بعد ذلك ، احتضان الخلايا في الصفائح المطلية بالجيلاتين بنسبة واحد إلى واحد عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. لإزالة مغذيات الميثامفيتامين ، قم بنقل الخلايا إلى أنبوب جديد سعة 15 مل. تخفيفها في وسط الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ، مع استكمالها بالمصل ، وعدها بعد تدوير الخلايا مرة أخرى ، وإعادة تعليق الخلايا في وسط واحد MT.SR مع thias Ivan إلى 180،000 خلية لكل تركيز مليلتر.

ثم استنشق matrigel من الألواح المطلية وتوزيع ملليلترين من الخلايا لكل بئر. 48 ساعة. بعد إعادة طلاء الخلايا في ألواح matrigel.

استنشق الوسط من كل بئر واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS. ثم أضف ملليلترين من تمايز KSR ، متوسط مكمل ب SB 4 31 ، 50 42 و L DN 1 9 3 1 8 9 إلى الخلايا التي تغير الوسط كل يوم من D صفر إلى D 20 كما هو موضح في الرسم البياني في اليوم 20 ، استنشق وسط التمايز وافصل الخلايا بمليلتر واحد من 37 درجة مئوية لكل بئر عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. أثناء الحضانة ، يتم تسخين ألواح فيبرونيكتين لامينين في الحاضنة.

ثم بعد Resus ، قم بتعليق الخلايا المنفصلة في معلق خلية واحدة ، وقم بتخفيف الخلايا في الوسط القاعدي العصبي. بعد العد ، قم بتدوير الخلايا وأعد تعليق الحبيبات في B 27 ، وسط التمايز عند 1 مليون خلية لكل تركيز مليلتر. ثم استنشق الفيبرونيكتين من ألواح فيبرونيكتين بوليول أورين لامينين.

اغسلها مرتين باستخدام PBS وانقل 400 ميكرولتر من الخلايا إلى كل منها. حسنا ، قم أخيرا بتغيير الوسط بعد أول 24 ساعة ، ثم كل يومين حتى نقطة النهاية التجريبية لإزالة أي خلايا ميتة غير مرتبطة. كما هو موضح في هذه الصور ، ستتوسع مزارع الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات أحادية الخلية المعاد طلاؤها كمجموعات خلال أول 48 ساعة من التمايز ، لتصل إلى حوالي 70٪ من التقاء.

بعد التمايز ، تحقق الخلايا التقاء كاملا في غضون ثلاثة إلى أربعة أيام. بحلول اليوم 20 ، تلتصق الخلايا المتمايزة وتنمو على شكل كتل صغيرة. خلال الأيام الخمسة التالية ، تظهر محاور عصبية أكثر كثافة وسليمة من الناحية الشكلية داخل الكتل ، وتشكل بعض الروابط بين الكتل.

بعد 11 يوما من التمايز ، يمكن تحويل الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات بكفاءة إلى سلائف صفيحة أرضية. كما هو موضح في هذه الصور ، تعبر جميع الخلايا تقريبا عن سلائف لوحة الأرضية ، وعلامات الخلية التي تعشش فيها والثعلب A اثنين وما فوق. 90٪ من الخلايا تعبر عن Corin O OTX two و LM X واحد A.بعد مزيد من التمايز ، تتخصص الخلايا السلائف لصفيحة الأرضية في الخلايا العصبية الدوبامينية التي تعبر عن TUJ واحد و TH. هذه الخلايا العصبية الدوبامين هي من تسع هوية لأنها تعبر عن GK اثنين وهي سلبية بالنسبة لكالبيندين تظهر تجارب التلوين المناعي أيضا أنه لا توجد خلايا نجمية GFAP وعدد قليل جدا من الخلايا العصبية GABAergic مما يشير إلى أن التمايز خاص حصريا بنسب الخلايا العصبية الدوبامينية.

أثناء اختبار هذا الإجراء ، من المهم الحفاظ على الاتساق في زراعة الخلايا اليومية والتأكد من تحضير الوسط حديثا بالمكونات الصحيحة.